PCR和RT-PCR(11-12章)

rtpcr原理RT-PCR原理。

RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种将RNA转录成cDNA，然后再进行PCR扩增的技术。

它是PCR技术的一个变种，常用于检测RNA病毒、研究基因表达等领域。

下面将详细介绍RT-PCR的原理。

首先，RT-PCR的第一步是将RNA转录成cDNA。

这一步需要使用逆转录酶（Reverse Transcriptase）来完成。

逆转录酶能够将RNA模板上的核糖核酸序列转录成互补的DNA序列。

在这一步中，需要加入一条引物（primer），它会与RNA模板上的特定序列结合，作为逆转录酶合成cDNA的起始点。

接下来，转录生成的cDNA会作为PCR的模板进行扩增。

PCR扩增是通过DNA聚合酶（DNA Polymerase）在不断变换的温度下进行的。

首先是变性，将双链DNA变性为两条单链DNA。

然后是退火，引物与模板DNA结合。

最后是延伸，DNA聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。

这样，经过多轮循环，就可以将少量的RNA扩增成大量的DNA。

RT-PCR的原理可以通过以下几个关键步骤来概括，首先是逆转录，将RNA转录成cDNA。

然后是PCR扩增，通过多轮循环将cDNA扩增成大量的DNA。

最终，可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法来检测扩增产物。

RT-PCR的原理在实际应用中有着广泛的意义。

例如，在病毒检测中，可以通过RT-PCR来检测病毒RNA，从而进行病毒的早期诊断和监测。

在基因表达研究中，可以通过RT-PCR来检测特定基因的mRNA水平，从而了解基因的表达情况。

此外，RT-PCR还可以用于克隆特定基因、分析基因多态性等领域。

总的来说，RT-PCR是一种重要的分子生物学技术，其原理简单清晰，应用广泛。

通过将RNA转录成cDNA，然后再进行PCR扩增，可以快速、准确地检测目标RNA的存在，从而在医学诊断、基因表达研究等领域发挥重要作用。

PCR种类和原理引言聚合酶链反应（PCR）是一种基因分析技术，广泛应用于分子生物学领域。

通过PCR，可以在短时间内扩增一小段DNA序列，从而方便进行基因检测、DNA测序等相关操作。

本文将介绍PCR的种类和原理。

PCR的种类PCR根据特定的用途和反应条件的不同，可以分为以下几种不同类型：标准PCR标准PCR是PCR的最基本形式，包括三个步骤：变性、退火和延伸。

在变性步骤中，将PCR反应体系中的DNA序列加热至高温，使其两个链解开。

然后，降温至一定温度，使引物（寡核苷酸）与DNA序列的两个链的末端结合。

最后，在合适的温度下，通过DNA聚合酶，使DNA序列的两个链延伸。

逆转录PCR逆转录PCR（RT-PCR）是一种将RNA转录成DNA的反应。

通过使用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后进行PCR扩增，可以更方便地研究RNA的表达和变化。

定量PCR定量PCR（qPCR）是一种用于测量DNA序列数量的PCR技术。

通过引入荧光探针或染料，可以实时监测PCR反应的进行，并据此计算目标DNA序列的起始数量。

数字PCR数字PCR是一种通过将反应体系分成多个小区域，并进行单分子级别的PCR扩增，实现对DNA序列的精确计数的方法。

长PCR长PCR用于扩增较长的DNA序列。

通常，标准PCR技术在扩增1000个碱基以上的DNA序列时表现不佳，而长PCR通过优化反应条件，可以扩增数千个碱基以上的DNA 序列。

PCR的原理PCR的原理基于DNA的复制过程。

PCR反应体系主要包括DNA模板、引物、DNA 聚合酶和反应缓冲液。

下面是PCR反应的基本步骤：1.变性：将反应体系加热至95°C，使DNA模板的双链解开。

此步骤中，DNA模板上的两个链会分离开，形成两个单链模板。

2.退火：降温至较低的温度，使引物与模板DNA的单链序列互补结合。

每个引物在目标区域的两端结合。

3.延伸：在适当温度下，DNA聚合酶开始将引物作为起始点，向外延伸合成新的DNA链，形成与模板DNA互补的两条新的DNA链。

自己总结：透彻易懂pcr rt-pcr原理【最新】PCR原理聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。

可看作生物体外的特殊DNA复制。

PCR这项技术，被广泛地运用在医学和生物学的实验室，例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制以及亲子鉴定。

DNA 变性DNA denaturation : 加热或用碱处理双链DNA，使氢链断裂，结果DNA变成为单链，此称为DNA的变性。

发生这种变化时的温度称为融解温度，鸟嘌呤和胞嘧啶含量高的DNA融解温度也高。

由于变性的结果DNA的紫外线吸收增加，比旋光度和粘度降低，密度也增加。

如果在加热后慢慢冷却，则DNA可以再次恢复成双螺旋结构。

另外，外部压力也能使DNA变性.PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外摄氏95?高温时变性会变成单链，低温(经常是60?C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72?C左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

引物(primer)，是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。

DNA聚合酶(DNApolymerase)是细胞复制DNA的重要作用酶。

DNA聚合酶,以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。

DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成(在具备模板、引物、dNTP等的情况下)及其相辅的活性。

dNTP: deoxy-ribonucleoside triphosphate(三磷酸脱氧核糖核苷)的缩写。

rt-pcr原理RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种常用的核酸检测技术，广泛应用于病毒检测、基因表达分析等领域。

本文将介绍RT-PCR的原理及其在实验室中的应用。

RT-PCR的原理主要包括逆转录（Reverse Transcription）和聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）两个步骤。

首先是逆转录，即将RNA转录成cDNA。

在这一步骤中，首先需要一种特殊的酶——逆转录酶，它能够将RNA模板上的信息转录成相应的cDNA。

逆转录过程中需要一段RNA引物（primer）作为起始序列，使逆转录酶能够在该位置开始合成cDNA链。

经过逆转录反应后，RNA被转录成了cDNA，为后续的PCR反应提供了模板。

接下来是聚合酶链式反应，即利用DNA聚合酶在适当的温度下，将cDNA模板进行扩增。

PCR反应需要两段DNA引物，它们分别位于所需扩增片段的起始和终止位置。

在PCR反应的循环中，先是将DNA双链解旋，然后引物与模板结合，随后DNA聚合酶开始在引物的引导下合成新的DNA链。

通过多次循环，可以在较短的时间内扩增出大量的目标DNA片段。

RT-PCR技术具有高灵敏度和高特异性的特点，适用于检测病毒、细菌等微生物的核酸。

在病毒检测中，RT-PCR能够对病毒RNA进行逆转录合成cDNA，然后通过PCR反应扩增出目标病毒基因片段，从而实现对病毒的快速检测。

此外，RT-PCR还可以用于分析基因的表达水平，通过检测特定基因的mRNA水平，可以了解该基因在不同组织、不同生理状态下的表达情况，为基因功能研究提供重要信息。

除了基本的RT-PCR技术外，还有一些衍生技术，如实时荧光定量PCR （qPCR）。

qPCR在PCR反应中加入荧光探针，可以实时监测PCR产物的扩增过程，从而获得准确的定量信息。

这种技术在基因表达分析、病毒定量检测等领域有着广泛的应用。

PCR及RT-PCR一、目的掌握聚合酶链式反应(PCR) 及逆转录－聚合酶链式反应(RT-PCR)的基本方法二、原理PCR用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。

在由Taq DNA聚合酶催化的一系列合成反应中，使用两段寡核苷酸作为反应的引物。

一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板DNA 两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列又分别位于待扩增的两侧。

反应时它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的DNA 为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35 轮循环就可使DNA 扩增达106倍。

RNA的多聚酶链式反应（RT-PCR）是以RNA为模板，联合逆转录反应（reverse transcrip－tion, RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的特异DNA，为RNA病毒检测提供了方便；并为获得与扩增特定的RNA互补的cDNA提供了一条极为有利和有效的途径。

RNA扩增包括两个步骤：①在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补链cDNA；②加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA。

在RT-PCR中关键步骤是RNA的逆转录，cDNA的PCR与一般PCR条件一样。

由于引物的高度选择性，细胞总RNA无需进行分级分离，即可直接用于RNA的PCR。

但RT-PCR对RNA制品的要求极为严格，作为模板的RNA分子必须是完整的，并且不含DNA、蛋白质和其它杂质。

PCRqPCRRT-PCR的原理及应⽤⽣物的东西必须要主动去了解，否则视野容易受到限制，尤其是分⼦⽣物学的核⼼技术。

PCR - 聚合酶链式反应- YouTube⽬的：从DNA双链中扩增出感兴趣的区段，⽤于后续的研究。

原理：DNA结构，双螺旋，AT、GC配对；DNA双链在临界温度会解链，退⽕后⼜会恢复；引物，DNA复制的起点，之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已有的DNA链上。

操作核⼼：1. 引物设计，会考虑GC含量，决定退⽕温度；2. 变性、退⽕和延伸；PCR的应⽤ -1. Gene expression2. Genotyping (detection)3. Cloning4. Mutagenesis5. Methylation analysis6. Sequencing7. Medical, forensic, and applied sciences问题：1.真核⽣物的组蛋⽩会影响PCR吗？2.为什么需要前后引物，前后引物是如何p出指定区段的？3.PCR、qPCR和RT-PCR之间的区别和联系？PCR - 任何核酸序列RT-PCR 逆转录聚合酶链式反应 - 分析的是RNA，⼤部分是基因表达逆转录PCR，就是PCR的⼀个常规应⽤，我也跑过，见过庞⼤的机器，也是先设计引物，然后提cDNA，定量。

⼀条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板透过PCR进⾏DNA复制。

PCA我们是扩增DNA序列，⽽RT-PCR我们扩增的是反转录出来的cDNA序列，然后再做PCR，把量做上去来检测，通常会配上⼀些管家基因作为对照。

RT-PCR的数据分析可以参照Y数微信公众号，代码很详细。

qPCR (Quantitative Real-time PCR) 实时荧光定量PCR - 分析的是DNA实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是⼀种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的⽅法。

Real-time PCR（实时荧光定量PCR）原理解析1. 什么是PCR？PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种在体外扩增DNA片段的技术。

PCR的发明者是美国生物化学家基里尔·米隆尼斯（Kary Mullis），于1983年提出了这一方法。

PCR通过不断重复三个步骤来扩增目标DNA片段：变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Elongation）。

这些步骤在PCR仪中由多个温度循环来控制，因此PCR也被称为“温度循环扩增”。

PCR技术为科学家提供了一种快速、敏感、特异性极高的扩增目标DNA的方法。

然而，传统的PCR只能在反应结束后进行结果的检测，无法实时监测反应的过程。

为了解决这个问题，Real-time PCR技术应运而生。

2. 实时PCR概述实时PCR是在PCR扩增过程中，使用荧光信号实时监测反应的进行。

与传统PCR相比，实时PCR能够提供实时的、连续的照片剖析PCR的进展。

实时PCR有两种常用的检测方法：荧光染料法和探针法。

其中，探针法又分为TaqMan探针法和Molecular Beacon探针法。

这些探针和染料能够与PCR反应中的产物结合，并产生荧光信号，根据信号的增长情况可以推断目标DNA的含量。

实时PCR广泛应用于分子生物学、医学诊断、检测病原体等领域。

接下来，我们将重点介绍实时PCR的基本原理以及常用的探针法和荧光染料法。

3. 实时PCR基本原理实时PCR的基本原理和传统PCR类似，也是通过变性、退火和延伸三个步骤来扩增DNA片段。

然而，在实时PCR中，PCR反应是在热循环PCR仪中进行，并且扩增过程中的结果可以实时检测。

实时PCR一般需要使用一种独特的仪器，称为实时荧光PCR仪或荧光定量PCR仪。

这种仪器能够在不破坏试管密封的情况下，通过荧光信号实时检测PCR反应体系中的增长程度。

在实时PCR中，荧光信号通过专门的探测器（Detector）收集，并且荧光信号的强度会随着PCR反应进行的次数递增。

rtpcr原理及应用RT-PCR原理及应用。

RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种基因分子生物学技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应两种方法，可以在研究中对RNA进行扩增，从而检测和分析特定基因的表达水平。

本文将介绍RT-PCR的原理和应用，以便更好地理解和运用这一技术。

RT-PCR的原理。

RT-PCR的原理主要包括逆转录和聚合酶链式反应两个步骤。

首先是逆转录，即将RNA转录为cDNA（complementary DNA），这是因为在常规的PCR反应中需要DNA作为模板，而RNA不能直接作为PCR的模板。

逆转录过程中，需要逆转录酶和RNA模板，通过逆转录酶的作用，RNA被逆转录为cDNA。

接着是聚合酶链式反应，即利用DNA聚合酶对cDNA进行扩增，通过PCR反应使特定基因的DNA序列得以扩增，从而进行后续的分析和检测。

RT-PCR的应用。

1. 基因表达分析。

RT-PCR可以用于研究特定基因在不同组织、细胞类型或生理状态下的表达水平。

通过逆转录和PCR扩增，可以定量检测特定基因的mRNA水平，从而了解其在生物体内的表达情况。

2. 病原体检测。

RT-PCR可以用于检测病原体，如病毒、细菌等的RNA或DNA，从而进行疾病的诊断和监测。

例如，在流感疫情监测中，RT-PCR可以快速、准确地检测流感病毒的存在，为疫情防控提供重要依据。

3. 肿瘤标志物检测。

RT-PCR可以用于检测肿瘤标志物的表达水平，帮助肿瘤的早期诊断和疗效监测。

通过检测肿瘤相关基因的表达水平，可以及早发现潜在的肿瘤病变，为临床治疗提供参考。

4. 药物研发。

RT-PCR可以用于药物研发中的基因表达分析和药效评价。

通过比较药物处理前后特定基因的表达水平变化，可以评估药物对基因表达的影响，为药物研发提供重要参考。

5. 遗传病检测。

RT-PCR可以用于遗传病的检测和分析，例如常见的遗传性疾病、基因突变等。

一、知识背景：1. 基因表达：DNA——RNA——Protein单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因——104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）——共合成109个丝心蛋白。

因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。

2. PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。

在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。

反应分三步：A.变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。

C.延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ ——3’方向延伸。

以上三步为一个循环，如此反复。

3. 逆转录酶和RT-PCR逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.二、RT-PCR的准备：1. 引物的设计及其原则：(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。

因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。

在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。

尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。

(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:a.引物长度:一般为15～30 bp，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。

PCR的分类及其原理PCR的主要类型包括：(1)反向PCR；(2)不对称PCR；(3)RT-PCR；(4)重组PCR(PCR体外诱变技术)；(5)简并引物PCR；(6)定量PCR；(7)多重PCR；(8)锚定PCR；(9)原位PCR；(10)差异显示PCR；(11)巢式PCR；(12)共享引物PCR。

原理：(1)反向PCR：用于未知DNA片段的扩增。

先用连接酶将片段连接成环状，根据已知序列的碱基序列设计3’引物和5’引物扩增未知序列；(2)不对称PCR：原理是两端引物的浓度相差50～100倍，经PCR扩增得到单链DNA。

在PCR前25个循环中，主要生成双链产物，低浓度引物耗尽时，高浓度引物介导的PCR反应可产生大量单链DNA；(3)RT-PCR：先将mRNA逆转录成cDNA，接着以cDNA为模板进行PCR扩增。

合成cDNA第一链时，常用多聚(dT)引物进行。

后面的PCR扩增与普通PCR相同；(4)重组PCR：利用寡核苷酸引物在碱基不完全互补配对的情况下亦能同模板DNA退火的能力，设计引物时，人为地造成碱基取代、缺失或插入，从而通过PCR反应将突变引入靶DNA区段；(5)简并引物PCR：引物在未知DNA片段确切核苷酸序列的情况下，设计简并引物，从基因组(或cDNA)中把未知基因扩增出来；(6)定量PCR：以mRNA为模板合成cDNA后，再在同一反应管内同时加入参照基因和待测基因。

参照引物和待测基因引物进行PCR扩增，以参照基因扩增产物为基础，确定待测基因的相对量；(7)多重PCR：同一体系中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域；(8)锚定PCR：通过DNA末端转移酶在cDNA 3’末端加上poly(dG)尾，设计相对应的锚定引物poly(dG)，在锚定引物和基因特异引物作用下，扩增全序列的DNA片段；(9)原位PCR：以组织固定处理细胞内的核酸作为靶序列，进行PCR反应。

不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA；(10)差异显示PCR：将两种mRNA的样品逆转录成cDNA第一链，后加入两种引物进行PCR扩增，一种为锚定引物，另一种为十碱基的随机引物。

PCR和RT-PCR兰州大学王映珍第一章PCR和RT-PCR基础第二章PCR基础聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。

这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。

一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。

反应包括几个成分（表1）。

模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。

引物确定了扩增产物的序列和长度。

最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。

这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。

扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核苷及镁离子。

镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。

在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。

表1.反应成分Component Final ConcentrationTemplate 10^4-10^6 copies of DNA templatePrimer 1 0.1-0.5µMPrimer 2 0.1-0.5µM10X Reaction buffer 1XMagnesium 1.0-3.0mMdNTP mix 200 mM each dNTPThermostable DNA polymerase 1-4 units/100 ml reactionRT-PCR基础RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。

RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。

另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。

RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase 保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。