重组鸡白细胞介素2的诱导表达与生物学活性测定

实验三重组蛋白的原核表达、亲和层析及免疫印迹分析一、实验内容1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。

2．对重组蛋白进行亲和层析，得到纯度较高的融合蛋白。

3．对纯化结果进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，并做蛋白质的Western blot鉴定。

二、实验目的和要求1．了解重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达的原理和实验方法。

2．掌握亲和层析基本原理和操作过程。

3．掌握蛋白质的免疫印迹分析。

三、实验操作步骤1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。

①将在甘油保存的重组蛋白的表达菌株BL21（pET-IL-2）、BL21（pQE-IL-2）、BL21（pET43.1a）、Origami（pGEX-ES1）、Origami（pGEX-ES2）、Origami（pGEX-4T-1）取少量分别接种于10ml LA（LB+100mg/L的氨苄青霉素）培养基中，37℃下过夜培养。

②以1：100转接至100mL LA液体培养基中培养至OD 0.5-0.6。

加入0.5mM的IPTG诱导表达，诱导表达温度为18℃，诱导时间为9小时。

③将诱导表达的菌液于10000 rpm离心5 min，收集菌体，-20℃保存。

④将菌体细胞重悬于5mL缓冲液buffer I（20 mmoL/L Tris-HCL pH 8.0，150mmoL/L NaCl）（表达菌株BL21（pET-IL-2）、BL21（pQE-IL-2）、BL21（pET43.1a））或PBS（Origami（pGEX-ES1）、Origami（pGEX-ES2）、Origami（pGEX-4T-1））中。

⑤取0.5ml悬浮液，冰浴条件下进行超声波破菌，4℃下12000 rpm离心20 min。

分别取上清和沉淀，作SDS-PAGE检测，估计可溶性表达比例。

⑥将以上④得到的重悬液在冰浴中进行超声波破菌，4℃下12000 rpm离心20 min，其上清即为蛋白粗提液（BL21（pET-IL-2）、BL21（pET43.1a）、Origami（pGEX-ES1）、Origami（pGEX-ES2）、Origami（pGEX-4T-1））或沉淀（BL21（pQE-IL-2））。

重组人白细胞介素—2制备工艺的研究白细胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）是一种由T细胞分泌的免疫调节因子，对细胞免疫和体液免疫调控起着重要作用。

由于其广泛的生物活性和临床应用价值，人白细胞介素-2的制备工艺研究一直备受关注。

人白细胞介素-2可以通过多种方法进行制备，其中最常用的方法是采用重组DNA技术。

该方法首先需要在合适的表达载体中克隆人白细胞介素-2的基因，将其转染至适当的宿主细胞中，通过大规模培养和纯化过程得到目标产物。

重组人白细胞介素-2的制备工艺主要包括以下几个步骤：1.基因克隆：将人白细胞介素-2基因放入适合的表达载体中。

载体通常是质粒，具有能够稳定细胞内基因组的特性。

该载体还包含了启动子、终止子等序列，以调控基因的表达。

2.转染：将已构建好的表达载体转染至宿主细胞中。

常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞等。

3.培养：经过转染的宿主细胞在适当的培养条件下进行大规模培养。

培养基中会加入适当的抗生素，以筛选出含有重组基因的细胞群。

4.表达：通过培养过程中的细胞生长和代谢活性，使重组基因在细胞内被转录和翻译成蛋白质。

这样，大量的重组人白细胞介素-2就会被产生出来。

5.纯化：将培养基中的细胞分离出来，通过离心、滤过等操作得到细胞上清液。

然后利用离子交换、凝胶过滤、亲和层析等方法进行层析纯化，去除杂质，得到纯净的重组人白细胞介素-2。

重组人白细胞介素-2的制备工艺需要考虑多个因素。

首先，合适的宿主细胞选择对产量和纯度影响很大。

常用的宿主细胞是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞，每种细胞系统有其优势和限制。

其次，可以通过优化培养条件来提高人白细胞介素-2的表达水平，如调节培养基成分、温度和pH等。

此外，纯化过程的选择和优化也是影响产品质量的重要因素。

目前，人白细胞介素-2的制备工艺已经相对成熟，并且在临床上得到了广泛的应用。

重组人白细胞介素-2的制备工艺研究不断进步，将为更好地利用白细胞介素-2的免疫调节作用，提供更好的疾病治疗手段和提高临床疗效。

白细胞介素（IL-2）检测及临床意义
一、概述
白细胞介素-2 (IL-2)又称T细胞生长因子。

主要由T细胞产生。

是在淋巴细胞增殖分化过程中重要的细胞生长因子，生理作用有刺激T细胞生长、诱导细胞毒作用和对B细胞的生长及分化均有一定的促进作用等
二、检测方法
IL-2主要检测方法为生物素亲合素系统的双抗体夹心ELISA 法。

三、临床意义
1、IL-2可提高人体对病毒、细菌、真菌和原虫等感染的免疫应答，促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、自然杀伤细胞(NK 细胞)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK 细胞)和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)增殖，并使其杀伤活性增强，进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。

2、IL-2 还可以增加抗体和干扰素 (IFN)等细胞因子的分泌，在机体免疫应答中具有非常重要的作用，是一种免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤和提高机体免疫功能等作用。

3、IL-2的表达异常与临床多种疾病有密切关系，尽管外周血、尿液中IL-2 水平，或激活淋巴细胞上清液中IL-2水平的异常没有疾病特异性，但是可作为相关疾病的辅助诊断、预后及疗效观察提供可靠数据。

4、IL-2升高：肿瘤、心血管病、肝病等疾病时均可使 IL-2 水平升高，在器官移植后早期排斥反应时也出现IL-2表达升高。

5、IL-2降低：在多种原发性免疫缺陷病和继发性免疫缺陷病时均可伴有 IL-2 水平降低，如 SLE、麻风和艾滋病等。

重组人IL-2大肠杆菌工程菌质粒稳定性的研究摘要基因工程菌中质粒稳定性对于基因工程菌的发酵有着重要影响，但基因工程菌在传代中经常出现质粒不稳定遗传的现象。

本试验通过在工程菌的培养过程中添加抗生素这一选择压力和诱导表达目的蛋白的方式来提高基因工程菌的稳定性，并通过双酶切电泳分析及高效率的诱导表达外源蛋白来进行检测，得出工程菌在LB（-）和LB（+）平板上都能生长且形态相似；电泳图平行、酶切片段的位置大致一致；诱导表达的外源基因的质粒稳定。

提高质粒稳定性有利于外源蛋白表达，以满足大规模生产发酵。

关键词：基因工程菌；质粒；稳定性-I-Study on the stability of plasmid of recombinanthuman IL-2 E.coli bacteriaAbstractEscherichia coli. plasmid stability for the genetic engineering of bacteria fermentation has important implications genetically engineered bacteria in the mid-recurring genetic instability of the plasmid. This experiment in engineering from the training course to add the option of antibiotic pressure and protein expression induced by way of reference high genetically engineered bacteria stability and digested by electrophoresis and high efficiency induced expression of foreign proteins to detect, the virus can grow in the panel of LB(-) and LB(+), and the morphology is similar; The electrophoregram is parallel, and the position of the fragment is consistenct roughly; Inducible expression of foreign genes is stabile. We improve the stabilization of the foreign gene in order to meet the large-scale fermentation.Key words: Genetic engineering ; plasmid ; stability-II-目录摘要 (I)ABSTRACT ............................................................................................................................... I I 前言. (1)1 材料与方法 (3)1.1试验材料 (3)1.1.1 菌种质粒 (3)1.1.2 培养基 (3)1.1.3 常用药品 (3)1.1.4试验仪器 (3)1.2试验方法 (3)1.2.1 基因工程菌的转化 (3)1.2.2 制平板 (3)1.2.3 连续传代 (3)1.2.4 鉴定 (4)2 结果与分析 (6)2.1不同代菌的传代结果 (6)2.2上述不同代质粒的电泳图 (8)2.3不同代质粒的酶切图 (9)2.4诱导表达不同代的基因工程菌的外源基因蛋白电泳图 (10)3 讨论 (11)3.1分析本试验所出现的问题 (11)3.2质粒稳定性影响的若干因素 (12)3.2.1 含调控型启动子的基因工程菌稳定性控制 (12)3.2.2 选择性培养基提高质粒稳定性 (12)3.2.3 培养操作方式对工程菌稳定性的影响 (12)3.2.4 培养条件对工程菌稳定性的影响 (12)4 结论 (14)参考文献 (15)致谢 (17)-III-前言随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展，运用重组表达技术来生产预防和治疗疾病的制品已成为近几年研究的热点。

鸡白细胞介素2（IL-2）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定鸡血清，血浆及相关液体样本中白细胞介素2（IL-2）的含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鸡白细胞介素-2（IL-2））水平。

用纯化的鸡白细胞介素-2（IL-2）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入鸡白细胞介素-2（IL-2），再与HRP标记的IL-2抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的鸡白细胞介素-2（IL-2）呈正相关。

用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中鸡白细胞介素-2（IL-2）浓度。

试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。

通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。

加入一定量的PBS，PH7.4。

用液氮迅速冷冻保存备用。

白细胞介素-2的研究进展细胞因子是由多种细胞分泌的小分子蛋白的总称，具有调节细胞生长、免疫应答和参与炎症反应等多种生物学功能，而白细胞介素-2（IL-2）即是其中一种。

1976年Morgan等在小鼠脾细胞上清液中首次发现有一种能促进和维持T细胞体外生长的因子，并称其为T细胞生长因子（TCGF）,1979年被正式命名为IL-2.随后有关IL-2的应用研究取得了突飞猛进的发展。

1.白细胞介素-2及其受体1.1白细胞介素-2结构天然hIL-2在体内主要由活化的I型辅助淋巴细胞(THl细胞)分泌，除此之外，B细胞、NK细胞及单核－巨噬细胞亦能产生IL-2。

IL-2为分子量约为15.5kDa的糖蛋白，pI在6.6~8.2。

成熟的IL-2分子由153个氨基酸肽链N端剪掉20个氨基酸残基的信号肽后剩下的133个氨基酸残基组成，它与其它的细胞因子在序列上无同源性。

翻译后加工的过程还包括第三位Thr位点的糖基化和二硫键的形成。

蛋白链中有三个半胱氨酸残基(Cys)，位于第58、105和125位。

58位和105位半胱氨酸残基结合形成二硫键，使肽链折叠，125位半胱氨酸残基游离。

研究者发现将125位游离的半胱氨酸残基突变为丝氨酸或丙氨酸时，仍具有生物活性，且不会与第58位半胱氨酸残基形成错误二硫键，增加了IL-2的稳定性，同时也消除了由第125半胱氨酸残基造成的二聚体，但是这样新型IL-2容易产生抗体，这是一大不足之处。

IL-2肽链折叠后才呈现活性，直链是无活性的，正确的二硫键对于IL-2活性的保持是必需的，但糖基化却与活性无关。

IL-2的二级结构有4个α螺旋区和一对β反平行折叠，各螺旋相互折叠使IL形成球状蛋白分子。

磁共振 (NMR)确定IL-2的四个α螺旋，分别为A、1l-29．B、53-73，C、81-97，D、116-131。

对IL-2的α螺旋结构研究结果说明α螺旋的破坏对其生物活性必定有影响。

另外，IL-2与其受体结合需要酸性基团(Asp)，而较长的疏水侧链基团则妨碍这种结合，使其活性降低，甚至完全丧失。

白细胞介素-2（IL-2）的应用研究加州大学圣克鲁斯分校化学和生物化学助理教授Nikolaos Sgourakis说：“在不同情况下，IL-2可以起到促进或是抑制免疫反应的作用。

我们利用了详细的生物物理方法来研究它是如何做到的。

”在免疫应答中，IL-2作为生长因子刺激T细胞扩增。

不同类型的T细胞扮演着不同的角色，IL-2既可以刺激效应T细胞，也可以刺激调节性T细胞，后者可以在威胁消失后控制免疫系统。

白细胞介素2 (IL-2)是15 kDa的糖蛋白，在人类中，由位于4号染色体q26–28 区域的单基因编码。

它是免疫系统中的一类信号分子，调控对具有免疫功能的白血球(白细胞，通常是淋巴细胞)的活性。

IL-2 是机体对微生物感染的天然应答，区别外来和自身抗原。

（图源：百度百科）重组IL-2蛋白，货号：PRP100274；IL-2抗体，货号：ABP51612；白介素-2 ELISA定量试剂盒，货号：KET7006；IL-2试剂盒，货号：KET9002IL-2应用研究由于IL-2能诱导和增强细胞毒活性，应用IL-2治疗某些疾病、特别是对肿瘤治疗的研究得到了广泛开展，单独使用IL-2或与LAK细胞等（详见链接第四章）联合使用治疗肿瘤取得了一定的疗效；还可望用于病毒感染、免疫缺陷病及自身免疫病的治疗。

但IL-2的副作用也日益引起人们的注意：IL-2可引起发热、呕吐等一般症状，还可导致水盐代谢紊乱和肾、肝、心、肺等功能异常；最常见、最严重的是毛细血管渗漏综合征，使患者不得不中止治疗。

IL-2的副作用常与IL-2的剂量及用药时间呈相关，停止用药后症状多迅速减轻或消失。

IL-2引起副作用的机制是多方面的，但主要是间接性的，即IL-2诱导产生的某些因子或杀伤性细胞起着重要作用；现已知LAK细胞可通过溶解血管内组织而导致多种副作用。

给予适当药物（如吲哚美辛、哌替啶、对乙酰基氨酚等）、采取联合用药、改进给药方式（如少量多次短时间输注）和给药途径（如改全身用药为肿瘤局部用药）等将有效地减轻不良反应。

农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(1):5~10*基金项目：山东农业大学博士科研基金项目(No.23201)、“十一五”国家科技支撑计划重大项目(No.20061122)和山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(No.2006BS06015)资助。

**通讯作者。

Author for correspondence.教授，博士,主要从事畜禽传染病学和细胞因子的研究。

E-mail:<hkzhao@>.收稿日期：2006-01-11接受日期：2006-03-30·研究论文·鸡白细胞介素-18(ChIL-18)重组蛋白的生物学活性检测*李宏梅1,胡敬东1,马凤龙2,郑玉姝1,刘翠艳1,田兆菊1,赵宏坤1**(1.山东农业大学动物科技学院，泰安271018；2.山东信得药业,青岛266061)摘要：对含有鸡白细胞介素-18()基因的质粒在大肠杆菌()内进行诱导表达，经亲和层析法对表达产物进行纯化，用微量细胞病变抑制法CEF-VSV 系统，检测其对SPF 鸡脾淋巴细胞诱导产生γ-干扰素(IFN-γ)的活性和其对病毒的抑制效果；用3H-TdR 掺入法和MTT 法分别检测其对T 淋巴细胞诱导转化和NK 细胞杀伤活性的作用。

结果表明，经诱导表达出分子量44kD 的目的蛋白(与GST 融合表达)，纯化后得到去除菌体蛋白的高纯度目的蛋白；该蛋白能够诱导脾细胞产生IFN-γ，当浓度为250ng/mL 时诱导IFN-γ的活性最高，可达1×106U/mL ；但该蛋白不能直接抑制水疱性口炎病毒(VSV)在鸡胚成纤维细胞(CEF)上生长；能够刺激淋巴细胞显著增殖，浓度为250ng/mL 时效果最佳；适当浓度的rChIL-18蛋白能促进NK 细胞的杀伤活性，浓度为150ng/mL 时，作用最强。

利用原核表达的重组鸡白细胞介素-18蛋白与天然鸡IL-18蛋白一样具有较广泛的生物学活性。

重组人白细胞介素-2的原核可溶表达李冠英;李海红;徐士勋;潘晓雨【摘要】为探索白细胞介素-2在大肠杆菌中的可溶表达及其生物学活性,利用载体pMAL-c5x将 rhIL-2与MBP融合,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导MBP-rhIL2的表达.接着用Amylose树脂将MBP-rhIL2纯化,最后利用Factor Xa蛋白酶将rhIL-2从融合蛋白中释放.结果显示:MBP-rhIL2以可溶形式表达;Factor Xa成功将rhIL-2从融合蛋白中释放出来;经生物学活性测定,其比活性为4.4×106IU/mg.%This work aims to explore the soluble expression and biological activity of interleukin-2; recombinant fusion protein MBP-rhIL2 was successfully expressed into soluble form in E.coli BL21(DE3). The purification of MBP-rhIL2 was conducted through amy-lose resin. The rhIL-2 was efficiently released by the cleavage of protease Factor Xa from the fusion protein. Bioactivity analysis showed the biological activity of purified rhIL-2 is 4.4 ×106IU/mg.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2018(035)001【总页数】4页(P107-110)【关键词】白细胞介素-2;可溶表达;蛋白纯化【作者】李冠英;李海红;徐士勋;潘晓雨【作者单位】上海华新生物高技术有限公司,上海201206;上海华新生物高技术有限公司,上海201206;上海华新生物高技术有限公司,上海201206;上海华新生物高技术有限公司,上海201206【正文语种】中文【中图分类】Q78;Q591.2;R392.1白细胞介素-2(Interleukine-2，IL-2)，是由白细胞分泌的一种糖蛋白，可介导细胞间的相互作用，在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用[1]。

白细胞介素的制备及鉴定白细胞介素（IL）是指由白细胞或其他体细胞产生的能在白细胞间起调节和介导作用的因子。

作为在免疫活性细胞间相互作用的介质和强有力的蛋白性调节因子，可以调节免疫反应、炎性反应、组织修复、组织移植反应和造血。

白细胞介素已发现有多种，本实验以白细胞介素-2（IL-2）为例介绍IL的制备及鉴定方法。

一、目的要求了解白细胞介素的概念、种类及其作用；掌握常用白细胞介素的制备及鉴定方法。

二、实验原理人或动物的脾细胞、淋巴细胞，在丝裂原刺激下诱生的天然白介素-2，主要存在于细胞的上清中。

此为粗制天然白介素-2，然后通过硫酸铵沉淀、吸附等步骤进行纯化，并根据相关性质进行鉴定。

三、实验材料RPMI1640培养基，丝裂原PHA，硫酸铵，吸附剂G2，细胞培养皿，细胞培养箱，离心机，清洁级小鼠。

四、实验方法摘取小鼠的脾、四肢淋巴结、肠系膜淋巴结等组织，制成单个细胞悬液，用RPMI1640配成1.5×106个/ml细胞浓度，在PHA刺激下，37℃，5％CO2培养48h后离心取上清，用CTL细胞系检测其生物活性，即是粗制的天然白介素-2.纯化步骤：在500ml收集的上清中缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌，使其饱和度达45％，4℃搅拌过夜，9000r/m离心30min去沉淀。

上清再加硫酸铵使其饱和度达80％，4℃搅拌过夜，9000r/m离心30min，取沉淀用PBS溶解，透析后用吸附剂G2 （30mg/ml）37℃搅拌吸附30min，离心、洗脱即得纯化的IL-2。

五、结果判定（1）将获得的IL-2用Folin酚法测定蛋白含量。

（2）活性检定：采用CTL细胞株的渗入法进行活性鉴定，比活性必须在1×106U/mg 以上。

（3）纯度鉴定：用SDS-PAGE检测，银染法染色，在15ku出呈单一条带，然后经扫描得白介素-2条带，占95％以上。