关于厌氧菌培养方法的探讨

厌氧性细菌的分离培养法厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长 (例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低至 0.11V 时才开始生长 )，在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。

为使培养基降低势，降低培养环境的氧压是十分必要的。

现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学，化学和物理学 3 种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。

1．生物学方法培养基中含有植物组织 (如马铃薯、燕麦、发芽谷物等 )或动物组织 (新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等 ) ，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理 )，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。

另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使厌氧菌能生长。

其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌 )，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37恒温箱中培养2~3d 后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。

2．化学方法利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化—还原电势。

此法系用连二亚硫酸纳 (Sodium hydrosulphite) 和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下：Na2S204 十Na2C03十O2 一→ Na2SO4十Na2SO3 十C02取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内 (如系液体培养基，则直立于罐内 )，最上端保留可容纳 1~2 个平皿的空间 (视玻罐的体积而定 )，按玻罐的体积每1000cm3 空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各 30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。

若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭 (如图１－５ )。

实验十厌氧菌的分离和培养1 目的1.1 了解厌氧微生物的生长特性1.2 观察厌氧微生物（双歧杆菌）的形态特征1.3 掌握厌氧微生物的滚管分离、培养与计数技术2 原理目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。

这里介绍的是亨盖特厌氧滚管技术。

亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。

以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趣完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。

而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。

亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害腐败菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。

3 材料3.1 样品双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。

3.2 培养基改良MRS培养基，PTYG培养基。

3.3 仪器和器具亨盖特厌氧滚管装置一套，厌氧管，厌氧瓶，滚管机，定量加样器。

4 流程铜柱除氧→预还原培养基→稀释用液制备→稀释样品→滚管→培养→计数5 方法5.1铜柱系统除氧铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。

此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。

铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。

由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。

当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。

此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。

当然H2源也可以由氢气发生器产生。

5.2 预还原培养基及稀释液的制备制作预还原培养基及稀释液时，先将配制好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5-5ml，稀释液装9ml，并插入通N2气的长针头以排除O2。

厌氧菌的采集送检培养分离鉴定及注意事项厌氧菌是一类在缺氧或无氧条件下生长的微生物。

由于其独特的代谢方式和生长环境的要求，厌氧菌的采集、送检、培养分离和鉴定需要特殊的注意事项。

下面将详细介绍厌氧菌的采集、送检、培养分离和鉴定的方法及注意事项。

一、厌氧菌的采集方法：1.采集样品时应尽量避免与空气接触，以防止厌氧菌暴露于氧气中而失活。

2.采集厌氧菌的样品应尽快送检，以确保其最佳生长环境。

常见的厌氧菌采集样品包括：创伤分泌物、组织切片、血液、体液、粪便等。

二、厌氧菌的送检和保存：1.送检时应明确注明样品为厌氧菌的检测，以便实验室作出相应的处理。

2.采样后，尽量将样品封存，避免与氧气接触，以确保厌氧菌生长环境的完整性。

3.若无法封存样品，应尽快送检至实验室。

三、厌氧菌的培养方法：1. 使用厌氧培养基来提供适宜的生长环境，如：血寒胁素琼脂培养基、Schaedler琼脂培养基等。

2.培养瓶或培养皿密封完好，以维持厌氧条件。

3.培养培养基时，应将其加热至48-50℃，以刺激厌氧菌的孢子萌发。

4.培养温度通常为35-37℃。

四、厌氧菌的分离方法：1.采用分离培养基，在含有抗生素的培养基上分离厌氧菌。

2.厌氧菌通常会在培养基上产生特殊的形态特征，如：斑点、颜色变化等。

3.通过剖析菌落形态特征，并进行细胞的染色观察来鉴定培养物中的厌氧菌。

五、厌氧菌的鉴定方法：1.根据厌氧菌的生物学特征进行初步鉴定，如：形态特征、生理特性等。

2.利用生化试验对厌氧菌进行进一步的鉴定，如：糖、氨基酸、营养盐的利用能力等。

3.利用分子生物学方法，如PCR、16SrRNA测序等进行鉴定。

六、厌氧菌的注意事项：1.在操作过程中应严格遵守无菌操作的要求，以避免外源性菌的污染。

2.在培养过程中要注意保持相应的厌氧环境，如密封培养瓶或培养皿，避免与氧气接触。

3.在采集和送检过程中要注意样品的完整性和新鲜度，以提高厌氧菌的培养成功率。

4.在菌落鉴定过程中要仔细观察形态特征和生物学特性，以确保鉴定结果的准确性。

厌氧菌的培养方法厌氧菌是一类不能在氧气存在下生长和繁殖的微生物。

这些微生物在许多领域都具有重要的应用价值，包括环境保护、生物能源生产等。

因此，为了研究和应用这些厌氧菌，科学家们发展了多种厌氧菌的培养方法。

本文将详细介绍常用的三种厌氧菌的培养方法。

一、利用情境气氛培养厌氧菌情境气氛培养是培养厌氧菌的一种常用方法，其原理是通过调节培养基的气氛来控制氧气浓度。

在培养厌氧菌时，一般会采用以下方法之一来制备情境气氛。

1.预氧化法：将培养容器密封，置于28-37°C的恒温灭菌箱中。

然后通过注入一定比例的高纯度二氧化碳-氧气混合气体，使容器内的气氛变为厌氧情境。

这种方法适用于厌氧菌培养基中氧气浓度较低的情况。

2.双液低压法：将培养基分成两个相隔的容器，分别加入不同的培养液。

然后将两个容器封口并贴膜，用胶带封好。

经过一段时间后，在密封的容器内会形成低压情境。

这种方法适用于厌氧菌培养基中氧气浓度较高的情况。

通过以上两种情境气氛培养方法，可以模拟出适合厌氧菌生长的条件。

二、利用厌氧培养器培养厌氧菌厌氧培养器是一种专门用于培养厌氧菌的装置，其原理是通过封闭式容器和气氛控制系统，实现在厌氧情境下的培养。

常用的厌氧培养器有以下两种类型：1.商用厌氧培养器：通常有专门的培养室和压力控制系统，可以产生适合厌氧菌生长的气氛。

在这种培养器中，可以根据菌株的特性进行相应的操作和调节。

2.自制厌氧培养器：由于商用的厌氧培养器设备较为昂贵，对于一些实验室来说并不实际。

因此，一些实验室会开发自己的厌氧培养器。

自制培养器的原理和商用培养器类似，只是在设计和制作上有所差异。

利用厌氧培养器进行培养时，需要注意以下几点：1.气氛控制：厌氧培养器应能够调节培养基的气氛，包括氮气、二氧化碳等气体的供应和排除。

2.温度调节：厌氧培养器应能够保持恒定的培养温度，一般为28-37°C。

3.培养基搅拌：适当的培养基搅拌可以增加氧气的溶解度，并促进菌体的生长和分散。

厌氧菌在有氧的情况下不能生长。

要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。

通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。

如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。

常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。

1.厌氧缸法：接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。

2.厌氧袋：即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。

塑料袋透明而不透气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。

放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。

先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。

如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。

3.厌氧手套箱：是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。

它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。

箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。

欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。

箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。

该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。

金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。

4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。

5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物，消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。

我没见过。

6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。

厌氧菌在有氧的情况下不能生长。

要培养厌氧菌，必须创造一个环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。

如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。

常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。

1.厌氧缸法：接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。

2.厌氧袋：即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。

塑料袋透明而不透气，内装气体发生管、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。

放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。

先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。

如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育（较为推荐）。

3.厌氧手套箱：是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。

它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。

箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。

欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。

箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。

该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。

金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。

4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。

5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物，消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。

我没见过。

6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。

焦性末食子酸与碱反应后耗氧。

厌氧培养箱之厌氧菌的培养操作厌氧菌在有氧的情况下不能生长。

要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。

通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。

如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。

常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。

1．厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。

2．厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。

塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼Q化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。

放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。

先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。

如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。

3．厌氧手套箱（Anaerobie glove box）即厌氧培养箱。

它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。

箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。

欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。

箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。

该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。

金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。

4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。

5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（多是植物），消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。

我没见过。

6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。

厌氧细菌培养技术一、厌氧菌的培养方式厌氧菌的培养过程中，最重要的就是为其提供厌氧生长环境，厌氧环境的提供可以从以下两方面着手。

一方面可以提供厌氧装置如厌氧手套箱，厌氧产气罐或者厌氧产气袋。

另一方面可以提供含有还原剂的特殊培养基，如含少量琼脂，L-半胱氨酸，硫乙醇酸钠，巯基乙醇等的液体培养基。

要注意的是，如果没有厌氧手套箱，我们在对厌氧菌活化或者是转接操作的时候，动作要快，防止厌氧菌在空气中暴露的时间过长。

二、我们正常的大气环境中是有氧环境，这类厌氧菌通常生活在哪里呢我们研究这类菌有什么意义呢我们的大气环境确实是一个有氧环境。

但是，地球上还存在很多厌氧环境比如深海和淤泥中，厌氧菌在我们人体中也普遍存在。

我们研究厌氧菌，一方面是因为厌氧菌是临床上一类重要的病原菌；另一方面，哺乳动物肠道菌群中99%是厌氧菌，其中许多是促进消化吸收的有益菌，不管是从致病机理，还是开展疾病治疗来说对厌氧菌的研究意义都很重大。

三、为什么好氧菌在生长繁殖过程中必须有氧气存在，而厌氧菌在生长过程中氧气却对对其产生毒害作用呢微生物虽然可以利用氧，通过有氧呼吸来产生更多的能量，满足机体的需要，但是氧对一切生物都会产生有毒害的代谢产物，比如会产生超氧阴离子，过氧化氢和羟自由基。

超氧阴离子和羟自由基是强氧化剂，能氧化细胞内的大分子物质和有机化合物，对细胞造成损伤，过氧化氢也会损害一些细胞组分。

但是，微生物细胞可以通过产生过氧化氢酶，超氧化物歧化酶和超氧化物还原酶等等这些酶类来清除细胞内的毒性氧。

对于好氧菌来说，细胞内往往会产生超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，所以氧气对这类微生物不会产生毒害。

那么对于厌氧菌来说，细胞内无法合成超氧化物歧化酶〔SOD〕和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。

所以，这类微生物无法消除氧气对它的毒害作用。

只能在无氧的环境中通过发酵或无氧呼吸产能。