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《生物技术专业大实验》课程课程编号：0741524966实验指导书主撰人韩军丽王雪青金玉莲赵培审核人王素英天津商业大学生物技术与食品科学学院二零零九年十一月前言1．实验总体目标使学生掌握基因工程、分子生物学、细胞生物学及细胞工程实验技术，提高学生实验动手能力、以及在实验中分析问题和解决问题的能力，为今后从事生物技术相关工作和研究打下坚实的基础。
⒉适用专业年级生物技术专业第6学期⒊先修课程生物化学、微生物学、遗传学、细胞与分子生物学、基因工程、细胞工程⒋实验课时分配⒌实验环境生物技术专业实验室⒍实验总体要求进入实验室，必须穿实验服。
保持实验台的整洁，自己的物品需放置在指定位置，贵重物品随身携带。
⒎本实验的重点、难点及教学方法建议本专业大实验主要包括基因克隆、克隆的鉴定、细胞生物学基本实验以及细胞工程基本实验技术。
目录实验一目的基因的PCR扩增……………………………实验二DNA片段的回收…………………………实验三DNA的连接……………………………实验四大肠杆菌感受态细胞的制备……………………………实验五重组DNA的转化……………………………实验六快速分离大肠杆菌中的重组质粒……………………………实验七重组质粒的酶切鉴定……………………………实验八外源基因诱导表达及蛋白质检测……………………………实验九细胞凝集反应……………………………实验十细胞膜的渗透性……………………………实验十一细胞工程基础实验技术……………………………实验十二无菌操作及愈伤组织诱导技术……………………………实验十三微藻规模化培养……………………………实验一目的基因的PCR扩增一、实验目的目的基因的分离技术是基因工程的三大核心技术之一。
应用PCR技术分离目的基因是常用的方法之一。
通过本实验的学习，要求学生掌握PCR技术的基本原理；掌握用PCR技术扩增目的基因的方法。
二、实验内容设计特异引物，以含有目的基因的质粒DNA为模板，用PCR方法扩增目的基因。
生物科学实验操作作业指导书实验一：制备酵母发酵剂材料：- 酵母粉- 白砂糖- 温水- 塑料瓶- 漏斗- 纸巾- 酒精灯或电炉操作步骤：1. 将塑料瓶清洗干净，并用热水消毒。
将塑料瓶沿纵向切割一条长约10厘米的缝隙，并对折将其打开，使其成为一个小漏斗。
2. 取适量的酵母粉，倒入一个干净的容器中。
3. 加入适量的白砂糖，在酵母粉上撒上一层糖。
4. 将温水倒入塑料瓶中，闭上盖子，摇晃均匀，将盖子重新打开，等待一段时间，观察是否有气泡产生。
5. 若有气泡产生，说明酵母发酵剂制备成功，将其过滤至另一个干净的容器中。
6. 将制备好的酵母发酵剂保存在冰箱中以延长其储存寿命。
实验二：观察酵母的呼吸作用材料：- 酵母发酵剂- 糖水溶液- 试管- 橡皮塞- 数字温度计操作步骤：1. 准备多个试管，并在每个试管中分别加入适量的糖水溶液。
2. 在其中一个试管中添加适量的酵母发酵剂，用橡皮塞封闭试管口。
3. 在剩余的试管中分别分别加入热水、冷水和常温水，作为对照组。
4. 使用数字温度计分别测量各试管中液体的温度，并记录下来。
5. 观察每个试管中是否产生气泡，并记录下观察结果。
6. 根据观察结果，分析酵母在不同温度下的呼吸作用是否受到影响。
实验三：观察叶绿素的光合作用材料：- 鲜绿色植物叶片- 高锰酸钾溶液- 试管- 温水- 酒精灯或电炉- 针筒操作步骤：1. 准备多个试管，并在每个试管中加入适量的高锰酸钾溶液。
2. 从不同植物中采集新鲜的绿色叶片，并将其放入试管中。
3. 使用针筒将试管中的气体抽出，以创建真空条件。
4. 将部分试管放在光照区域，部分试管放在遮光区域，作为对照组。
5. 观察每个试管中的颜色变化，并记录下观察结果。
6. 根据观察结果，分析叶绿素在光照条件下是否参与光合作用。
实验四：观察细菌的生长条件材料：- 琼脂培养基- 干净的培养皿- 细菌培养液- 干净的棉签- 酒精灯或电炉操作步骤：1. 将琼脂培养基倒入干净的培养皿中，使其均匀分布，并让其凝固。
生物技术大实验操作指南注意事项1、工作服穿戴，禁止吃东西和大声喧哗和串门聊天。
2、用电、气安全注意事项。
3、节约用水，安全用水，有毒、害废水的正确处理。
4、实验室、台卫生，最后离开实验室的同学检查水电门窗。
5、实验报告，正确记录原始数据，分析结果得出合理的结论。
实验一鸡输卵管总RNA提取（溶菌酶基因的提取）一、原理：组织细胞在冰浴中剪碎（最好有液氮），加Trizol快速匀浆碾磨，加一定体积的氯仿振荡，离心，取水相，加等体积的异戊醇（或无水乙醇）沉淀，75%乙醇洗涤，晾干，无RNase的ddH2O溶解。
二、试剂与设备：TotalRNAExtractor（Trizol）或RNAsimple Total RNA Kit，氯仿，异戊醇，无水乙醇，ddH2O Free RNase。
研钵，玻璃匀浆器，16000转低温冷冻离心机。
三、步骤：1、新鲜鸡输卵管膨大部，50mg，预冷的研钵中剪碎，加1ml Trizol冰浴中匀浆，RT 5-10 Min。
2、加200ul 氯仿，振荡15 Sec，RT 3 Min。
3、4℃ 12000rpm，离心10Min，吸取上层水相，转入新的离心管。
4、加500ul 异戊醇柔和混匀，RT沉淀30Min,离心同上，留取沉淀。
5、加1ml 75%乙醇洗涤沉淀2次，勿剧烈振荡，离心同上，收取沉淀，RT晾干3-5Min。
6、50ul ddH2O Free RNase 溶解沉淀。
7、检测RNA纯度与浓度。
四、结果五、讨论实验二溶菌酶基因第一链cDNA合成一、原理：mRNA经M-MuLV催化，以Oligo dT为引物，将mRNA反转录合成cDNA，此cDNA为单链。
二、试剂与设备：M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒，恒温水浴锅，掌上离心机。
三、步骤：1．在冰浴的试管中加入如下反应混合物：总RNA 或Poly(A)+ RNA或特异性RNA XμgOligo dT (0.5μg/μL) (20 pmol) 1μLRNase free ddH2O 定容至12μL2. 轻轻混匀后离心3~5 s，反应混合物在65℃温浴5 min后，冰浴30 s，然后离心3~5 s。
生物技术的实验操作指南与注意事项引言：生物技术是一个综合性较强的学科领域，涉及到许多实验操作和技术要点。
本文旨在为从事生物技术实验的研究人员提供一份实验操作指南，包括实验前的准备工作、实验过程中的操作技巧以及实验注意事项。
希望本指南能够帮助读者避免实验中的常见问题，提高实验效率和数据可靠性。
实验前的准备工作：1. 实验设计：在进行实验之前，需要明确实验的目的、假设和所需材料。
合理的实验设计能够提高实验的可靠性和重复性。
2. 材料准备：根据实验设计，准备好所需的试剂、培养基和实验仪器，确保其质量和功能正常。
3. 操作规程：熟悉实验操作步骤，并制定操作规程，确保实验能够顺利进行。
4. 实验环境准备：确保实验室环境干净整洁，符合生物安全要求。
根据需要进行无菌操作和消毒处理。
实验操作技巧：1. 无菌操作：在进行细胞培养或分子生物学实验时，必须进行无菌操作，防止外源性污染。
需注意使用灭菌器消毒实验器皿和培养基，佩戴口罩和手套，保持操作区域的无菌状态。
2. 实验仪器的正确使用：使用各种实验仪器之前，应仔细阅读和遵循操作手册。
合理设置仪器参数，降低误差的产生。
定时检查和保养实验仪器，延长使用寿命，并确保实验结果的准确性。
3. 校准和质控：在实验过程中应定期使用标准物质进行校准，确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，进行内部和外部质量控制，及时发现和排除实验中的问题。
4. 数据记录与存储：在实验过程中，及时、准确地记录实验数据，并备份存储数据，以防数据丢失或损坏。
数据应按照规定格式整理，方便后续的分析和报告撰写。
实验注意事项：1. 安全第一：在实验操作中，必须遵循实验室的安全操作规程，佩戴实验室必备的安全装备，如实验手套、安全镜等。
避免直接接触有毒或有害物质，注意化学品和生物制剂的防护处理。
2. 避免污染：实验操作过程中，需要注意避免实验物料的交叉污染。
使用无菌技术操作时，需注意锅炉、培养箱、培养皿等容器的无菌处理。
生物实验指导技巧导言生物实验是生物学教学中不可或缺的一环。
通过实际操作，学生可以加深对生物知识的理解和应用。
然而，必须要注意实验操作的准确性和安全性。
本文将为您介绍一些生物实验指导的技巧，以帮助您进行高效、安全和成功的生物实验。
一、实验前准备在进行生物实验之前，必须做好充分的准备工作。
首先，仔细阅读实验手册或实验指导书，了解实验的目的、步骤、材料和所需设备。
其次，检查实验室设备的完好与否，确保仪器和仪表的正常工作。
同时，确认您已经了解了实验中可能出现的危险因素，并做好相应的安全措施。
二、实验步骤1. 清洗实验器材在进行实验之前，务必清洗所使用的试管、烧杯、移液器等器材。
使用去离子水和一些清洁剂进行彻底清洗。
确保所有试管和烧杯都没有残留物，以避免影响实验结果。
2. 准确测量实验中，准确的测量是至关重要的。
使用合适的测量仪器，如容量瓶、量筒和热量计等，确保测量结果的准确性。
在进行测量之前，要注意仪器的校准和调整，并遵循精确的测量方法。
3. 严格控制实验条件在实验过程中，必须严格控制实验条件，以确保实验结果的可靠性。
注意控制温度、湿度和光照等因素，同时遵循实验指导书中的实验条件要求。
4. 小心处理实验材料在处理实验材料时，要小心谨慎。
遵循实验步骤和安全操作规范，避免产生任何事故或伤害。
在使用刀具、酸碱溶液和有毒化学品时要戴手套和护目镜，确保安全操作。
三、数据记录与分析在实验过程中，要及时、准确地记录实验数据。
使用合适的记录表格或软件，将实验数据进行整理和保存。
在数据分析过程中，可以使用科学统计方法来揭示数据之间的关系和趋势。
四、实验报告完成实验后，要撰写实验报告。
在报告中，要包含实验的目的、步骤、数据分析以及结论等内容。
同时，还可以在报告中提出一些改进建议和进一步探究的问题，以促进学生的思考和学习。
结论生物实验是生物学教学中不可或缺的一部分，它可以帮助学生更好地理解和应用所学的知识。
在进行生物实验时，必须要注意实验操作的准确性和安全性。
生物技术大实验实验指导——原生质体的制备、再生一、实验名称：原生质体的制备、再生二、实验目的：通过本实验掌握丝状真菌原生质体制备和再生的技术和原理，并能将该技术应用于育种和遗传研究。
三、实验原理：微生物的细胞或菌丝在细胞壁被脱去或降解后所形成的圆球体，称为原生质体。
真菌细胞壁的主要成分为己糖或氨基己糖构成的多糖链，如几丁质、脱乙酰几丁质、纤维素、葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等。
此外，还有蛋白质、类脂、无机盐等。
所有真菌的细胞壁都具有无定形的和纤维状的组分。
纤维状的组分包括几丁质和纤维素，都是由多聚物形成的微纤丝。
无定形的组分包括蛋白质、甘露聚糖和β-(1,3)、和β-(1,6)、α-(1,3)葡聚糖，常混杂在纤维网中，但大多数真菌，包括子囊菌、担子菌、半知菌类和低等壶菌的细胞壁由几丁质（β-1,4-N-乙酰氨基葡糖为单元的无支链多聚体组成）。
细胞壁的成分随真菌类群的不同而变化，并且每种菌体的细胞壁在其生活周期的过程中也存在差异。
最早的脱壁方法是用机械的方法剥离细胞壁来制备植物细胞的原生质体。
1960年前后开始有大量关于用酶法制备植物和微生物原生质体的报道。
此后虽然也有人尝试过用物理方法（如研磨和超声波等）制备原生质体，但远不如酶法普遍。
酶法制备原生质体最关键的是根据不同物种的细胞壁的结构及其化学组成选用具有不同酶活性的脱壁酶。
真菌原生质体以广泛地应用于原生质体融合育种，质粒、线粒体等外源DNA 的原生质体转化，细胞壁的重建以及生理生化研究等方面。
因而，无论在理论上还是在应用上，原生质体的研究均引起了人们的浓厚兴趣。
近几年来，真菌原生质体的研究对象已从实验室模式种逐渐转向具有工业价值的生产种，以期获得更好的经济效益。
四、材料1、菌种：蛹虫草拟青霉。
2、培养基：（1）菌丝生长培养基PDA培养基：马铃薯20 g（去皮切片煮沸30 min，过滤去渣）；葡萄糖2g；琼脂1.5g；蒸馏水100 ml；自然pH。
生物技术实验操作作业指导书一．实验目的本实验旨在通过生物技术实验操作，让学生掌握基本的实验操作技能，了解生物技术的相关知识。
二．实验原理生物技术是利用生物体的细胞、组织或分子进行研究和应用的技术，包括基因工程、细胞工程、蛋白工程等。
本实验涉及到的操作包括细胞培养、DNA提取与测定、酶切反应、聚合酶链式反应等。
三．实验材料及设备1. 细菌培养基、平板、试管、移液器等2. 冰醋酸、洗涤缓冲液、适量溶解液等试剂3. DNA提取试剂盒、DNA测定试剂盒、酶切试剂盒、聚合酶链式反应试剂盒等4. 恒温水浴、离心机、PCR仪等实验设备四．实验步骤1. 细菌培养a. 将细菌接种入含有细菌培养基的试管中。
b. 在恒温条件下（37℃）静置培养一定时间。
2. DNA提取与测定a. 将培养基中的细菌进行离心，收集沉淀物。
b. 使用DNA提取试剂盒提取细菌DNA。
c. 用DNA测定试剂盒测定DNA的浓度和纯度。
3. 酶切反应a. 准备酶切反应体系，包括DNA片段、酶切缓冲液、酶等。
b. 在适当的条件下，进行酶切反应。
c. 通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。
4. 聚合酶链式反应（PCR）a. 准备PCR体系，包括DNA模板、引物、聚合酶、dNTP等。
b. 设置PCR反应程序，进行聚合酶链式反应。
c. 通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
五．实验结果分析1. 细菌培养：观察培养基中是否出现菌落，菌落的形态、颜色等。
2. DNA提取与测定：测定DNA的浓度和纯度，计算DNA的产量。
3. 酶切反应：根据琼脂糖凝胶电泳结果分析酶切产物的大小和数量。
4. PCR反应：通过琼脂糖凝胶电泳结果判断PCR是否成功，分析PCR产物的大小和数量。
六．实验注意事项1. 操作前需穿戴实验服、手套等个人防护用具。
2. 严格按照实验步骤进行，注意操作的顺序和方法。
3. 严格控制实验条件，如温度、时间等。
4. 注意实验设备的清洁和消毒，以防交叉污染。
5. 对于有毒试剂需注意安全操作，避免接触或吸入。
初中教育中的生物科学实验指导引言：生物科学实验是初中生物教育中不可或缺的一部分，通过实践探究，学生能够亲自参与到科学研究中，培养科学思维和实验技能。
本文将为初中生物科学实验提供一些引人入胜且内容丰富的指导，旨在帮助学生更好地理解生物科学原理和培养科学精神。
实验一：观察植物细胞结构实验目的：通过显微镜观察植物细胞的结构，并了解细胞的基本组成。
实验步骤：1. 取一片新鲜的洋葱表皮，用镊子将其剥离下来。
2. 将洋葱表皮放入盐水中浸泡5分钟，使其软化。
3. 用镊子将洋葱表皮放入玻璃片上，用刀片将其切成薄片。
4. 在玻璃片上加一滴碘液，用盖片盖住，然后放入显微镜下观察。
实验二：观察动物细胞结构实验目的：通过显微镜观察动物细胞的结构，并了解细胞的基本组成。
实验步骤：1. 取一片新鲜的洋葱表皮，用镊子将其剥离下来。
2. 将洋葱表皮放入盐水中浸泡5分钟，使其软化。
3. 用镊子将洋葱表皮放入玻璃片上，用刀片将其切成薄片。
4. 在玻璃片上加一滴碘液，用盖片盖住，然后放入显微镜下观察。
实验三：观察细胞分裂实验目的：通过显微镜观察细胞分裂的过程，并了解细胞分裂的重要性。
实验步骤：1. 取一片洋葱的根尖组织，用镊子将其剥离下来。
2. 将根尖组织放入盐水中浸泡5分钟，使其软化。
3. 用镊子将根尖组织放入玻璃片上，用刀片将其切成薄片。
4. 在玻璃片上加一滴碘液，用盖片盖住，然后放入显微镜下观察。
实验四：观察植物光合作用实验目的：通过实验了解植物进行光合作用的过程和原理。
实验步骤：1. 取一片新鲜的水蕨叶片，用镊子将其剥离下来。
2. 将水蕨叶片放入含有酒精的试管中，用烧杯加热，使其脱色。
3. 将脱色后的水蕨叶片放入含有碳酸氢钠的试管中，用烧杯加热，使其变黄。
4. 将变黄的水蕨叶片放入含有碘液的试管中，观察颜色变化。
实验五：观察动物呼吸作用实验目的：通过实验了解动物进行呼吸作用的过程和原理。
实验步骤：1. 取一只小白鼠，将其放入密封的玻璃管中。
《生物技术大实验》实验指导书前言《生物技术大实验》是为生物技术专业本科高年级学生开设的综合实验课程，是在普通生物学实验、生物化学实验、微生物实验、细胞生物学和遗传学实验的基础上的综合实验课程。
该实验课程偏重于分子生物学实验教学，通过此实验课程，学生不仅学习到最基本的分子生物学技术，而且学习到前沿的生物技术。
分子生物学实验技术突飞猛进，日新月异。
分子生物学技术的广泛应用，在20世纪下半叶对生命科学的进步产生了举世公认的巨大推动作用，而且对人们的生活和整个社会的发展亦产生了巨大的冲击和影响。
分子生物学技术已广泛渗透和应用到生物学、遗传学、细胞学、微生物学、进化学、肿瘤学、免疫学、药理学、发育学、病毒学、神经生物学、生药学、法医学等与基础医学和临床医学有关的研究领域。
21世纪将更是分子生物学技术快速发展的时期，由此引起的生物技术革命并将更加深刻地影响社会的发展。
学生基本技能和动手能力的培养都离不开实验室，离不开实验课上的训练，很多理论上的原理都需要到实验课上去验证，很多理论上的知识都需要到实验课上去实践。
而实验课教材或实验指导书是开好实验课的基本条件之一。
虽然目前的分子生物学实验教材版本众多，但针对本科生的生物技术大实验教材尚无出版。
为了加强本学科的教材建设，促进本学科实验课的开设，我们参考了国外最新的有关分子生物学实验技术的专著，根据我校学生的特点及我们自己现有的基础和条件，特选择了部分实验容，并结合我们的经验与体会，汇编成了生物技术大实验实验指导书，以供参考。
在使用过程中，可根据不同的层次适当增减。
同时，对于新近产生和应用前景广阔的生物芯片技术、RNAi 技术和蛋白质组研究等，限于我们目前的条件，只能作些演示或作为动态给以介绍，条件一经成熟，即行开设。
由于分子生物学技术和生物技术的快速发展，加之我们是第一次这样系统地给学生开设生物技术大试验课程，许多工作还处于不断探索的过程中，难免有不妥和疏漏之处，恳切期望读者提出宝贵意见，以利不断修正完善。
河北联合大学生命科学学院分子生物学技术大实验操作指导手册生物工程系二零一二年五月目录实验一 PCR技术体外扩增DNA片段 (3)实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA (4)实验三 DNA 片段的凝胶回收 (5)实验四 DNA的重组技术 (7)实验五转化及重组子的筛选 (9)实验六质粒DNA的提取 (11)实验七克隆子的鉴定 (13)实验八 SDS－PAGE测蛋白质的分子量 (15)实验九 WESTERN BLOT检测蛋白 (18)实验十、凝胶图谱分析 (18)实验一PCR技术体外扩增DNA片段实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理和实验技术。
实验原理多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。
在待扩增的DNA片段的两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。
经变性、退火和延伸若干循环后，DNA扩增2n倍。
1．变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。
2．退火：使溶液温度降至50-60℃，模板DNA 与引物按碱基配对原则互补。
3．延伸：在DNA聚合酶的作用下，以单链DNA为模板，利用四种脱氧核苷酸，按5'→3'的方向复制出与模板互补的DNA链。
上述三步为一个循环，每经过一个循环，样品中的DNA量应增加一倍，新形成的链又可作为新一轮循环的模板。
、两个合成的DNA引物典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2和耐热Taq聚合酶。
仪器PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统，各种规格的移液器，制冰机等试剂：特定大小产物PCR反应试剂盒（500 bp）1.DNA模板： pBS500 1-2 ng/ μl2.Taq DNA聚合酶 2.5 UdNTP混和物 2.5 mM each15 mM)10× Taq buffer (MgCl23.引物1、引物2 (10 μM)O4.ddH25. 琼脂糖6. DNA相对分子量标准物（DNA Marker）实验步骤：1 .实验体系的建立：根据以下的反应体系向管中加入各种成分。
PCR反应体系(各种成分单独加入) 以下举例为常规PCR反应系统，仅供参考。
实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据模板、目的片段的大小、碱基序列和引物长短等具体情况，设定最佳反应条件。
50 μl反应体系如下(可根据比例放大或缩小反应体系)：T emplate（pBS500） 4 μlPrimer 1（10 μM） 2 μlPrimer 2（10 μM） 2 μl10×T aq Buffer 5 μldNTP Mixture(2.5 mM) 4 μlT aq (2.5 U/μl) 1 μlddH2O 补至50 μl2. 94℃ 2 min94℃30 sec55℃30 sec 35 cycles72℃30 sec72℃ 5 min3. 结果检测：反应结束后取5 μl反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验目的通过本实验学习用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。
实验原理琼脂糖凝胶电泳分离DNA的能力是通过电荷效应和分子筛效应来完成的。
DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中从负极向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于DNA分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。
DNA分子的迁移速率与相对分子量的对数值成反比关系。
在相对分子量相同的情况下，DNA分子的迁移速率依次为：超螺旋状DNA > 带切口环状DNA > 线形DNA。
凝胶中琼脂糖的百分含量由被分离的DNA大小决定（参照下表）。
电泳后的凝胶经溴化乙锭荧光染料染色，根据与DNA相对分子量标准物的比较，即可确定DNA片段的大小。
琼脂糖凝胶浓度% 线性DNA的有效分离范围Kb0.3 5-600.6 1-200.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-42.0 0.1-3仪器琼脂糖凝胶电泳系统，紫外透射箱或凝聚图像分析仪试剂1. 0.5 ×TBE电泳缓冲液2. 6 ×上样缓冲液3. 琼脂糖4. DNA相对分子量标准物（DNA Marker）5.溴化乙锭（EB）用水配制成10 mg/ml的溶液，使用浓度为0.5 μg/ml。
注意：溴化乙锭是一种强诱变剂并有中度毒性。
使用含此染料的溶液时必须带手套。
使用后的溶液和物品应专门处理，不要随意丢弃。
实验步骤（一）制备1%的琼脂糖凝胶称取1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100 ml的0.5 × TBE缓冲液，在微波炉中加热。
完全融化后，冷却到60℃左右，加入5-10 μl 的10 mg/ml溴化乙锭溶液后摇匀。
（二）胶板的制备1. 用隔板将胶板的两端边缘封闭好。
2. 将胶板放在水平处，放好样品梳子(注意梳子底部距离胶板1-2 mm )。
3. 将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶缓慢倒入胶板中，注意不要产生气泡。
胶厚度在8 mm之间。
4. 待胶凝固后，取出梳子，取下隔板，放入电泳槽内（注意：梳子的方向靠近负极）。
5. 向电泳槽中加入0.5 × TBE缓冲液，缓冲液要浸没凝胶。
（三）加样1. 在样品中加入适量的6 ×上样缓冲液，使缓冲液的终浓度为1×。
2. 用微量移液器将已加入缓冲液的样品加入上样孔中。
记录加样的顺序和加样量。
（注意：加样的过程中不要让样品溢出上样孔）（四）电泳1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意DNA片段是从负极向正极移动）。
DNA的迁移速度与电压成正比。
最高电压不超过5 V/cm。
2. 当溴酚蓝染料移动到凝胶的1/2 — 2/3 处时，停止电泳。
（五）观察实验结果在紫外灯（360 nm或254 nm）下观察染色后的凝胶，DNA处显出橘红色的荧光条带。
实验三DNA 片段的凝胶回收实验目的从琼脂糖凝胶中回收目的DNA条带。
目的DNA片段的回收技术是重组DNA中的关键技术，回收是指从电泳介质中纯化出目的片段。
目前待回收的片段主要有酶切片段和各种PCR片段。
回收的介质主要有琼脂糖和PAGE；回收的方法主要有树脂回收、离心柱回收、玻璃奶回收和透析袋大量回收等，下面介绍离心柱回收技术。
实验原理采用可以高效、专一结合DNA的硅基质材料和独特的缓冲液系统，从TAE或TBE琼脂糖凝胶上回收DNA 片段，同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子及寡核苷酸引物等杂质。
可回收100 bp－10 kb 大小的片段。
本方法具有操作简单的特点，特别适合于PCR片段、酶切片段等的回收。
仪器：琼脂糖凝胶电泳系统，紫外透射箱，电子天平，高速冷冻离心机试剂：1. 0.5 ×TBE电泳缓冲液2. 6 ×上样缓冲液3. 琼脂糖4.DNA相对分子量标准物（DNA Marker）5. 溴化乙锭（EB）6.无水乙醇7.离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒注意事项：1.电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳和回收效果。
2.如下一步实验要求较高，则应尽量使用TAE电泳缓冲液。
3.切胶时，紫外照射时间应尽量短，以免对DNA造成损伤。
4.如果回收率较低，可在胶充分溶解后检测pH值，如pH值大于7.5,可向含有DNA的胶溶液中加10—30 µl 3 M醋酸钠（pH 5.2）将pH值调到5－7之间。
5. 回收<100bp 及>10kb的DNA片段时，应加大溶胶液的体积，延长吸附和洗脱的时间。
实验步骤1.紫外灯下将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。
2.向胶块中加入3倍体积溶胶液PN（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 µl，则加入300 µl溶胶液），50℃水浴放臵10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放臵几分钟，直至胶块完全溶解 (若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。
(胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱)。
3.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1或CB2中（依所购买的试剂盒种类而定）（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
4.向吸附柱中加入700 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 13,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
5.向吸附柱中加入500 μl漂洗液PW， 13,000 rpm离心30秒，倒掉废液。
将离心吸附柱CB1或CB2放回收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。
将吸附柱臵于室温或50℃温箱数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
如果漂洗液有残留会影响回收效率和DNA质量。
6．将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位臵悬空滴加适量65－70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放臵2分钟。
13,000rpm离心1分钟收集DNA溶液。
7．为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤6。
CB1柱的洗脱体积不应少于20 μl，CB2柱的洗脱体积不应小于30 μl过小影响回收效率。
洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。
若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。
也可用TE buffer (10 mM Tris〃Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0)作为洗脱缓冲液，但EDTA会影响后续的酶反应等实验。
实验四DNA的重组技术实验目的通过本实验学习DNA重组的原理和技术。
实验原理DNA重组，即外源DNA分子与载体分子的连接，实际上是指在双链DNA的5'磷酸和相邻的3'羟基之间形成新的共价键。
进行DNA连接的方法有很多，主要有粘端连接法和平端连接法。
后者还包括平接法和接头法，以及平-粘连接法。
选择这些方法的依据主要是外源DNA片段和质粒载体的末端以及它们DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
这两种DNA连接酶都具有将相同粘性末端的DNA分子连接在一起的功能。
而T4噬菌体DNA连接酶还具有将两个平头末端的双链DNA 分子连接在一起的活性，但后者的连接效率往往低于前者的连接效率。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步：首先，T4噬菌体DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后，产生一个新的磷酸二酯键，封住切口。
