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抗体药物偶联物的制备研究 PPT

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抗体药物偶联物的制备研究PPT课件.

抗体药物偶联物的制备研究PPT课件.
g/mL的IgG 75pL分装至离心管 中，TCEP和DTT用PB7.0缓冲液配置成10mM溶液，然 后稀释至1mM，将药物溶于N, N-二甲基甲酰胺配成 浓度为2 mM的溶液。 ◆还原反应：将还原剂按表中比例加入到IgG溶液中， 补充缓冲液至总体积为150pL，用移液枪吹打混匀， 将反应体系放置到37C恒温摇床中，180转速下反应 2h。SDS-PAGE检测是否被还原。 ◆在反应体系中取出5pL稀释至20pL，加入非还原电 泳上样缓冲液，进行SDS-PAGE，检测还原反应程度 [5] 。
◆考察样品中加入不同硫酸铵含量对分析结果的影 响。加入不同比例2 M硫酸铵缓冲液(2.0 mM Na2HPO4-NaH2PO4磷酸缓冲液中加入2M硫酸铵调 pH 7.0)和PB(20 mM pH 7.0 Na2HPO4-NaH2PO4磷 酸缓冲液），最终浓度硫酸铵分别为0.5、0.8、 1.0、1.3、1.5M。 ◆考察流速为0.2、0.4、0.6、0.8、1mL/min时，系 统压力的变化，分析柱对抗体与药物偶联后生成 产物的情况，室温检测，检测波长为280nm，进样 体积为50pL，浓度1mg/mL，总蛋白进样量为50昭 。
2.3实验药品和仪器
实验药品及其规格
2.4.1、蛋白浓度测定
蛋白浓度采用BCA方法测定。具体步骤为：分别在96 孔板的每个孔中加入20pL 不同浓度（0.2mg/mL、 0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL 和 1.0mg/mL)的蛋 白标准品(BSA标准溶液2mg/mL)和待测样品和空白对 照，然后加入200pL工作液（A液:B液=50:1)，将96孔 板放置于37C的恒温培养箱中反应0.5h。将酶标仪的 检测波长设为562nm，在该波长下检测每个孔中蛋白 质的吸光值。然后根据标准蛋白的浓度和测出的吸光 值，绘制蛋白质浓度标准曲线。从标准曲线计算得到 检测样品的浓度。

抗体药物偶联制备

抗体药物偶联制备

抗体药物偶联制备
抗体药物偶联制备是一种将抗体与药物分子结合在一起，以提高药物的靶向性和有效性的技术。

以下是一般的抗体药物偶联制备步骤：
1. 选择合适的抗体和药物：根据疾病目标和药物特性，选择合适的抗体和药物分子。

2. 修饰抗体：利用化学方法将抗体表面引入偶联官能团。

常用的修饰方法包括活性酯化、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯化、巯基化等。

3. 链接药物：将修饰后的抗体与药物分子进行偶联。

常用的偶联方法包括亲核取代反应、酰胺形成反应、酯化反应等。

4. 纯化和检测：对偶联后的抗体药物进行纯化，以去除未反应的杂质。

常用的纯化方法包括凝胶过滤层析、负离子交换层析等。

同时，对偶联后的抗体药物进行质量检测，确保偶联效率和药物的活性。

5. 评估抗体药物的效价和稳定性：通过体外和体内实验，评估抗体药物的靶向性、抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和药物释
放性能等。

需要注意的是，抗体药物偶联制备是一个复杂的过程，需要充分考虑抗体和药物的特性、偶联方法的选择、纯化和检测等因
素。

同时，制备过程中需要注意控制修饰和偶联的条件，以确保药物的活性和抗体的稳定性。

《抗体制备过程》课件

《抗体制备过程》课件

免疫动物的筛选
选择合适的动物种类： 如小鼠、大鼠、兔子
等
确定动物的健康状况： 确保动物健康，无疾
病
确定动物的年龄：选 择合适的年龄，如成
年动物
确定动物的性别：选 择合适的性别，如雌
性动物
确定动物的免疫状态： 选择免疫状态良好的
动物
确定动物的遗传背景： 选择遗传背景合适的
动物
确定动物的饲养条件： 确保动物饲养条件良
免疫佐剂的选择原则：根据抗 原性质、免疫途径、实验目的 等因素选择
免疫佐剂的优化方法：通过实 验筛选最佳浓度、组合方式等
抗体纯化技术的优化
亲和层析法： 利用抗体与抗 原的特异性结 合，实现抗体
的纯化
离子交换层析 凝胶过滤层析
法：利用抗体 法：利用抗体
与离子交换树 分子大小不同，
脂的相互作用， 实现抗体的纯
抗体应用
医学领域：用于诊 断和治疗疾病
生物技术领域：用 于基因工程和生物 制药
食品工业：用于食 品检测和食品安全
环境监测：用于环 境污染物检测和监 测
抗体制备过程
免疫原的制备
免疫原选择：选择合适的抗原或半抗原 免疫原纯化：通过纯化技术去除杂质 免疫原处理：对免疫原进行化学修饰或物理处理 免疫原保存：在适当的条件下保存免疫原，防止降解或变质
免疫原的纯化： 去除杂质，提 高抗原的纯度
免疫原的浓度： 选择合适的抗 原浓度，以提 高抗体的产量
和质量
免疫原的保存： 选择合适的保 存方法，如低 温保存、干燥 保存等，以保 持抗原的活性
和稳定性
免疫佐剂的选用与优化
免疫佐剂的作用：增强免疫反 应，提高抗体产量
免疫佐剂的种类：铝盐、脂质 体、核酸等

科研实验中的抗体偶联药物结合物：...

科研实验中的抗体偶联药物结合物：...

科研实验中的抗体偶联药物结合物：...抗体(antibody)毒素(drug)连接物(linker)构建ADC-抗体药物偶连物ADCs的组成包括肿瘤抗原特异性mAb，稳定的可裂解或不可裂解的linker，以及有效的细胞毒性载荷。

rug)、连接物(linker)构建ADC-抗体药物偶连物ADCs的组成包括肿瘤抗原特异性mAb，稳定的可裂解或不可裂解的linker，以及有效的细胞毒性载荷。

ADC由以下三部分组成：抗体（antibody）：其作用是特异性识别靶细胞毒素（drug）：起到损伤细胞的作用连接物（linker）：连接抗体与毒素相关资料：DBCO-PEG4-vc-PAB-MMAEDBCO-PEG4-MMAFDBCO-PEG4-Ahx-DM1DBCO-PEG4-vc-PAB-Duocarmycin SADBCO-PEG4-vc-PAB-(PEG2)-Duocarmycin SADBCO-PEG4-VA-PBDDBCO-PEG4-vc-PAB-MMAFDBCO-PEG4-vc-PAB-MMADDBCO-PEG4-vc-PAB-Duocarmycin TMDBCO-PEG4-vc-PAB-(PEG2)-Duocarmycin TMDBCO-PEG4-vc-PAB-Duocarmycin DMDBCO-PEG4-vc-PAB-(PEG2)-Duocarmycin DMDBCO-PEG4-VC-PAB-DMAE-PNU159682DBCO-PEG4-DMAE-PNU159682DBCO-PEG4-GGFG-DX8951DBCO-PEG4-vc-PAB-Ahx-DM1DBCO-PEG8-VA-PAB-SG3199Gly3-vc-PAB-MMAEGly3-MMAFGly5-Ahx-DM1PNU159682-EDA-Gly3ADC pre-screening kit AProtein A-DM1Protein A-MMAEProtein A-MMAFProtein A-DuocarmycinProtein A-CalicheamicinProtein A-PBDADC pre-screening kit GProtein G-DM1Protein G-MMAEProtein G-MMAFProtein G-DuocarmycinProtein G-AmanitinProtein G-AmanitinRabbit Anti-vc-PAB-MMAE pAbMouse Anti-vc-PAB-MMAE mAb (B11F11) Rabbit Anti-MMAF pAbMouse Anti-MMAF mAb (F3B11) Mouse Anti-MMAE / F mAb (B12A2) Mouse Anti-MMAE /F mAb (C12A1) Rabbit Anti-DM1/4 pAbMouse Anti-DM1/4 mAb (F1D5)Mouse Anti-DM1/4 mAb (G2F3)Rabbit Anti-Calicheamicin pAbMouse Anti-Calicheamicin mAb (B1G9)Mouse Anti-Calicheamicin mAb (C1F12)Rabbit Anti-Duocarmycin pAbMouse Anti-Duocarmycin mAb (E11A1)Mouse Anti-Duocarmycin mAb (H7A9)Mouse Anti-Duocarmycin mAb (E6B3)Rabbit Anti-PNU-159682 pAbMouse Anti-PNU-159682 mAb (F7F2)Mouse Anti-PNU-159682 mAb (C1E3)Mouse Anti-PNU-159682 mAb (D12H11)Rabbit Anti-Amanitin pAbMouse Anti-Amanitin mAb (H3E1)Mouse Anti-Amanitin mAb (H12D6)Mouse Anti-Amanitin mAb (C2C4)Rabbit Anti-SN38 pAbMouse Anti-SN38 mAb (10F11A9D6)Mouse Anti-SN38 mAb (8E10F12F3)Mouse Anti-SN38 mAb (8E10A4A1)Rabbit Anti-PBD SG3199 pAbMouse Anti-PBD SG3199 (7H6H9A6) mAbMouse Anti-PBD SG3199 (8G2H12A9) mAbMouse Anti-PBD SG3199 (8B3D12G1) mAb资料仅供科研参考，其他合成技术疑问欢迎探讨(2021.4.lrx )。

抗体药物偶联物的构建——连接位点与连接基团的选择

抗体药物偶联物的构建——连接位点与连接基团的选择

抗体药物偶联物的构建——连接位点与连接基团的选择1.抗体药物偶联物概念抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)是通过一个化学链接将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中，目前应用最广的是针对肿瘤细胞的递送。

利用小分子药物的细胞毒性杀死肿瘤细胞是许多化疗药物的机制，然而为了追求更好的治疗效果，小分子药物的细胞毒性往往很强。

由于选择性不足，导致对于正常细胞也存在着杀伤，进而导致对机体的伤害。

最大耐受量和最小有效剂量之间的剂量范围即为治疗窗，药物选择性的不足导致治疗窗变得狭窄，这给临床用药带来了不便。

提高药物的选择性，是拓展治疗窗的一个手段。

抗体是一类具有特殊亲和力的蛋白，利用其对靶细胞特异性的结合，有望作为药物靶向递送的载体，进而提高药物的选择性。

图1 药物治疗窗示意图2.首个抗体药物偶联物药物辉瑞旗下的Mylotarg（gemtuzumab ozogamicin）是首款得到美国FDA批准，用于治疗表达CD33抗原的新诊断急性骨髓性白血病（AML）成人患者的抗体药物偶联物。

Mylotarg含有可以靶向CD33的单克隆抗体和与之连接的细胞毒素卡其霉素（calicheamicin）。

CD33是一种在成髓细胞表面表达的抗原，在多达90%的AML患者中都存在。

Mylotarg通过与CD33抗原结合实现对肿瘤细胞的靶向效应。

该类药物的成功上市证明了抗体药物偶联物作为药物的可能性与广泛应用前景。

图2 Mylotarg结构式（来源：）3.抗体与药物连接位点的选择对抗体进行药物偶联时，往往使用带有特殊侧链的氨基酸作为反应位点。

其中以半胱氨酸和赖氨酸为最多。

半胱氨酸在抗体中以二硫键的形式存在，因此需要对其进行还原为自由巯基进行下一步反应。

其中在抗体（IgG）链间有4对二硫键，比较容易被还原。

而在抗体链内，有12对二硫键，较难被还原。

赖氨酸则广泛分布于抗体结构域，大约有86个赖氨酸残基，其中有大约20个赖氨酸残基可作为连接位点。

抗体adc偶联工艺

抗体adc偶联工艺

抗体adc偶联工艺
抗体均为蛋白质分子，可以结合到特定的抗原上。

ADC（Antibody-Drug Conjugate，抗体
药物偶联物）是一种通过将特定的药物与抗体结合来增强治疗效果的药物传递系统。

抗体ADC的偶联工艺通常包括以下步骤：
1. 选择适当的抗体：选择具有高亲和力且特异结合于靶向肿瘤细胞的抗体。

通常选择单克隆抗体，以确保高度专一性。

2. 修饰抗体：在抗体分子上引入化学修饰，以提供药物偶联的位置。

最常用的修饰是通过基于酶的反应，如Sortase A，将药物结合位点引入抗体分子中。

3. 药物偶联：将药物与修饰后的抗体结合。

药物通常是细胞毒性化合物，如化疗药物。

偶联的方法包括使用特定的化学反应（如酰胺反应）、交联剂（如SMCC）或特定酶的使用（如Lys-C）。

4. 纯化和表征：纯化ADC以去除未偶联的抗体和未偶联的药物。

然后，对ADC进行各种表征，如浓度测定、电泳分析和质谱分析。

5. ADC稳定性评估：对ADC的稳定性进行评估，包括在不同的温度、pH和储存条件下的稳
定性检测。

抗体ADC的偶联工艺可以根据具体的药物和抗体的要求进行修改和改进。

这种技术可以增强
药物的特异性，减少对正常细胞的毒性，提高治疗效果，并降低治疗剂量和副作用。

抗体药物偶联物的研究进展

抗体药物偶联物的研究进展抗体药物偶联物（antibody-drug conjugates，ADCs）是一种由单克隆抗体与化学药物通过共价键结合而成的生物分子复合物。

ADCs在肿瘤治疗上具有广阔的应用前景，其能够实现药物的靶向性、增加药物在肿瘤部位的稳态浓度，并最终导致肿瘤的死亡。

ADCs主要由三部分组成，即载体抗体、毒性药物和结合二者的连接剂。

其中，抗体的选择决定了ADCs的药物靶向性，而药物和连结剂的选择则决定了ADCs的药物毒性。

ADCs的制备关键在于要实现药物与抗体之间的扩散过程，这不仅要求化学药物的稳定性、连结剂的活性，还要考虑抗体活性和整个结构的稳定性。

因此，ADCs的制备需要耗费较大的精力和费用。

在临床应用层面上，ADCs主要用于治疗肿瘤类疾病，如乳腺癌、黑色素瘤等。

其中不乏一些ADCs已经进入临床阶段，如Ado-trastuzumab emtansine(Kadcyla，T-DM1)和Brentuximab vedotin（Adcetris）等。

这些药物在肿瘤治疗上已经获得了很好的临床疗效，但是ADCs仍面临着一些制约因素，例如药物选型、药物的物理化学性质、药物分配和代谢、抗体地位等诸多问题亟需解决。

总体而言，ADCs的研究进展是与多学科的交叉融合相伴随的。

在此背景下，药物学、化学、细胞生物学、分子生物学等领域均为ADCs的研究做出了巨大的贡献。

未来，ADCs的发展会趋于多样化与个性化，从中发现动态的疗效和药物安全性之间的关联。

ADCs的优化将依赖于新的生物标志物和建立“药物-靶标结构-功能-疗效”的整合策略。

此外，由于ADCs对于肿瘤细胞生长、侵袭、细胞凋亡等生物学特征的影响深远，因此ADCs具有避免多药耐药性的潜力，并可能实现“从新药开发到真正的治疗解决方案”的转型。

目前，ADCs的研究是具有广阔发展前景的，将有望成为未来抗癌治疗的重要方向之一。

抗体药物偶联物

抗体偶联药物(antibody-drug conjugates， ADC) 因其良好的靶向性及抗癌活性目前已成为抗肿瘤抗体药物研发的新热点和重要趋势，受到越来越多的关注 。

ADC 药物由单克隆抗体 、 高效应的细胞毒性物质以及连接臂三部分组成， 它将抗体的靶向性与细胞毒性药物的抗肿瘤作用相结合， 可以降低细胞毒性抗肿瘤药物的不良反应 ， 提高肿瘤治疗的选择性， 还能更好地应对靶向单抗的耐药性问题.
有以下几个问题，需要思考：1） 靶标与抗体的选择 2）接头与偶联技术 3）负载药物 4）ADC药物的质量属性分析
重点说一下偶联技术：
非特定位点：通常药物与抗体的偶联是通过抗体上赖氨酸残基或链间二硫键还原产生的半胱氨酸残基实现的 。

这两种方式所获得的抗体药物偶联物中单个抗体上偶联的药物个数为 0个到 8 个不等， 具有较大的异质性，这对抗体偶联药物的批间一致性提出 了巨大的挑战 。

位点特异性偶联的方法还包括使用非天然氨基酸、 硒代半胱氨酸和酶解偶联法。

简单介绍一下一个在研的ADC项目：
构成：Herceptin+linker+MMAF/MMAE，通过在Herceptin碳端（重链或轻链）引入额外序列CAAX，进而采用特定的酶反应使linker+drug部分能偶联在特定位点。

采用在血浆中稳定的而在靶向部位易裂解的linker，保证了ADC药物的安全性以及有效性。

临床前数据表明，此药物与Herceptin具有相同的体外结合亲和力以及相同的PK特性；在HER2
阳性细胞株上，展现出良好的体外细胞毒性；在体内异种乳腺癌细胞株BT-474以及胃癌细胞株NCI-N87试验中，表现出强的抑制肿瘤效果。

{对ADC项目或此项目有兴趣的，可以交流一下}。

抗体偶联药物(ADCs)分析

抗体偶联药物（ADCs）分析抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugates，ADCs）是一类由单克隆抗体和具有强效细胞毒性的小分子药物通过生物活性连接子偶联而成的新型生物药物。

其药物作用机理为通过单克隆抗体特异导向靶标癌细胞，再由偶联的小分子药物杀死癌细胞。

因此，ADC兼具了单克隆抗体药物高度特异性和靶向性的特点，以及小分子药物清除癌细胞的高效性，能协同发挥抗体药物和化学药物各自的优点，能够降低对生物系统的伤害。

常用的抗体偶联药物的制备是通过两步偶联反应，先将抗体与偶联剂（linker）结合形成中间体（抗体-linker），然后中间体再与小分子药物连接生成抗体偶联药物，如下图所示。

抗体偶联药物ADCs两步反应。

在反应过程中可能会出现以下几个问题：1, 部分抗体和小分子药物不能成功偶联；2, 抗体中存在多个结合位点（Cys, Lys 残基等），结合部位以及结合数量的不同会导致不均一性；3, 由于小分子药物的疏水性更高，与单抗结合数量的不同可能导致ADC药物的疏水性发生变化等问题。

这些未偶联的裸抗和具有细胞毒性的小分子以及偶联药物的不均一性可能会对ADC药物的药效、安全性产生影响。

相比单克隆抗体，ADCs药物的生产工艺更为复杂，因此为了保证ADCs药物的安全性和有效性，需对ADCs药物的质量进行监控。

药物抗体比（drug to antibody ratio，以下简称DAR）是评价ADCs药物的生产工艺和产品质量的重要参数之一。

因此，在ADC申报前对于ADC药物结构、DAR、药效、安全性的全面评估是至关重要的。

百泰派克拥有多种先进色谱质谱分析仪器，结合专业生物信息学分析团队，能快速、准确的为您提供专业系统的抗体偶联药物分析评定服务。

检测平台• MALDI-TOF质谱。

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• UV/VIS光谱。

• UV-MALDI质谱。

• 反相高效液相色谱 (RP-HPLC)。

• 亲水相互作用色谱 (HILIC)。

抗体制备过程PPT课件


背部皮下，每处注射0.2 ml, 共2～4点。待肿瘤到达一定大小后(一般10～20天
)那么可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可到达1-10mg／ml。但采血量有
限。
+
② 腹水的制备 常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于
BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可
+ 1. 有限稀释法的程序
+
① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备)
+
② 阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml
+
③ 取130个细胞放入含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl
／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下细胞悬液补加含饲养细胞的完全培
养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下
备的，与其它抗原无交叉反响性。与其它常规免疫 血清相比，单抗的特异性高、效价高、质地均一， 便于精制浓缩，应用单抗可以提高检测方法的敏感 性和特异性。同时，他又可作为提纯抗原、制备疫 苗、生产生物制剂和用于根底研究的重要手段。
+ 3 .生产简单，易于标准化 + 一旦选育成功一株高效价的杂交瘤细胞株，经鉴定
料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。
+
(4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
+
(5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
+
(6) 在室温下融合可先以预热40℃:
+
① 30秒内参加预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加
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2.4.2、聚丙烯酰胺凝胶电泳
◆SDS-PAGE是依据通过SDS使蛋白质分子带上大量负
电荷中和蛋白质分子本身电荷，消除蛋白质分子本 身的电荷效应。依据蛋白质的分子大小呈现不同条 带。通过凝胶成像系统所得图片蛋白带的宽度以及 颜色的深浅，采用光密度分析可以判断出蛋白带大 约的蛋白量。 ◆采用非还原的SDS-PAGE电泳，浓缩胶为8%的聚丙烯 酰胺凝胶，分离胶为12%的聚丙烯酰胺凝胶。样品缓 冲液中不含巯基乙醇[6] 。取20pL(0.1mg/mL〜 0.5mg/mL)蛋白样品加适量的样品缓冲液在100C下煮 沸5min， 8000g高速离心5min后上样。考马斯亮蓝 染色，染色剂为考马斯亮蓝R-250。
3.2疏水作用层析流速的选择
采用 HIC 进行分离过程中，流速能够影响不 同药物偶联物之间的分离度，流速一般在 0.2〜1mL/min 之 间 变 化 ， 在 流 速 0.2〜 1mL/min 变化时，系统压力逐渐上升，压 力如图4-1所示，当流速超过0.8mL/min时 ，系统压力达到 10MPa ，已经接近 AKTA 层 析系统耐受压力。流速在 0.6mL/min 时， 系统压力在 8MPa，在层析系统和分析柱的 耐受压力范围内，但是，不同药物偶联物 的峰分离度很差，不能将各个产物很好的 分开。当流速为 0.2mL/min 时，分析时间 延长，综合考虑各个因素选择最优流速为 0.4mL/min。
◆考察样品中加入不同硫酸铵含量对分析结果的影 响。加入不同比例2 M硫酸铵缓冲液(2.0 mM Na2HPO4-NaH2PO4磷酸缓冲液中加入2M硫酸铵调 pH 7.0)和PB(20 mM pH 7.0 Na2HPO4-NaH2PO4磷 酸缓冲液），最终浓度硫酸铵分别为0.5、0.8、 1.0、1.3、1.5M。 ◆考察流速为0.2、0.4、0.6、0.8、1mL/min时，系 统压力的变化，分析柱对抗体与药物偶联后生成 产物的情况，室温检测，检测波长为280nm，进样 体积为50pL，浓度1mg/mL，总蛋白进样量为50昭 。
◆采用3K超滤管超滤膜在4000g转速下离心至少5次，以除
去未反应还原剂。同时将整个反应置换成Tris-HCl 8.0 的缓冲体系中。 ◆加入不同比例2mM药物142B1，Drug：IgG比例分别为4、5 、6。比例和体积如表中所示，加入Tris-HCl pH8.0至反 应体系为200pL (表4-3)。采用混匀器混匀后，将反应体 系放置到37C恒温摇床中，180转速下反应1h。 ◆向最终的反应体系中加入半胱氨酸，使其中浓度达到1mM ，猝灭未反应 的药物。反应后的样品采用BCA法检测浓度。
2.3实验药品和仪器
实验药品及其规格
2.4.1、蛋白浓度测定
蛋白浓度采用BCA方法测定。具体步骤为：分别在96 孔板的每个孔中加入20pL 不同浓度（0.2mg/mL、 0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL 和 1.0mg/mL)的蛋 白标准品(BSA标准溶液2mg/mL)和待测样品和空白对 照，然后加入200pL工作液（A液:B液=50:1)，将96孔 板放置于37C的恒温培养箱中反应0.5h。将酶标仪的 检测波长设为562nm，在该波长下检测每个孔中蛋白 质的吸光值。然后根据标准蛋白的浓度和测出的吸光 值，绘制蛋白质浓度标准曲线。从标准曲线计算得到 检测样品的浓度。
3.3抗体药物偶联物疏水作用分析
在流速0.4mL/min，样品中盐浓 度为1.5M硫酸铵的条件，采用 AKTAPurifier100层析系统对样 品进行分析。不同载药量的抗 体药物偶联物按照疏水性的强 弱先后被洗脱下来，从而得到 不同的检测峰。抗体还原后的 巯基是成对出现，因此，偶联 的药物数量分别是0，2，4，6 ，8个，分别记为D0，D2，D4， D6， D8。出峰先后顺序为D0， D2，D4，D6，D8，见图4-4。每 个抗体分子的平均药物载量可 以通过构成峰的积分面积和每 个峰的药物载量作为加权因子 来计算，通过工作站分析得出 各个峰面积，见表4-2：
由于药物的成分、均一性与药物的安全以及 药物的疗效息息相关，因此对抗体药物偶联 物的组成、非均一性分析越来越被重视[4] 。疏水色谱柱TSKgelButyl -NPR (4.6mm X 3.5 cm)以对蛋白的高速、高分辨率的分离 性能为广大研宄人员提供了帮助。它以表面 键合有丁基的、粒径为2.5—的非多孔型亲 水性树脂作为填充剂。
实验结果与讨论
3.1疏水作用层析硫酸铵浓度的选择
盐浓度的高低直接影响疏水吸附能力的大 小，盐浓度太高疏水性强，不宜洗脱；而盐 浓度太低疏水性弱，不宜吸附。因此要选择 适宜的盐浓度。当样品中分别含有不同盐浓 度0.5、0.8、1.0、1.3、1.50M硫酸铵时，进 行HIC分析，当盐浓度为0.5、0.8、1.0 M时， 样品不能吸附在介质上，基本全部流穿，当 为盐浓度为1.5M，洗脱峰中出现不同的抗体 药物偶联物，因此，选择样品上样时盐浓度 为 1.5M。
通过上式计算出不同反应每个抗体分子上平均 偶联上的药物数量。图4-2由 下及上分别是 IgG: DTT： Drug=1:1.5:3、 1:2.5:5、1:3.5:7、1:3:6。通过分析可知， 当IgG： DTT： Drug=1:1.5:3时，偶联到抗体 上的药物很少，基本检测不出，当 IgG： DTT： Drug=1:2:4时，平均每个抗体上 的药物数量为1.65，当IgG： DTT： Drug=1:2.5:5时，平均每个抗体上的药物数量 为2.22，当IgG: DTT： Drug=1:3:6 时，平均每个抗体上的药物数量为3.56，因此， 当IgG： DTT： Drug=1:3:6时， 平均每个抗体上的药物数量符合要求，因此， 采用DTT作为还原剂还原抗体并 偶联上药物的最佳比例为IgG： DTT： Drug=1:3:6
2.4.4、反相色谱分析
层析前样品处理：采用BCA法检测抗体与药物偶联后 产物的浓度，将产物用PBS 稀释到 2mg/mL。100^L 2mg/mL IgG 在 PBS 溶液中与 100pL 50mM DTT 在37C ，反应20min，0.22^m的超滤膜过滤，除去样品中杂质 。上样20^L，280nm检测。 采用反相色谱柱 PLRP-S 1000A，8mm，150mmx4.6mm， P/N PL1512-3802 检测，方法：Buffer A: H2O + 0.1% TFA，Buffer B: CH3CN + 0.1% TFA，梯度： 30-45%B 30min，95%B 3 min，30%B 5min。
2.1实验机理
抗体被还原到合适的程度后，进行与药物的偶联 反应，通常在pH 7〜8左右，反应温度0°C下反 应1h。例如如果抗体被还原到4巯基/抗体，通常 加入4-5倍的马来酰亚胺接头的药物反应30min[1] 。其中采用二甲基甲酰胺（DMF)或者二甲基乙酰 胺（DMAC)先将药物溶解，然后与抗体还原后的 产物反应[2，3]。加入过量的小分子硫醇进行猝灭 ，来阻止马来酰亚胺与抗体上的巯基进一步反应 ，药物接头的马来酰亚胺被猝灭后，接下来的步 骤就是要除去多余的药物接头以及有机溶剂， EDTA等添加物。
药物载量计算以IgG： DTT： Drug=1:3:6为例进行计算
3.4反相色谱分析
反相色谱也是基于抗体载药量的不同来来分离的，载药量越 高的ADC，保留时间越长，与HIC的根本不同是反相色谱是在 还原的条件下分离的，此时抗体的重链轻链是分离的，并没 有共价结合为一体，因此重链轻链是分别洗脱下来的。部分 还原后偶联药物生成的药物偶联物是一个依靠链间的共价键 结合在一起的复杂的混合物，从该混合物中的物种衍生的反 相色谱图很难解释，所以这个方法的样品制备包括DTT处理的 步骤，以减少任何其它分子间的二硫化物。样品完全还原后 ，所有的抗体以单独的链进行洗脱。所有的重链轻链连有不 同数量药物，重链H，轻链L，重链连有1个药物H1，依次类推 ，产物有L0，L1，H0，H1， H2，H3分别计算出来，由工作站 得出每个峰面积，当IgG:DTT:Drug=1:2:4时，每个峰面积如 表4.5所示，由下式可得出每个抗体上连接药物数量。图4.3 中，
2.2实验方案
◆分别取浓度为26.6mg/mL的IgG 75pL分装至离心管 中，TCEP和DTT用PB7.0缓冲液配置成10mM溶液，然 后稀释至1mM，将药物溶于N, N-二甲基甲酰胺配成 浓度为2 mM的溶液。 ◆还原反应：将还原剂按表中比例加入到IgG溶液中， 补充缓冲液至总体积为150pL，用移液枪吹打混匀， 将反应体系放置到37C恒温摇床中，180转速下反应 2h。SDS-PAGE检测是否被还原。 ◆在反应体系中取出5pL稀释至20pL，加入非还原电 泳上样缓冲液，进行SDS-PAGE，检测还原反应程度 [5] 。
河北科技大学本科论文答辩
抗体药物偶联物的制备研究

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目录
实 验 分 以 下 几 项 进 行 介 绍
1.引言
2.实验部部分
3.实验结果与讨论
4.实验结论
1.1课题背景
本课题是对抗体药物偶联物的制备进行研宄，主要 内容如下： 从众多检测蛋白的方法中挑选出适用于检测抗体还 原后产物的最优方法。采用常用的还原剂对抗体进 行还原，检测抗体不同时间下还原程度，得出最优 还原反应时间以及还原过程的动态变化。 对反应温度，反应pH，还原剂与抗体的还原比例进 行响应面试验设计，优化反应条件，从常用的九种 还原剂中筛选出高效的还原剂，用来连接带有马来 酰亚胺接头的药物，进行抗体药物偶联物制备实验 。

由上至下依次为 IgG, IgG:DTT:Drug=1:1.5:3，IgG ： DTT: Drug=1:2:4，IgG： DTT: Drug=1:2.5:5， IgG： DTT： Drug=1:3:6。
通过分析计算，当 IgG:DTT:Drug=1:1.5:3时，偶 联到抗体上的药物很少，基本 检测不出。当IgG: DTT： Drug=1:2:4时，平均每个抗体 上的药物数量为1.23，当IgG： DTT： Drug=1:2.5:5时，平均 每个抗体上的药物数量为2.12 ，当IgG：DTT： Drug=1:3:6时 ，平均每个抗体上的药物数量 为3.56。这与疏水作用层析数 据基本接近，因此，当IgG： DTT：Drug=1:3:6时，平均每个 抗体上的药物数量符合要求， 因此DTT作为还原剂还原抗体并 偶联上药物的最佳比例为 IgG:DTT：Drug=1:3:6。