蛋白质组学期末作业1、一、常用的样品制备技术：1、高丰度蛋白去除技术（抗体亲和法：通过抗原抗体反应原理，用针对样品中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除样品中的高丰度蛋白；染料亲和法：通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键相互作用去除样品中的高丰度蛋白，其特异性相对较低。
）2、自由流电泳技术（FFE）（FFE分离原理－IEF （等电聚焦）条件下：根据等电点的不同进行样品分离，主要用于分离蛋白质。
ZE（区带电泳）条件下：根据样品表面电荷密度不同进行分离，主要用于分离细胞器。
FFE的特点：1、是基于液体的样品分离/制备技术，与所有下游分离技术兼容；2、分离非常快；3、液相分离保证初始样品具有很高的回收率；4、采用连续模式，上样和分离连续同时进行；5、分析对象广泛；6、分离条件温和，适合活性生物材料的分离纯化。
二、2－DE技术，即双向电泳，是当前蛋白质组学研究中分辨率最高、信息量最大的分离技术。
它的优点有：1. 可以将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观质膜的纯度鉴定方法11、形态学方法（常规透射电镜、免疫电镜观察其切片，纯细胞膜成空的膜泡或片状结构）2免疫印迹法（常用抗体:抗caveolin、Na+--K+--ATPase、flotillin、5`-nucleotidase 等）3、酶活测定法（测 AP、ADP、Na+-K+-ATPase、5`-nucleotidase的活性）4、膜组分分析法（分析脂质与蛋白质的比例）由于细胞器在细胞内结构上与许多其他亚细胞组分相关联，和细胞器组成的动态性，所以分离得到的细胞器很难达到100% 的纯度。
所以，亚细胞组分的纯度问题和亚细胞组分生物学功能的深入挖掘是亚细胞蛋白质组研究所面临的挑战。
现在已经有一些研究策略来解决这一难点问题，如Schirmer等提出的差减蛋白质组学方法来解决核膜的内质网污染问题；Andersen 等提出的蛋白质校正谱图分析法(protein correlation profiling，PCP)来分析可能定位于中心体的蛋白质；Jiang 等运用ICAT 技术和生物信息学手段的方法来确证线粒体蛋白质，排除污染蛋白。
三、药物蛋白质组学就是蛋白质组学技术在药物研发中的应用。
药物蛋白质组学主要应用于：（1）临床前研究-发现所有可能的药物作用靶点，以及针对这些靶点的全部可能的化合物，以及应用蛋白质组学方法研究药物作用机制和毒理学；（2）临床研究方面-发现药物作用的特异蛋白作为患者选择有效药物的依据和临床诊断的标志物，或以蛋白质谱的差异将患者分类并给予个体化治疗。
举例：药物蛋白质组学在药物靶点发现和确认中的应用（1）研究人员通过比较给药前后的蛋白质组，找到了药物阿霉素抗乳腺癌的一个作用靶标Hsp27。
（2）疟原虫入侵血红细胞的阻断靶点探测：半胱氨酸蛋白水解酶是疟原虫生存必需的酶，Greenbaum等利用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化学探针I125-DCG-04打靶，然后通过抗DCG-04的生物素纯化，得到了半胱氨酸蛋白水解酶类的亚蛋白质组；通过酶活性分析，最终发现在疟原虫的入侵血红细胞的裂殖期，仅有一个有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白质—falcipain 1；从数据库筛选到falcipain 1的抑制剂YA29-Eps，结果证实YA29-Eps可阻断疟原虫的入侵红细胞。
四、免疫共沉淀原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。
技术用途：1.鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合，以及进行结合位点分析；2.筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。
优点：相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。
缺点：1.需要高质量的抗体进行IP；2.两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；3.检测不到弱或瞬时的相互作用。
Pull down 实验原理：利用GST、HIS等标签蛋白将一种蛋白质（诱饵蛋白）固定于某种基质上(如Sepharose)，当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，通过改变洗脱液或洗脱条件即可回收所吸附的蛋白。
用途：1.鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用；2.筛选与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质优点：1.灵敏、周期短；2.不需要构建基因文库；3.抗体质量要求不高；4.可鉴定直接相互作用。
缺点：1.需要纯化的蛋白；2.体外相互作用（假阳性、假阴性）。
五、1. 收集蛋白样品(Protein samplepreparation)2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 (2) 样品处理(3) 上样与电泳3. 转膜(Transfer)4. 封闭(Blocking)5. 一抗孵育(Primary antibodyincubation)6. 二抗孵育(Secondary antibodyinucubation)7. 蛋白检测(Detection of proteins)8. 膜的重复利用(Membrane recovery)六、质谱仪的组成要件：样品导入系统、离子源、质量分析器、检测器四个部分。
其中离子源又分为电子轰击源、化学电离源、场致电离源、电喷雾电离源。
基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization / Time of Flight Mass Spectra），离子源是基质辅助激光解吸电离，质量分析器是飞行时间管。
MALDI-TOF MS是近年来获得快速发展的一种软电离生物质谱，它的建立突破了生物大分子质谱分析的难题，该技术无论在理论上还是在设计上都具有简单、高效、灵敏、快速、准确、测定质量范围大等特点。
肽质量指纹谱（Peptide Mass Fingerprinting, PMF）是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的肽片段的质量图谱。
由于每种蛋白的氨基酸序列（一级结构）都不同，当蛋白被水解后，产生的肽片段序列也各不相同，因此其肽质量指纹图也具有特征性。
MALDI-TOF-MS分析肽混合物时，能耐受适量的缓冲剂、盐，而且各个肽片几乎都只产生单电荷离子，因此MALDI-TOF成为进行分析PMF的首选方法。
1.将待测样品与基质混合并置于样品板上干燥。
2. 将样品板放入质谱仪的样品。
3. 样品点被激光脉冲照射，解吸，离子化4. 离子被电场加速，进入真空漂移管5.离子的m/z不同，飞行时间不同，先后到达检测器。
6将分离得到的结果，与数据库对比，得到肽质量指纹谱后，再在数据库中查询鉴定蛋白质。
七、蛋白质组学研究的发展趋势：随着蛋白质组学的快速发展及其在多个领域中的广泛应用，其研究的发展重点也逐渐发生了转变：1）从全蛋白质组向锁定特定目标物的蛋白质组研究转变(如亚细胞/功能蛋白质组学）。
2）从定性描述向定量分析转变。
3）由蛋白组研究向修饰蛋白组研究转变。
4）由体外研究向体内研究转变。
5）从实验室研究向临床应用拓展。
6）数据产出由数量向质量转变。
7）由简单积累向有效整合以及知识挖掘转变。
8）发展新方法，同时，整合并存的各种方法，实现互补。
9）蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技术新方法的活水之源。
面临的挑战：1.蛋白质数目大大超过基因数目2.蛋白质表达（种类和量）随时、空而变3.每一蛋白质并非只有一种分子实体（via PTM）4.没有PCR等价物，难以对低丰度蛋白/多肽进行分析和比较5.氨基酸之间没有碱基之间的专一性互补配对关系6.经过质谱鉴定的蛋白质还需要传统的方法来验证。
因此，当前的主要任务是发展高通量、高灵敏度和高准确性的研究技术平台。
八？血浆/血清蛋白质组研究中需要着重注意的问题1、样品的选择（分析低分子量的蛋白质时：适于选用去除血小板的EDTA血浆或枸橼酸血浆样品）2、样品的收集与贮存（选择：抗凝剂种类，血清凝集时间，血浆孵育时间和温度）3、去除高丰度蛋白和分级技术（高丰度蛋白严重干扰了低丰度蛋白的检测高丰度蛋白的去除策略抗体亲和法：利用抗原抗体反应的原理，用针对血浆中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除血浆中的高丰度蛋白染料亲和法：通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键、相互作用去除血浆中的高丰度蛋白。
特异性相对较低。
）4、多维策略的运用联合使用不同技术平台并加以适当改进是目前最通用的手段：主要包括：去除高丰度蛋白、样本预分离系统、分离系统、质谱鉴定系统九： 1、肿瘤标志物研究的策略和方法样本收集；分离和鉴定；表达验证；功能验证①经典的2-DE在一定范围内得到应用，能直接比较蛋白质水平的差异。
②直接质谱法之色谱-质谱联用：蛋白酶解为多肽，再鉴定和定量这些多肽，即可获得原始蛋白的质和量的信息；包括标记法和非标记法；该操作相对简单；但，由于原始蛋白的一些信息会在酶解时丢失 (如蛋白降解)，其结果是不全面的③直接MALDI（基质辅助激光解吸电离）／SELDI（表面增强激光解吸电离）,即不酶解，直接进行质谱分析；更适用于高通量研究，但是后续的蛋白质／多肽鉴定往往成为这类实验的瓶颈④其它方法：包括基于抗体的方法,如自身抗体、抗体芯片等。
如：血清蛋白组学分析：即分别用病人和正常人的血清作为一抗，筛选肿瘤组织中的差异蛋白质，即肿瘤抗原。
其实质是 2DE + 免疫印迹技术流程：肿瘤组织或细胞总蛋白—2DE分离—转膜—膜与病人血清及对照血清反应—质谱鉴定差异反应点的蛋白—确定肿瘤抗原病人血清及对照血清：差异的就是前者有针对肿瘤抗原的抗体（1）通过蛋白组学技术已经发现的TM（举例）（2）组学技术可提高诊断的敏感性和特异性（3）肿瘤标志物联合检测的必要性研究步骤和内容⏹LCM获得NPC和NP的间质细胞⏹2D-DIGE⏹质谱分析差异点：20个。
*在NPC间质高表达的有Periostin、S100A9、CapG等*低表达的有L-plastin、Rho-GDI-β和B23等⏹蛋白质印迹验证⏹IHC验证和探讨其临床病理意义⏹Periostin在不同分化程度和转移潜能的细胞中的表达及其功能验证。
