基金项目:本课题受国家重点基础研究发展计划(973计划)课题资助(编号:2010CB912802)第一作者简介:景坤玉，硕士研究生，研究方向:肿瘤标志物与基因工程。E-mail:jky19@163．com通讯作者:薛乐勋，教授，从事肿瘤分子生物学研究。E-mail:xuelx@zzu．edu．cn;郭明洲，研究员，从事消化道肿瘤表观遗传学研究。E-mail:mzguo1@gmail．comDNA甲基化在结直肠癌诊疗中的应用前景景坤玉1，2，薛乐勋1，郭明洲21．郑州大学生物工程系，河南郑州450001;2．中国人民解放军总医院消化科【摘要】目前认为结直肠癌的发生是在环境因素的作用下通过遗传学和表观遗传学的累积性改变所致。表观遗传学修饰，特别是基因启动子区域的DNA甲基化，被认为是肿瘤中普遍发生的分子改变。因此可通过检测基因的异常甲基化等表观遗传学改变对结直肠癌进行预防、早期诊断、临床治疗及预后评价。本文论述了结直肠癌相关基因甲基化状态的研究进展以及表观遗传学的临床应用，目的在于探讨表观遗传学在结直肠癌早期诊断及治疗中的意义。【关键词】结直肠癌;表观遗传学;DNA甲基化;组蛋白修饰;非编码RNA中图分类号:R735．3+4文献标识码:A文章编号:1006－5709(2011)03－0201－05收稿日期:2010-11-06ForegroundofDNAmethylationindiagnosisandtherapyofcolorectalcancerJINGKunyu1，2，XUELexun1，GUOMingzhou21．DepartmentofBioengineering，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001;2．DepartmentofGastroenterology，Chi-nesePLAGeneralHospital，China【Abstract】Colotectalcancerarisesasaconsequenceoftheaccumulationofgeneticandepigeneticalterationsinco-lonicmucousepithelialcells．Epigeneticchanges，particularlyDNAmethylationisrecognizedascommonmolecularal-terationsinhumantumors．Itmaybeusedascolorectalcancerdetectionorprognosismarkers．Inthisreview，wesum-marizedthecharacteristicsofepigeneticchangesandclinicalapplicationsincolorectalcancer．【Keywords】Colorectalcancer;Epigenetics;DNAmethylation;Histonemodification;Non-codingRNA结直肠癌(colorectalcancer)是消化道中最常见的恶性肿瘤之一，是大肠黏膜上皮在环境致癌因素作用下通过遗传学和表观遗传学的改变而发生的恶性病变。如食物中的高脂肪、肠道的慢性炎症等因素都是结直肠癌的高危因素。癌基因的激活与抑癌基因的失活是肿瘤发生的分子基础。大量研究表明，表观遗传学修饰调控肿瘤相关基因的异常表达［1］，是结直肠癌发生和发展中的主要机制之一。表观遗传学的改变，特别是DNA甲基化异常也是用于结直肠癌早期诊断、预后和化疗敏感性评估的指标。1表观遗传学表观遗传学(epigenetics)是一门研究基因表达的学科，它是指基因表达的遗传学变化不依赖于核苷酸序列的改变，而是依赖于DNA和组蛋白的修饰［2-4］。表观遗传学改变主要包括DNA甲基化(DNAmethyla-tion)、组蛋白修饰(histonemodification)、基因组印记(genomicimpriting)和非编码RNA(Non-codingRNA)等。任何一个方面的异常都可能影响染色质的结构和基因表达，导致疾病的发生。与基因突变不同，表观遗传学的改变在一定条件下可以逆转，这就为疾病的治疗提供了新的思路［5］。2DNA甲基化与结直肠癌2．1DNA甲基化DNA甲基化是一种最常见的表观遗传学修饰方式，在DNA甲基转移酶(DNAmethyl-transferase，DNMT)的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤(CpG)二核苷酸的胞嘧啶5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytosine，m5C)［6］。CpG常成簇存在于真核生物基因组内，称为CpG岛(CpGisland)，通常长度约为1～2kb。大约50%的人类基因中含有CpG岛，多位于基因上游调控区的启动子中。在正常组织中，CpG岛甲基化与胚胎发生及分化成熟以及某些等位基因的特异失活有关，如X染色体失活。甲基化CpG结合蛋白(methyl-CpGbindingprotein)选择性地特异结合于甲基化DNA导致染色质结构改变，阻止转录因子与启动子结合从而抑制基因的转录［3］。2．2结直肠癌相关基因异常甲基化肿瘤细胞中DNA甲基化状态异常，表现为基因组整体甲基化水平降低和特异性基因启动子区域CpG岛甲基化水平异常增高。多数癌组织中整个基因序列的低甲基化是由约占人类基因组40%的重复序列低甲基化所引起的，这些DNA重复序列包括:异染色质DNA重复、散在逆转录转座子和内源的逆转录病毒元件。DNA异常甲·102·胃肠病学和肝病学杂志2011年3月第20卷第3期ChinJGastroenterolHepatol，Mar2011，Vol.20，No.3基化可以促进肿瘤相关基因的突变和异常表达，一些抑癌基因由于启动子区的甲基化而使该基因表达缺失从而导致肿瘤的发生［7］。2．3DNA损伤修复相关基因MGMTO6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanineDNAmethyl-transferase，MGMT)是一种高效DNA损伤修复基因，在烷化剂所致的DNA损伤修复以及抑制肿瘤发生中发挥重要作用。Hawkins等［8］报道结直肠癌中MGMT启动子异常甲基化率为28%，而在相应的正常结肠黏膜中低甲基化。表明MGMT基因启动子区甲基化可能是其失活的重要原因之一。此外，MGMT甲基化与DNKN2A甲基化及KRAS突变具有相关性。表明这些基因座可能是表观遗传学异常调节机制的一个共同标志物。2．4细胞周期调控相关基因CDKN2A/P16细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKN2A/P16)是INK4(inhibitorofCDK4)家族成员，位于染色体9q21。具有锚蛋白重复序列(ankyrinrepeat)，能够抑制cyclin-D相关激酶的活性，与cyclin-D竞争结合CDK4亚单位，使非正常细胞被阻滞于G1晚期，阻止其进入S期而被诱导凋亡，在多种肿瘤中发挥抑癌基因的作用。CpG岛高度甲基化介导其表达缺失可影响细胞周期、增殖、凋亡等功能，在肿瘤的发生中起重要作用。在结肠隐窝病变、结肠腺癌、增生息肉及进展期的腺癌中观测到CDKN2A/P16异常甲基化，表明CDKN2A/P16启动子CpG岛甲基化发生在早期的癌前病变中。MGMT、CDKN2A/P16启动子在结直肠腺瘤和腺癌中均发生异常甲基化，并且在从腺瘤到癌发展过程中其等位基因甲基化比例增加，表明其可能在结直肠癌的发生和进展过程中起关键作用。DNA甲基化发生在腺瘤癌变过程的早期提示，检测组织中MGMT、CDKN2A/P16基因启动子的异常甲基化可以作为肿瘤早期诊断的一项指标。2．5细胞凋亡相关基因CMTM3CMTM3(CKLF-likeMARVELtransmembranedomain-containingmember3)是趋化素样因子超家族成员，与趋化因子和跨膜4超家族蛋白相连接，定位于染色体16q22．1。Wang等［9］发现CMTM3在正常上皮细胞和组织中不发生甲基化或低甲基化且广泛表达，而在27%的原发性结直肠癌中发生甲基化，并且在结肠癌细胞系和组织中的表达缺失或下调与其启动子区域CpG岛甲基化状态相对应，用5-aza-2-deoxycytidine处理细胞能恢复其表达。表明CMTM3甲基化导致其基因表达缺失或下调。另外还发现CMTM3通过激活细胞凋亡蛋白酶-3(caspase-3)来抑制肿瘤细胞生长并诱导细胞凋亡，表明CMTM3在细胞中发挥抑癌基因的作用。2．6细胞黏附侵袭相关基因CDH3和CD133多数受表观遗传学调控的肿瘤相关基因在肿瘤中呈过度甲基化状态，而DNA异常低甲基化同样与肿瘤的发生和发展具有相关性，整体基因组的低甲基化，能够导致先前沉默基因的激活，被普遍认为是一个全基因组事件。可能促进结直肠腺瘤恶变为结直肠癌并且加速晚期结肠癌的转移。胎盘钙黏蛋白(CDH3/P-cadherin)是钙黏连蛋白超家族成员，主要分布于人胚胎的某些上皮组织和胎盘，介导Ca2+依赖性的细胞同型黏附，并与肿瘤浸润转移有关。Hibi等［10］研究发现77%的原发性结直肠癌中发生CDH3异常去甲基化，并与肿瘤发生部位和Dukes'分期具有显著相关性。CDH3启动子去甲基化导致其在结直肠腺瘤早期开启表达，并且更加频繁地出现在晚期结直肠癌，提示CDH3的去甲基化伴随结直肠黏膜由癌前病变到浸润性肿瘤的全过程。CD133蛋白是多种干/祖细胞的表面标志物之一，最先在人类造血干/祖细胞上发现并且在多种肿瘤干细胞(tumorstemcell，TSC)中均有表达的一种跨膜糖蛋白。Hibi等［11］研究发现40%的原发性结直肠癌中发生CD133异常去甲基化，而在晚期结直肠癌中更加频繁地出现并且具有优先向淋巴结转移的趋势，表明CD133表达可能受到表观遗传学的调控，并且在结直肠癌发生和发展中起一定作用。CDH3和CD133在晚期结直肠癌中更加频繁去甲基化，提示其可以作为一种分子筛查标记，对晚期结直肠癌病人的诊断和预后具有重要参考价值。2．7细胞免疫应答相关蛋白IL-6白细胞介素6(in-terleukin-6，IL-6)主要可由T细胞、B细胞、造血干细胞和巨噬细胞等多种细胞分泌，是机体免疫网络中最重要的细胞因子，在炎症反应和免疫应答过程中具有重要作用，如参与炎症性损伤过程、刺激细胞生长、诱导细胞分化和促进细胞急性期蛋白合成。某些急性炎症、自身免疫性疾病以及淋巴细胞恶性肿瘤等与IL-6水平异常增高有关。Foran等［12］研究显示，与散发的结直肠癌相比，DNMT1在具有肠道炎症的癌周组织和肿瘤中高表达。提示DNMT介导基因沉默可能在伴有炎症的结肠癌发生中具有重要作用。IL-6处理结直肠癌细胞诱导DNMT1表达增加，从而导致抑癌基因、黏着和凋亡耐受基因启动子区域甲基化而表达下降。用一种DNMT1抑制剂5-azadeoxycytidine预处理能有效阻止IL-6的效应。2．8激素-受体调节相关基因2．8．1ACVR2:激活素受体2(Activinreceptor2，ACVR2)属于TGF-β超家族的Ser/Thr激酶型受体，定位于染色体2q22．3。与激活素特异结合后激活Ⅰ型·202·胃肠病学和肝病学杂志2011年3月第20卷第3期ChinJGastroenterolHepatol，Mar2011，Vol.20，No.3受体，再通过Smad蛋白家族的级联反应将信号传入胞核。ACVR2通常在微卫星不稳定(MSI)结肠癌中发生突变，导致基因表达的缺失、信号通路的阻断及肿瘤体积的增大。而Jung等［13］发现14%的MSS结肠癌ACVR2表达缺失伴随LOH和启动子区域高甲基化而没有发生突变。在ACVR2启动子区域完全甲基化的结肠癌细胞系中用5-Aza处理能恢复其在转录水平和蛋白水平的表达，揭示启动子区高甲基化是其表达缺失的主要原因，在两种结直肠癌亚型中表达缺失分别受到遗传学和表观遗传学两种机制的调控。2．8．2IGFBP7:胰岛素样生长因子结合蛋白7(insu-lin-likegrowthfactorbindingprotein7，IGFBP7)是胰岛素样生长因子结合蛋白超家族(IGFBPs)成员，它能与胰岛素样生长因子(IGFs)结合并调控其活性。IG-FBP7可参与多种类型组织细胞的生长、发育、分化衰老与癌变，P53通过结合到其内含子区的应答元件中诱导其在人体内多种组织、器官中广泛表达。Suzuki等［14］发现在结直肠癌细胞系中，IGFBP7表达沉默与DNA高甲基化和组蛋白H3K4低甲基化具有相关性。用5-aza-2-deoxycytidine处理能够恢复P53诱导的IG-FBP7的表达，提示DNA异常甲基化在其表观遗传学修饰中起主要作用。IGFBP7在原发性结直肠癌中甲基化水平比正常结肠组织中显著增高(P＜0.001)，并与BRAF突变、P53突变缺失和CIMP具有相关性，提示IGFBP7的表观遗传学沉默可能在CIMP亚型的结直肠癌形成过程中具有重要作用，使细胞逃避P53诱导的衰老和凋亡而恶变，并能在CIMP结直肠癌作为一种可能的分子标志物，对CIMP亚型结直肠癌的诊断和治疗具有重要意义。2．8．3ER2:雌激素受体2(estragenreceptor2，ER2)是核受体超家族成员，定位于染色体14q23．2，介导雌激素的多向效应，在各种发育和生理过程中有着广泛的作用，通过直接或间接的方式与特异DNA位点结合而发挥转录效应。Zhai等［15］研究显示，恢复ER2基因在结肠癌细胞系中表达导致PR、C-fos出现不同程度的去甲基化，而在mRNA水平表达显著提高。与Dnmt3a和Dnmt3b表达升高相反，Dnmt1、HMT和hM-LH1的mRNA表达显著降低(P＜0.05)。表观遗传学修饰基因和人类错配修复基因表达水平和活性同时发生改变，提示ERbeta通过介导其下游通路相关靶基因去甲基化激活，从而调控雌激素转导信号通路在结肠癌细胞中的作用。2．9其他相关基因2．9．1SBP1:硒结合蛋白1(selenium-bindingprotein1，SBP1)是硒结合蛋白家族成员，定位于染色体1q21-22。在硒元素摄入量增加的情况下，SBP1表达增高有利于增强机体的抗癌能力。SBP1在多种肿瘤中表达显著下调。Pohl等［16］研究显示SBP1启动子在结肠癌组织和人结肠癌细胞中高度甲基化。用5'-Aza-2'-deoxycytidine处理人结肠癌细胞，导致SBP1启动子去甲基化并增加SBP1启动子的活性，恢复SBP1mRNA和蛋白水平的表达。提示CpG岛甲基化在SBP1的表达下调中起主要作用。同时，SBP1过表达使结肠癌细胞对H2O2诱导凋亡敏感，体外实验中抑制癌细胞迁移并在裸鼠中抑制肿瘤的生长。揭示SBP1具有肿瘤抑制作用，在结直肠癌中由于表观遗传学沉默而失活，具有成为一种结直肠癌临床预后评价指标的潜质。2．9．2PTPRR:蛋白质酪氨酸残基的可逆磷酸化是正常生命活动和疾病转归中的关键机制，其磷酸化水平受酪氨酸激酶(PTKs)和酪氨酸磷酸酶(PTPs)的共同调节。PTPs作为一种信号分子，在细胞生长、分化、细胞周期、基因转录、离子通道的活性、免疫应答和癌变等多种生命活动过程中具有重要调节作用。受体型酪氨酸蛋白磷酸酶R(theproteintyrosinephosphatasere-ceptortypeRgene，PTPRR)是一种蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)的家族成员。Menigatti等［17］报道PTPRR-1转录起始位点的频繁发生重新甲基化，在结直肠腺瘤中为80%，在结直肠腺癌中为95%，而在发生肝转移的晚期肿瘤中为100%，并且组蛋白尾部的转录抑制标志物H3K27me3大量富集，提示PTPRR-1在结直肠癌中表达失活是CpG岛频繁重新甲基化和组蛋白甲基化修饰的结果。与正常黏膜水平相比，主要的PT-PRR可变转录本在癌前病变和浸润性结直肠癌以及结直肠癌细胞系中均显著降低，并且在细胞转化的初期便开始显著下调。提示表观遗传学下调PTPRR的表达是结直肠癌细胞转化早期的一种改变，这种改变伴随肿瘤发生的进程，可能对RAS/RAF/MAPK/ERK信号通路的初步激活起促进作用。3组蛋白修饰与结直肠癌3．1组蛋白修饰(histonemodification)组蛋白修饰是一种更为复杂的表观遗传学调控方式，在转录水平和转录后水平调控基因的表达。修饰靶点多位于核心组蛋白伸出核小体的N端尾部氨基酸残基，主要包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化、sumo(smallubiq-uitin-relatedmodifier)化和ADP-核糖基化等［18］。可逆乙酰化是最为主要的动态修饰，组蛋白乙酰基转移酶(histoneaceytltransferase，HAT)将乙酰-CoA的乙酰基转移到组蛋白N端尾部特定Lys残基上，引起染色质结构松弛，使启动子易与转录调控元件接近，从而激活特定基因的转录;组蛋白去乙酰化酶(histonedeacety-·302·胃肠病学和肝病学杂志2011年3月第20卷第3期ChinJGastroenterolHepatol，Mar2011，Vol.20，No.3
中国结直肠癌诊疗规范（2017版）
文章来源：中华胃肠外科杂志, 2018,21(1)
结直肠癌是中国最常见的恶性肿瘤之一，在2012年诊断的全球136万例结直肠癌中，中国结直肠癌的新发病例数达到25.3万例，占全球结直肠癌新发病例的18.6%，中国是全球结直肠癌每年新发病例数最多的国家，已经成为严重影响和威胁我国居民身体健康状况的一大难题。
2013年，国家卫计委委托中华医学会肿瘤学分会组织结直肠癌领域的专家撰写了《中国结直肠癌临床诊疗规范》（简称《规范》）并公开发布。《规范》发布之后对我国结直肠癌诊疗意义重大，影响深远。近些年，随着对该《规范》不断地深入理解和应用，国家卫生和计划生育委员会曾先后组织专家对《规范》进行了3次修订：2013年版推荐是当时国家卫计委组织的第一个恶性肿瘤单病种的诊疗规范；2015年进行了第2次修订；2017年进行了第3次修订。内容涉及结直肠癌的影像学检查、病理评估、外科、内科和放疗等多学科综合治疗手段等方面。2017年版《规范》既参考了国际的指南的内容，更结合了中国的具体国情和临床实践，同时囊括了近些年来我国结直肠领域的重要进展和许多自己的循证学临床数据。本刊在刊登2017版《规范》的同时，为使各位从事结直肠癌诊疗的临床医生对新版《规范》的更新有更全面和立体的认识，现将新版《规范》的主要修订内容按照其在《规范》中出现的先后顺序进行进一步说明。 一、影像学检查
《规范》2017版较前版做了较大幅度的修改及补充，不再局限于影像学检查方法层面，而是涉及到结直肠癌检查及诊断治疗评价中的各个环节。同时，由于结肠癌、直肠癌发病部位及生物学行为的内在差异，将前版指南中结直肠癌拆分为结肠癌和直肠癌，分别陈述各自的首选影像学检查方法和关键的影像学评价内容。
具体更新内容：
（1）影像方法的选择：分别推荐了针对结肠癌原发灶、直肠癌原发灶的最佳影像学检查方法；同时也针对不同部位转移瘤，推荐了最佳的影像学检查方法；
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结直肠规范化诊治指南
目 录
第一章 概述
第二章 诊断技术与应用
第三章 病理评估
第四章 外科治疗规范
第五章 内科治疗规范
第六章 直肠癌放射治疗规范
第七章 结直肠癌肝转移治疗规范
第八章 局部复发直肠癌的治疗规范
第九章 肠造口康复治疗
第十章 随访
附 录 诊疗流程图 99 第一章 概述
我国结直肠癌（colorectal cancer,CRC）的发病率和死亡率仍然在上升，每年新发病例已超过17万，死亡近10万。在临床上就诊的大多数属中晚期病例；目前在我国对结直肠癌的治疗除中国抗癌协会大肠癌专业委员会制定的行业规范以外，还有美国NCCN（National
Comprehensive Cancer Network）每年发布的结直肠癌临床实践指南等。这些指南对结直肠癌的治疗有着一定的指导意义。但是到目前为止，结直肠癌的诊断和治疗仍然存在许多问题，在实际应用中，我们也发现由于我国的国情、地域环境和经济状况以及医疗卫生事业发展水平的不平衡，无论是现行的行业规范还是NCCN的结直肠癌治疗指南，对指导我国各级医院的结直肠癌的治疗方面存在较大差距。为此，卫生部医政司委托中华医学会外科学会、中国抗癌协会组织专家根据国际结直肠癌的治疗趋势和要求，结合我国目前临床肿瘤学的发展水平和当前卫生事业发展的现状，以专家共识为基础制订一套具有先进性、科学性、实用性和可操作性的结直肠癌诊治规范，由卫生部在全国范围内作为行业规范加以推广实施，促进我国CRC治疗走向规范化、科学化，本规范将作为卫生行政条例指导各级各类医院中结直肠癌的诊治，让结直肠癌病人从规范的治疗中获益，节省有限的医疗资源，是新时期全面落实科学发展观，实现“以人为本”的服务理念的一个重大举措。
1．1我国结直肠癌流行趋势
1．随着人民生活水平的不断提高，饮食习惯和饮食结构的改变以及人口老龄化，我国结直肠癌的发病率逐渐增高，已跃居第2～5位(上海自2004年起居第2位)，并仍呈逐步上升趋势，尤以结肠癌的发病率上升为著。
1 结直肠癌诊疗规范（2015年版）
一、概述
我国结直肠癌（colorectal cancer,CRC）的发病率和死亡率均保持上升趋势。2011年结直肠癌的发病率和死亡率分别为23.03/10万和11.11/10万。）其中，城市地区远高于农村，且结肠癌的发病率上升显著。多数患者发现时已属于中晚期。
为进一步规范我国结直肠癌诊疗行为，提高医疗机构结直肠癌诊疗水平，改善结直肠癌患者预后，保障医疗质量和医疗安全，特制定本规范。
二、诊断技术与应用
（一）临床表现。
早期结直肠癌可无明显症状，病情发展到一定程度可出现下列症状：
1．排便习惯改变。
2．大便性状改变（变细、血便、黏液便等）。
3．腹痛或腹部不适。
4．腹部肿块。
5．肠梗阻相关症状。
6．贫血及全身症状：如消瘦、乏力、低热等。
（二）疾病史和家族史
1．大肠癌发病可能与以下疾病相关：溃疡性结肠炎、 2 大肠息肉病、大肠腺瘤、Crohn病、血吸虫病等，应详细询问患者相关病史。
2. 遗传性大肠癌发病率约占总体大肠癌发病率的6%左右，应详细询问患者相关家族病史：遗传性非息肉病性结直肠癌，家族性腺瘤性息肉病，黑斑息肉综合征、幼年性息肉病。
（三）体格检查。
1．一般状况评价、全身浅表淋巴结情况。
2．腹部视诊和触诊，检查有无肠型、肠蠕动波、腹部肿块。
3．直肠指检：凡疑似结直肠癌者必须常规作肛门直肠指检。了解直肠肿瘤大小、质地、占肠壁周径的范围、基底部活动度、距肛缘的距离、肿瘤向肠外浸润状况、与周围脏器的关系、有无盆底种植等。指检时必须仔细触摸，避免漏诊；触摸轻柔，切忌挤压，观察是否指套血染。
（四）实验室检查。
1．血常规：了解有无贫血。
2．尿常规：观察有无血尿，结合泌尿系影像学检查了解肿瘤是否侵犯泌尿系统。
3．大便常规：注意有无红细胞、脓细胞。
4．粪便隐血试验：针对消化道少量出血的诊断有重要价值。 3 5．生化及肝功能。
6．结直肠癌患者在诊断、治疗前、评价疗效、随访时必须检测CEA、CA19-9；有肝转移患者建议检测AFP；疑有卵巢转移患者建议检测CA125。
