基因工程中限制酶的选择及的筛选方法

2024届高三生物提分攻略：如何选取限制酶选择限制酶时需要考虑哪些因素？①为了防止目的基因、载体自身环化和及2者的反向连接，尽量选择双酶切法，选择2种限制酶。

②酶切位点位于目的基因两侧，不能破坏目的基因；③不能破坏启动子、终止子、复制起原点。

④通常选择含有目的基因的DNA片段和载体上共有的酶切位点，或者能产生相同黏性末端的限制酶；⑤若载体上有2个及以上的标记基因，为了便于筛选，通常需要破坏一个标记基因；若载体上只有1个标记基因，不破坏这个标记基因。

⑥考虑转录的方向，需要将目的基因插入载体的启动子和终止子之间，且考虑到目的基因插入后能正常转录出正确的RNA。

1、构建重组质粒时可选用四种限制酶，其识别序列如下图。

为防止酶切片段的自身环接，不可选用的限制酶组合是（）A.①③B.②③C.①④D.③④2、若要利用某目的基因（见图甲）和P1噬菌体载体（见图乙）构建重组DNA（见图丙），限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ（－A↓GATCT－），EcoRⅠ（－G↓AATTC－）和Sau3AⅠ（－↓GATC－）。

下列分析合理的是（）A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体B．用BglⅡ和EcoRI切割目的基因和P1噬菌体载体C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体3、获得相关基因后，利用PCR技术进行融合得到目的基因，可选择与乳腺细胞表达载体pBC1构建重组DNA 分子。

目的基因、表达载体pBCl如图乙所示。

①PCR扩增图示目的基因时需加入种引物和酶。

②本实验应选择限制酶切割目的基因与pBCl载体，将酶切产物正确连接后形成重组DNA分子，以便后续通过荧光检测筛选。

4、人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经加工后形成具有两条肽链（A链和B链）的有生物活性的胰岛素。

此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：“AB”法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；“BCA”法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。

基因工程中限制酶的选择及的筛选方法摘要:基因工程是现代生物科技专题的重要内容,基因工程四部曲中的核心内容是基因表达载体的构建，在构建表达载体过程涉及的限制酶的种类以及筛选方法成为考试的热点内容。

本文结合三道例题将限制酶的选择和筛选方法结合在一起进行比较分析.关键词：限制酶筛选1 单酶切及筛选若用同一种限制酶切割质粒和目的基因形成相同的四个黏性末端，因而可能出现多种连接方式如①质粒和质粒②目的基因和目的基因③质粒的自身环化，目的基因的自身连接④质粒与目的基因的连接。

质粒与目的基因的连接又会出现正向连接和反向连接两种。

若启动子在质粒上，目的基因与质粒的反向连接则导致三联体密码顺序改变,起始密码子和终止密码子位置改变,使得翻译不能正常进行而无法得到正常的表达产物。

例1：（2012江苏生物高考33题部分)图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。

现有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I4种限制性核酸内切酶,它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。

请回答下列问题若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒,那么应选用的限制酶是。

在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌,一般需要用添加的培养基进行培养。

经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是。

答案: BamH I 抗生素B 同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向链接笔者认为可通过免疫学方法检测目的基因的表达产物排除反向连接的重组质粒，或分别在质粒和目的基因上设计相同的限制酶识别位点，然后用该酶去切割重组质粒，正向连接和反向连接便会得到不同长度的DNA片段，再根据已知的限制酶在目的基因的位置进行比对，找到正确连接的重组质粒。

2 双酶切及筛选因为用单酶切会出现质粒与目的基因的任意连接，所以在实际操作中多使用双酶切。

双酶切可以避免质粒的自身环化，目的基因的自身连接和目的基因和质粒的反向连接，而目的基因与目的基因的连接因为没有抗生素抗性基因所以可以在含有该抗生素的培养基上去除，故只剩下质粒与质粒，以及质粒与目的基因的重组体。

基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。

在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。

本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。

一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。

它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。

1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。

它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。

一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。

1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。

它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。

通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。

二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。

在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。

2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。

它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。

2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。

它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。

通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。

三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。

在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。

3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。

它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。

3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。

它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。

基因工程所需要的酶引言基因工程是一项重要的生物技术，它利用酶的特殊功能来改变生物体的遗传信息。

酶在基因工程中起着关键作用，它们能够催化特定的化学反应，使得基因组中的DNA序列发生改变。

本文将介绍基因工程中常用的酶以及它们在不同的应用领域中的作用。

常用酶及其功能1. 限制性内切酶限制性内切酶是一类能够识别DNA序列并在特定位置切割DNA链的酶。

它们广泛应用于基因工程中的DNA重组、克隆和测序等领域。

限制性内切酶根据其识别位点和切割模式被分类为不同类型，如EcoRI、BamHI等。

这些酶可以将DNA分子切割成片段，并产生粘性或平滑末端，为后续操作提供方便。

2. DNA连接酶DNA连接酶是一种能够将两个单链DNA或RNA分子连接成一个完整双链分子的酶。

它们在基因工程中常被用于连接DNA片段，构建重组DNA分子。

T4 DNA连接酶是常用的DNA连接酶之一，它能够将DNA片段连接成环状或线性结构。

3. 核酸聚合酶核酸聚合酶是一类能够催化DNA或RNA的合成的酶。

在基因工程中，核酸聚合酶被广泛应用于PCR（聚合酶链式反应）和基因克隆等领域。

其中，Taq DNA聚合酶是PCR反应中最常用的核酸聚合酶之一，它能够耐高温，并具有高度特异性和高效率。

4. 核酸修复酶核酸修复酶是一类能够修复DNA损伤和错误的酶。

在基因工程中，核酸修复酶被用于修复突变的DNA序列，纠正基因组中的错误。

CRISPR-Cas9系统利用Cas9核酸修复酶来导向性地切割和编辑目标DNA序列。

5. 核苷三磷脂转移ase核苷三磷脂转移ase（NTPase）是一类能够催化核苷三磷酸与核苷二磷酸之间的磷酸酯键转移的酶。

在基因工程中，NTPase被广泛应用于DNA合成和修饰等领域。

DNA聚合酶的活性依赖于NTPase的催化作用。

酶在基因工程中的应用1. DNA重组和克隆在基因工程中，限制性内切酶被广泛应用于DNA重组和克隆。

通过选择适当的限制性内切酶，可以将目标DNA片段与载体DNA连接起来，构建重组DNA分子。

“限制酶”考点例析湖南省耒阳市第一中学周伟“限制酶”是高考试题中命题频率较高的知识点，也是高考备考的核心知识点。

下面结合典型试题，对相关知识进行归纳和整合，希望能对广阔考生的复习备考有所裨益。

一、酶切结果的推导限制酶作为酶类，决定其催化作用具有高效性、专一性和作用条件温和等特点。

其中专一性的具体表现为：某种限制酶只能催化DNA上特定序列特定位点的磷酸二脂键水解，结果是使DNA分子被分割成不同的DNA片段。

限制酶所识别的双链DNA上的序列具有“回文对称”性质，即无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。

当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，即错位平切，产生的是黏性末端；当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，即平切，产生平末端。

错位切的限制酶在基因工程中最常使用，因为与平末端相比较，黏性末端更有利于DNA片段的连接。

例1下面是5种限制性内切酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图〔↓表示剪切点、切出的断面为黏性末端〕：限制酶1：——↓GATC——；限制酶2：——CATG↓——；限制酶3：——G↓GATCC——；限制酶4：——CCGC↓GG——；限制酶5：——↓CCAGG——。

请指出以下哪组表达正确〔〕A．限制酶2和4识别的序列都包含4个碱基对B．限制酶3和5识别的序列都包含5个碱基对C．限制酶1和3剪出的黏性末端相同D．限制酶1和2剪出的黏性末端相同解析：限制酶2、3、4、5识别的序列分别包括4个、6个、6个、5个碱基对，故A、B错。

限制酶1和2切割产生的黏性末端不同。

限制酶1剪出的黏性末端是：—C T A G，限制酶2剪出的黏性末端是：—C A T G，限制酶3切割产生的黏性末端是:—C T A G，故D错。

答案 C二、酶切方法的选择构建重组质粒，需要用限制酶分别切割含目的基因的DNA片段和质粒，切割方法主要有单酶切和双酶切。

限制酶选择的三大依据1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类图1(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ(目的基因两端均具PstⅠ)。

(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。

(2)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和Eco RⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)，而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。

2.根据质粒的特点确定限制酶的种类(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。

(2)质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图2中限制酶pstⅠ因其会破坏该质粒上唯一的标记基因而不宜选择。

(3)所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点(如图2中KpnⅠ)。

如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段——若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

(4)所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图2中Hin dⅢ会破坏启动子，Eco RⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和Bam HⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。

3.参照Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，从而实现“转化”。

如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，获得含目的基因的片段。

若利用该片段构建基因表达载体，则甲～丁四种Ti质粒中宜选择“丙”作载体，而不宜选择甲、乙、丁。

(分析如下)1.(2016·全国卷Ⅲ，40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了Eco RⅠ、Bam HⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的Eco RⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。

限制酶选择的三大依据1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类图1（1）应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择PstⅠ（目的基因两端均具PstⅠ）。

（2）不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择SmaⅠ。

（2）为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和Eco RⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。

2.根据质粒的特点确定限制酶的种类（1）所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。

（2）质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图2中限制酶pstⅠ因其会破坏该质粒上唯一的标记基因而不宜选择。

（3）所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点（如图2中KpnⅠ）。

如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段——若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

（4）所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图2中Hin dⅢ会破坏启动子，Eco RⅠ会破坏终止子，而NdeⅠ和Bam HⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。

3.参照Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶若质粒上标出T－DNA片段，则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中，从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——因为Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上，从而实现“转化”。

如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ（两种酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，获得含目的基因的片段。

若利用该片段构建基因表达载体，则甲～丁四种Ti质粒中宜选择“丙”作载体，而不宜选择甲、乙、丁。

（分析如下）1.（2016·全国卷Ⅲ，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了Eco RⅠ、Bam HⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的Eco RⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。

基因工程常见限制酶识别虚列
基因工程中常见的限制酶有很多种，它们是一类能够识别特定DNA序列并在该序列上切割的酶。

这些限制酶在基因工程中起着至关重要的作用，可以用于DNA片段的定向切割、连接和修饰，从而实现对基因组的改造和重组。

常见的限制酶包括EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI等。

EcoRI是一种由大肠杆菌产生的限制酶，它能够识别并切割DNA 序列GAATTC，产生粘性末端。

BamHI也是一种常用的限制酶，它识别并切割DNA序列GGATCC，同样产生粘性末端。

HindIII则识别并切割AAGCTT序列，同样产生粘性末端。

XhoI则识别CTCGAG序列并切割DNA，同样产生粘性末端。

这些限制酶的识别序列和切割方式各不相同，因此在基因工程中可以根据需要选择合适的限制酶来进行DNA片段的定向切割和连接。

同时，这些限制酶也可以用于构建重组DNA、载体的构建以及基因的插入和删除等操作。

除了上述常见的限制酶外，还有许多其他限制酶，它们各自具有特定的识别序列和切割方式，为基因工程提供了丰富的工具和手
段。

在实际操作中，科研工作者可以根据实验需求选择合适的限制酶，从而实现对DNA序列的精确操作和改造。

总之，限制酶在基因工程中发挥着重要作用，为基因组编辑和重组提供了有力的技术支持。

高中生物：限制酶知识点限制酶是一种在分子生物学领域中广泛使用的工具，它在DNA分析和基因工程中起着重要的作用。

本文将介绍限制酶的定义、作用机制、分类以及在实验室中的应用。

一、定义限制酶，又称为切割酶，是一类能够识别特定DNA序列并将其切割为特定片段的酶。

它们是一类天然存在于细菌和古菌中的酶，用于保护细菌免受入侵的外源DNA（例如噬菌体）的攻击。

二、作用机制限制酶通过识别特定的DNA序列，称为限制性核酸位点（restriction sites），并在该位点上切割DNA链。

限制酶能够识别的核酸位点通常是对称的，例如5’ - GAATTC - 3’和3’ - CTTAAG - 5’，它们在正反两条链上具有相同的序列。

当限制酶识别到这样的位点时，它会切割DNA链，产生两个断裂的DNA链。

三、分类根据限制酶的作用机制和识别位点的序列，限制酶可以分为不同的类别。

常见的限制酶有： 1. I型限制酶：这类限制酶能够识别DNA序列，但切割位点并不紧邻其识别位点。

它们通常需要辅助蛋白质的帮助来完成切割作用。

2. II型限制酶：这类限制酶能够直接识别并切割DNA链。

它们识别的核酸位点通常是对称的，并且切割位点在限制性核酸位点的附近。

II型限制酶是最为常见和广泛应用的限制酶。

3. III型限制酶：这类限制酶与I型限制酶类似，也需要辅助蛋白质来完成切割作用。

它们与I型限制酶的主要区别在于，识别位点和切割位点之间存在一定的距离。

四、实验室应用限制酶在实验室中被广泛应用于分子生物学和基因工程领域。

以下是一些常见的应用： 1. DNA切割：限制酶可以用于将DNA切割为特定的片段。

通过使用不同的限制酶组合，可以得到不同长度的DNA片段，用于DNA分析和构建基因库等。

2. DNA连接：限制酶也可以用于将不同的DNA片段连接起来。

通过选择适当的限制酶和连接酶，可以将不同的DNA片段组装成目标序列。

3. DNA标记：有些限制酶能够在切割DNA链的同时，在切割位点的末端引入特定的序列（例如蛋白质识别位点或荧光标记）。

第1讲基因工程和细胞工程[考纲要求] 1.基因工程的诞生(Ⅰ)。

2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)。

3.基因工程的应用(Ⅱ)。

4.蛋白质工程(Ⅰ)。

5.植物的组织培养(Ⅱ)。

6.动物细胞培养与体细胞克隆(Ⅱ)。

7.细胞融合与单克隆抗体(Ⅱ)。

8.实验：DNA的粗提取与鉴定。

1．基因工程(1)基因工程的3种基本工具①限制性核酸内切酶：识别特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子。

②DNA连接酶：a.E·coli DNA连接酶只能连接黏性末端；b.T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端。

③载体：需具备的条件包括：a.能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；b.有一个至多个限制酶切割位点；c.具有特殊的标记基因，以便对含目的基因的受体细胞进行筛选。

(2)获取目的基因的途径：①从基因文库中获取；②利用PCR技术扩增；③化学方法直接人工合成。

(3)基因表达载体的组成：启动子、目的基因、终止子及标记基因等。

(4)将目的基因导入受体细胞①植物：体细胞或受精卵——常用农杆菌转化法(双子叶植物和裸子植物)、花粉管通道法、基因枪法(单子叶植物)。

②动物：受精卵——显微注射技术。

③微生物：细菌(常用大肠杆菌)——感受态细胞法(钙离子处理法)。

(5)目的基因的检测与鉴定方法①检测目的基因是否插入转基因生物的DNA上：DNA分子杂交技术。

②检测目的基因是否转录出mRNA：分子杂交技术。

③检测目的基因是否翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术。

④个体生物学水平鉴定：根据表达性状判断。

易混辨析①限制酶≠DNA酶≠解旋酶限制酶的作用是识别双链DNA分子上某种特定的核苷酸序列，并使两条链在特定的位置断开；DNA酶的作用是将DNA水解为基本组成单位；解旋酶的作用是将DNA两条链间的氢键打开形成两条单链。

②DNA连接酶≠DNA聚合酶DNA连接酶能连接两个DNA片段，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。

如何选择限制酶、重组DNA的筛选等1．（2023江苏高三统考）基因敲除是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失，从而使部分功能被屏蔽的技术。

来源于λ噬菌体的Red同源重组系统由λ噬菌体的exo、bet、gam3个基因组成，分别编码EXO、BET、GAM3种蛋白质，可用于大肠杆菌等一系列工程菌的基因敲除。

Red同源重组技术要用到质粒pKD46，该质粒含有温度敏感型的复制起点oriR101，在30℃培养时可以正常复制，而高于37℃时会自动丢失；由ParaB启动子调控的exo、bet、gam基因，需要L-阿拉伯糖诱导表达。

λ-Red系统介导的基因敲除过程如下图所示。

请回答下列问题：（1）EXO为双链核酸外切酶，可以结合在双链DNA的末端，从5′向3′降解DNA单链，产生_____（选填“3′或5′”）黏性末端；BET结合在EXO外切产生的末端单链上，促进其与受体细胞的靶序列进行同源重组，替换靶基因；GAM蛋白能够抑制受体细胞内核酸外切酶活性，进而_____（选填“抑制”或“促进”）受体细胞对外源DNA的降解。

（2）要将pKD46导入大肠杆菌，首先需用Ca2+处理大肠杆菌，目的是_________________________。

为使pKD46在细菌内正常复制、Red重组酶正常合成，必需满足的培养条件是___________________。

过程I是用含有青霉素的培养基筛选成功导入了pKD46的大肠杆菌，说明_____________________。

（3）用PCR技术扩增卡那霉素抗性基因时，同时需考虑将大肠杆菌基因组DNA上特定靶基因敲除。

图中含HAⅠ的引物由两部分组成，其中HAⅠ的碱基序列应该与_________________的碱基序列相同，另一部分应该与_______________________相应链上的碱基互补。

（4）为筛选出同源重组成功的大肠杆菌（靶基因被敲除），过程II使用的培养基必须含有________，然后再通过在____________________条件下培养，把质粒pKD46除去。