PCR和RT-PCR(11-12章)

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rtpcr原理

rtpcr原理RT-PCR原理。

RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种将RNA转录成cDNA，然后再进行PCR扩增的技术。

它是PCR技术的一个变种，常用于检测RNA病毒、研究基因表达等领域。

下面将详细介绍RT-PCR的原理。

首先，RT-PCR的第一步是将RNA转录成cDNA。

这一步需要使用逆转录酶（Reverse Transcriptase）来完成。

逆转录酶能够将RNA模板上的核糖核酸序列转录成互补的DNA序列。

在这一步中，需要加入一条引物（primer），它会与RNA模板上的特定序列结合，作为逆转录酶合成cDNA的起始点。

接下来，转录生成的cDNA会作为PCR的模板进行扩增。

PCR扩增是通过DNA聚合酶（DNA Polymerase）在不断变换的温度下进行的。

首先是变性，将双链DNA变性为两条单链DNA。

然后是退火，引物与模板DNA结合。

最后是延伸，DNA聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。

这样，经过多轮循环，就可以将少量的RNA扩增成大量的DNA。

RT-PCR的原理可以通过以下几个关键步骤来概括，首先是逆转录，将RNA转录成cDNA。

然后是PCR扩增，通过多轮循环将cDNA扩增成大量的DNA。

最终，可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法来检测扩增产物。

RT-PCR的原理在实际应用中有着广泛的意义。

例如，在病毒检测中，可以通过RT-PCR来检测病毒RNA，从而进行病毒的早期诊断和监测。

在基因表达研究中，可以通过RT-PCR来检测特定基因的mRNA水平，从而了解基因的表达情况。

此外，RT-PCR还可以用于克隆特定基因、分析基因多态性等领域。

总的来说，RT-PCR是一种重要的分子生物学技术，其原理简单清晰，应用广泛。

通过将RNA转录成cDNA，然后再进行PCR扩增，可以快速、准确地检测目标RNA的存在，从而在医学诊断、基因表达研究等领域发挥重要作用。

pcr种类和原理

PCR种类和原理引言聚合酶链反应（PCR）是一种基因分析技术，广泛应用于分子生物学领域。

通过PCR，可以在短时间内扩增一小段DNA序列，从而方便进行基因检测、DNA测序等相关操作。

本文将介绍PCR的种类和原理。

PCR的种类PCR根据特定的用途和反应条件的不同，可以分为以下几种不同类型：标准PCR标准PCR是PCR的最基本形式，包括三个步骤：变性、退火和延伸。

在变性步骤中，将PCR反应体系中的DNA序列加热至高温，使其两个链解开。

然后，降温至一定温度，使引物（寡核苷酸）与DNA序列的两个链的末端结合。

最后，在合适的温度下，通过DNA聚合酶，使DNA序列的两个链延伸。

逆转录PCR逆转录PCR（RT-PCR）是一种将RNA转录成DNA的反应。

通过使用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后进行PCR扩增，可以更方便地研究RNA的表达和变化。

定量PCR定量PCR（qPCR）是一种用于测量DNA序列数量的PCR技术。

通过引入荧光探针或染料，可以实时监测PCR反应的进行，并据此计算目标DNA序列的起始数量。

数字PCR数字PCR是一种通过将反应体系分成多个小区域，并进行单分子级别的PCR扩增，实现对DNA序列的精确计数的方法。

长PCR长PCR用于扩增较长的DNA序列。

通常，标准PCR技术在扩增1000个碱基以上的DNA序列时表现不佳，而长PCR通过优化反应条件，可以扩增数千个碱基以上的DNA 序列。

PCR的原理PCR的原理基于DNA的复制过程。

PCR反应体系主要包括DNA模板、引物、DNA 聚合酶和反应缓冲液。

下面是PCR反应的基本步骤：1.变性：将反应体系加热至95°C，使DNA模板的双链解开。

此步骤中，DNA模板上的两个链会分离开，形成两个单链模板。

2.退火：降温至较低的温度，使引物与模板DNA的单链序列互补结合。

每个引物在目标区域的两端结合。

3.延伸：在适当温度下，DNA聚合酶开始将引物作为起始点，向外延伸合成新的DNA链，形成与模板DNA互补的两条新的DNA链。

PCR技术原理ppt

• PCR反应用耐高温的 Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA 扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2~4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广
PCR基本原理
PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性 (Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension): DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。。
聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成 DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。
70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki （1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe 法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988 年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶，简称Taq DNA聚合酶。多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。

自己总结：透彻易懂pcr rt-pcr原理【最新】

自己总结：透彻易懂pcr rt-pcr原理【最新】PCR原理聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。

可看作生物体外的特殊DNA复制。

PCR这项技术，被广泛地运用在医学和生物学的实验室，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制以及亲子鉴定。

DNA 变性DNA denaturation : 加热或用碱处理双链DNA，使氢链断裂，结果DNA变成为单链，此称为DNA的变性。

发生这种变化时的温度称为融解温度，鸟嘌呤和胞嘧啶含量高的DNA融解温度也高。

由于变性的结果DNA的紫外线吸收增加，比旋光度和粘度降低，密度也增加。

如果在加热后慢慢冷却，则DNA可以再次恢复成双螺旋结构。

另外，外部压力也能使DNA变性.PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95?高温时变性会变成单链，低温(经常是60?C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72?C左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

引物(primer)，是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。

DNA聚合酶(DNApolymerase)是细胞复制DNA的重要作用酶。

DNA聚合酶,以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。

DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具备模板、引物、dNTP等的情况下)及其相辅的活性。

dNTP: deoxy-ribonucleoside triphosphate(三磷酸脱氧核糖核苷)的缩写。

rt-pcr原理

rt-pcr原理RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种常用的核酸检测技术，广泛应用于病毒检测、基因表达分析等领域。

本文将介绍RT-PCR的原理及其在实验室中的应用。

RT-PCR的原理主要包括逆转录（Reverse Transcription）和聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）两个步骤。

首先是逆转录，即将RNA转录成cDNA。

在这一步骤中，首先需要一种特殊的酶——逆转录酶，它能够将RNA模板上的信息转录成相应的cDNA。

逆转录过程中需要一段RNA引物（primer）作为起始序列，使逆转录酶能够在该位置开始合成cDNA链。

经过逆转录反应后，RNA被转录成了cDNA，为后续的PCR反应提供了模板。

接下来是聚合酶链式反应，即利用DNA聚合酶在适当的温度下，将cDNA模板进行扩增。

PCR反应需要两段DNA引物，它们分别位于所需扩增片段的起始和终止位置。

在PCR反应的循环中，先是将DNA双链解旋，然后引物与模板结合，随后DNA聚合酶开始在引物的引导下合成新的DNA链。

通过多次循环，可以在较短的时间内扩增出大量的目标DNA片段。

RT-PCR技术具有高灵敏度和高特异性的特点，适用于检测病毒、细菌等微生物的核酸。

在病毒检测中，RT-PCR能够对病毒RNA进行逆转录合成cDNA，然后通过PCR反应扩增出目标病毒基因片段，从而实现对病毒的快速检测。

此外，RT-PCR还可以用于分析基因的表达水平，通过检测特定基因的mRNA水平，可以了解该基因在不同组织、不同生理状态下的表达情况，为基因功能研究提供重要信息。

除了基本的RT-PCR技术外，还有一些衍生技术，如实时荧光定量PCR （qPCR）。

qPCR在PCR反应中加入荧光探针，可以实时监测PCR产物的扩增过程，从而获得准确的定量信息。

这种技术在基因表达分析、病毒定量检测等领域有着广泛的应用。

PCR及RT-PCR概述

PCR及RT-PCR一、目的掌握聚合酶链式反应(PCR) 及逆转录－聚合酶链式反应(RT-PCR)的基本方法二、原理PCR用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。

在由Taq DNA聚合酶催化的一系列合成反应中，使用两段寡核苷酸作为反应的引物。

一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板DNA 两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列又分别位于待扩增的两侧。

反应时它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的DNA 为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35 轮循环就可使DNA 扩增达106倍。

RNA的多聚酶链式反应（RT-PCR）是以RNA为模板，联合逆转录反应（reverse transcrip－tion, RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的特异DNA，为RNA病毒检测提供了方便；并为获得与扩增特定的RNA互补的cDNA提供了一条极为有利和有效的途径。

RNA扩增包括两个步骤：①在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补链cDNA；②加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA。

在RT-PCR中关键步骤是RNA的逆转录，cDNA的PCR与一般PCR条件一样。

由于引物的高度选择性，细胞总RNA无需进行分级分离，即可直接用于RNA的PCR。

但RT-PCR对RNA制品的要求极为严格，作为模板的RNA分子必须是完整的，并且不含DNA、蛋白质和其它杂质。

PCRqPCRRT-PCR的原理及应用

PCRqPCRRT-PCR的原理及应⽤⽣物的东西必须要主动去了解，否则视野容易受到限制，尤其是分⼦⽣物学的核⼼技术。

PCR - 聚合酶链式反应- YouTube⽬的：从DNA双链中扩增出感兴趣的区段，⽤于后续的研究。

原理：DNA结构，双螺旋，AT、GC配对；DNA双链在临界温度会解链，退⽕后⼜会恢复；引物，DNA复制的起点，之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已有的DNA链上。

操作核⼼：1. 引物设计，会考虑GC含量，决定退⽕温度；2. 变性、退⽕和延伸；PCR的应⽤ -1. Gene expression2. Genotyping (detection)3. Cloning4. Mutagenesis5. Methylation analysis6. Sequencing7. Medical, forensic, and applied sciences问题：1.真核⽣物的组蛋⽩会影响PCR吗？2.为什么需要前后引物，前后引物是如何p出指定区段的？3.PCR、qPCR和RT-PCR之间的区别和联系？PCR - 任何核酸序列RT-PCR 逆转录聚合酶链式反应 - 分析的是RNA，⼤部分是基因表达逆转录PCR，就是PCR的⼀个常规应⽤，我也跑过，见过庞⼤的机器，也是先设计引物，然后提cDNA，定量。

⼀条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板透过PCR进⾏DNA复制。

PCA我们是扩增DNA序列，⽽RT-PCR我们扩增的是反转录出来的cDNA序列，然后再做PCR，把量做上去来检测，通常会配上⼀些管家基因作为对照。

RT-PCR的数据分析可以参照Y数微信公众号，代码很详细。

qPCR (Quantitative Real-time PCR) 实时荧光定量PCR - 分析的是DNA实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是⼀种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的⽅法。

RT-PCR及其产物电泳分析ppt课件

③ 延伸延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度（70－75℃；延伸时间由扩增片段的长度决定（＜500bp 30s,500-1200bp 40s）。
④ 循环次数 PCR循环次数取决于模板DNA的浓度，一般为25－35次，PCR产物可达最大值。
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PCR体系的优化
➢ PCR反应成分浓度的优化 ① Taq DNA聚合酶：1～2.5U/100μL反应液。 ② dNTP浓度：20～200μmol/L，且四种底物浓度相等，以减少错误掺入的机
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RT反应试剂（1）引物： Oligo(dT)16，寡聚胸甘酸16个，要求mRNA有poly(A)尾巴（mRNA 1-4%）（2）逆转录酶：鼠白血病病毒莫洛尼株（MMLV）、鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV ）（3）RT反应缓冲液：常用5×浓度。（4）底物：即四种dNTP的混合物溶液，常用10×浓度（2 mmol/L或2.5 mmol/L）。（5）模板（6）RNasin
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实验原理
RT反应：在逆转录酶作用下，以mRNA为模板合成cDNA（complementary DNA）分子的过程。 PCR反应：PCR扩增是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶在体外扩增一对引物之间特异性DNA片段的方法。其主要热循环过程可分为三个步骤：（1）变性；（2）退火；（3）延伸。 RT-PCR: 以RT反应产物cDNA分子为模板进行特异性PCR扩增的过程，是检测基因表达最常用的方法。
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结果分析
M
1 23
观察结果： ① 是否有扩增产物。 ②如有拖尾或有几条区带,说明有非特异性扩增。 ③分子量标准电泳后区带是否分开。 ④与分子量标准比较，PCR产物的长度是否正确。 ⑤PCR产物的产量。 ⑥引物二聚体。

rt pcr原理

Real-time PCR（实时荧光定量PCR）原理解析1. 什么是PCR？PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种在体外扩增DNA片段的技术。

PCR的发明者是美国生物化学家基里尔·米隆尼斯（Kary Mullis），于1983年提出了这一方法。

PCR通过不断重复三个步骤来扩增目标DNA片段：变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Elongation）。

这些步骤在PCR仪中由多个温度循环来控制，因此PCR也被称为“温度循环扩增”。

PCR技术为科学家提供了一种快速、敏感、特异性极高的扩增目标DNA的方法。

然而，传统的PCR只能在反应结束后进行结果的检测，无法实时监测反应的过程。

为了解决这个问题，Real-time PCR技术应运而生。

2. 实时PCR概述实时PCR是在PCR扩增过程中，使用荧光信号实时监测反应的进行。

与传统PCR相比，实时PCR能够提供实时的、连续的照片剖析PCR的进展。

实时PCR有两种常用的检测方法：荧光染料法和探针法。

其中，探针法又分为TaqMan探针法和Molecular Beacon探针法。

这些探针和染料能够与PCR反应中的产物结合，并产生荧光信号，根据信号的增长情况可以推断目标DNA的含量。

实时PCR广泛应用于分子生物学、医学诊断、检测病原体等领域。

接下来，我们将重点介绍实时PCR的基本原理以及常用的探针法和荧光染料法。

3. 实时PCR基本原理实时PCR的基本原理和传统PCR类似，也是通过变性、退火和延伸三个步骤来扩增DNA片段。

然而，在实时PCR中，PCR反应是在热循环PCR仪中进行，并且扩增过程中的结果可以实时检测。

实时PCR一般需要使用一种独特的仪器，称为实时荧光PCR仪或荧光定量PCR仪。

这种仪器能够在不破坏试管密封的情况下，通过荧光信号实时检测PCR反应体系中的增长程度。

在实时PCR中，荧光信号通过专门的探测器（Detector）收集，并且荧光信号的强度会随着PCR反应进行的次数递增。

PCR与RT-PCR

RNaseH 产生的障碍 RNaseH 对第一链 cDNA 的影响。RNaseH 在 cDNA 合成期间降解 RNA:DNA 复合体中的 RNA。红色箭头代表潜在的酶切位点。
提高逆转录保温温度
较高的保温温度有助于 RNA 二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数 RNA
模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将 RNA 和引物在 65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用 ThermoScript 逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增（图 6）。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行 cDNA 合成时（见第三章）。如果使用 GSP，确保引物的 Tm 值与预计的保温温度相同。不要在高于 60℃时使用 oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到 60℃前在 25℃保温 10 分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将 RNA/引物混合物从 65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的 2×的反应混合物提高特异性（cDNA 热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用 PCR 仪可以简化 RT-PCR 所需的多种温度切换。
一般不必使用 oligo(dT)选择性分离 poly(A)+RNA。不管起始模板是总 RNA 还是 poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果（图 2）。另外，分离 poly(A)+ RNA 会导致样品间 mRNA 丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有 mRNA 时，poly(A)+ RNA 会增加检测的灵敏度。

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第十一章 PCR扩增产物表达的快速方法使用 Directional TOPO 表达试剂盒把克隆基因转入到表达载体，将节省你大量时间。这些试剂盒具有快速，高效的特点，Directional TOPO 克隆技术结合高效的 pET 和 pcDNA3.1 载体中，使你从 PCR 中立即得到表达结果。 • 成熟的技术 Directional TOPO 克隆技术将平整末端的单向克隆的 PCR 产物转入 pET 或 pcDNA3.1 载体，使用 Directional TOPO 克隆表达试剂盒将使你：节省时间——TOPO 克隆 PCR 产物只需要 5 分钟。得到高质量的克隆结果——大于 90%的重组克隆表达出正确的排列。完成高水平表达——载体携带强大的表达启动子。 • 节省工作时间 Directional TOPO 克隆试剂盒用拓朴异构酶Ⅰ代替了连接酶，传统的限制性内切酶过夜孵育的克隆方法被只需 5 分钟的拓朴异构酶介质连接的方法代替，这样大缩短了你的工作时间。 pET 和 pcDNA3.1 试剂盒和 Directional TOPO 试剂盒提供了线性的和无需介质就具有活性的拓朴异构酶 I 的载体。Directional TOPO 试剂盒的全部克隆程序，只有三步并且 90%以上的重组克隆表达出正确的排列。省略了克隆和筛选的步骤，大大加快了实验步伐。附录B 测定PLATINUMTM pfx DNA聚合酶的保真度 PLATINUM™ pfx DNA 聚合酶是一种高保真 DNA 聚合酶，特别适用于克隆和突变。PLATINUM™ pfx DNA 聚合酶的保真性有两种分析来确定，rpsL 保真度分析和 LacZ 保真度分析，并与其它聚合酶相比较。当测定 DNA 聚合酶的保真度时，保真度数据的变化可能来自不同的分析过程，由于目标中的潜在的突变热点。当评价保真度数据时，保持相似的不是绝对数值而是相对比的酶之间的相对关系。这篇文章用两种分析来评价几种酶的保真度。 PLATINUM™ pfx DNA 聚合酶具有 3’到 5’的校正外切酶活性。与其它 Taq DNA 聚合酶相比具有最低的错误率。方法： rpsL 保真度分析：pMOL21 质粒 DNA（4kb），包含氨苄青霉素抗性（Apr）和 rpsL 基因，用 ScaI 线性化（图 1）。按照制造商的使用说明。进行 50 微升体积的标准 PCR 反应，使用 2 单位 Taq DNA 聚合酶或 PLATINUM™ Taq DNA 聚合酶， 2.5 单位 pfu DNA 聚合酶或 pfu Turbo™ DNA 聚合酶，和 1.25 单位 PLATINUM™ pfx DNA 聚合酶，使用生物素标记引物 AAA AAC GCG TCA CCA GTC ACA GAA AAG CAT CTT AC-3’（正向序列）和 AAA AAC GCG TCA ACC AAG TCA TTC TGA GAA TAG-3’（反向序列）。使用 1ng 模板 DNA 时进行 25 个循环， 10ng 时进行 15 个 PCR 循环。 PCR 反应条件， 94℃， 2 分钟，接 94℃ 15 秒，58℃ 30 秒，68℃ 5 分钟的 25 次或 15 次循环。百分之二十的反应物用于 0.5×TBE 的 0.8%琼脂糖凝胶电泳，并用 0.25μg/ml 的溴化乙锭溶液染色。
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性没有影响。 Enzyme Mutation Frequency(%) Template Doubling(for 25 cycles) Eorror Rate(×10^(-6)) Relative Fidelity Taq DNA Ploymerase 4.00±0.09 11 42±19 1 Platinum Taq DNA Polymerase 3.4±0.5 10 38±5 1.1 Pfu DNA Polymerase 0.3±0.1 10 3±1 14 Pfu Turbo DNA Polymerase 0.27±0.07 11 2.4±0.4 17 Platinum Pfx Polymerase 0.14±0.04 12 1.6±0.5 26 表 1：用 rpsL 分析测定 DNA 聚合酶的保真性。结果是 5 次独立的 rpsL 分析（2 次 25 个循环和 3 次 15 个循环）结果的平均值±SD。对不同酶的突变克隆和总克隆数分列如下，Taq DNA 聚合酶（1,892/56,455）， PLATINUMTM Taq DNA 聚合酶（ 2,043/57,695 ）， pfu DNA 聚合酶（1,033/395,469）， pfu TurboTM DNA 聚合酶（1,068/395,468）， PLATINUMTM pfx DNA 聚合酶（960/584,230）。用 LacZ 保真性分析获得了相同的保真性数据（表 2）。在所研究的几种 DNA 聚合酶中，PLATINUM™ pfx DNA 聚合酶有最低的错误率。 Enzyme Mutation Frequency(%) Template Doubling(for 25 cycles) Eorror Rate(×10^(-6)) Relative Fidelity Taq DNA Ploymerase 3.1±0.3 14 19±3 1 Pfu DNA Polymerase 0.18±0.03 11 1.1±0.4 15 Platinum Pfx Polymerase 0.09±0.01 11 0.67±0.06 29 表 2：用 LacZ 分析测定 DNA 聚合酶的保真性。结果是 2 次独立的 LacZ 分析（1 次 25 个循环和 1 次 15 个循环）结果的平均值±SD。对不同酶的突变克隆和总克隆数分列如下， Taq DNA 聚合酶（2,975/93,688）， pfu DNA 聚合酶（185/109,289），PLATINUMTM pfx DNA 聚合酶（96/107,655）。所有突变克隆都重新涂布并在 37℃培养过夜以进行第二次真正突变体确定。酶的保真性会被缓冲液或其附加物所影响。PCRx 增强溶液，它是针对高 GC 含量的模板的 PCR 反应的共溶剂，也在 rpsL 分析中进行了评价。PCRx 增强剂能提高 Taq DNA 聚合酶的保真性 2 倍（图 2）。PLATINUM™ pfx DNA 聚合酶的保真性不被 PCRx 增强剂所影响（数据未显示）。另外，在扩增反应中，当多种不同 PCR 缓冲液应用于 pfu DNA 聚合酶或 PLATINUM™ pfx DNA 聚合酶时保真性没有明显变化（数据未显示）。
第十二章疑难解答
问题可能原因建议解决方法 RT-PCR 灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有 RT-PCR 产物 RNA 被降解在用来验证完整性之前先在变性胶上分析 RNA 使用良好的无污染技术分离 RNA 在将组织从动物体取出后立刻处理在 100％甲酰胺中储存 RNA 如果使用胎盘 RNase 抑制剂，不要加热超过 45℃或 pH 超过 8.0，否则抑制剂或释放所有结合的 RNase。而且，在≥0.8mM DTT 时加入 RNase 抑制剂，一定要存在 DTT。 RNA 中包含逆转录抑制剂通过乙醇沉淀 RNA 除去抑制剂。用 70％（v/v）乙醇对 RNA 沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg 到 0.4μg/μl）以帮助小量样品 RNA 的恢复。逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。将对照 RNA 同样品混合，同对照 RNA 反应比较产量以检验抑制剂。多糖同 RNA 共沉淀使用氯化锂沉淀 RNA 以除去多糖。用于合成 cDNA 第一链合成的引物没有很好退火确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在 25℃保温 10 分钟。对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他 GSP，或换用 oligo(dT)或随机六聚体确定 GSP 是反义序列。起始 RNA 量不够增加 RNA 量。对于＜50ng 的 RNA 样品，可以在第一链 cDNA 合成中使用 0.1μg 到 0.5μg 乙酰 BSA。 RNA 模板二级结构太多将 RNA 和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火提高逆转录反应温度，对 SuperScriptⅡ可以到 50℃，对 ThermoScript 可以到 65 ℃。注意：不要在＞60℃时使用 oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的 GSP。

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图 2. PCRx 增强溶液对 Taq DNA 聚合酶的保真性的影响。用 rpsL 分析来确定在扩增反应中含有或不含 PCRx 增强液时 Taq DNA 聚合酶的错误率。数值是平均值±SD（N=2）。附录C 使用一步法RT-PCR从单一细胞中检测基因方法：分离单一细胞在去除了细胞培养基后，COS-7 细胞用不含钙镁的 DPBS（0.20g/L KCl, 0.20g/L KH2PO4, 8.00g/L NaCl, 2.16g/L Na2HPO4·7H2O ）清洗一次。加入 Trypsin-EDTA(0.25% tryspsin,1mM EDTA·4Na)到细胞中（3ml/75cm2 培养瓶）并保温至最多 5 分钟。加入 20ml 生长培养基以终止胰蛋白酶的活性。离心收集细胞。将细胞悬浮到 DPBS 中至大约 1000 个细胞/ml。取 10μl 悬浮液（大约 10 个细胞）点到清洁的盖玻片表面。用微量移液管在相差显微镜（Nikon Diaphot 倒置显微镜，200 倍放大）下收集细胞。分离的细胞（在少于 1μl 的 DPBS 中）转移到 0.2ml 薄壁 PCR 管中。
图 1. 在显微镜下分离单个细胞一步法 RT-PCR 使用 INVITROGEN 的 SUPERSCRIPT™ One-Step RT-PCR with PLATINUM® Taq System 进行 RT-PCR。
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图 2. 源自 COS-7 细胞的一步法 RT-PCR 产物。 1-3 泳道分别是从 1 个，2 个和 5 个细胞中扩增的人类肌动蛋白，使用的是有意义引物（CCT CGC CTT TGC CGA TCC）和反义引物（GGA TCT TCA TGA GGT AGT CAG TC）。C 泳道则是没有加入反转录酶的扩增结果。