茶 叶 科 学 2006，26（1）：17~23 Journal of Tea Science收稿日期：2005-08-02 修订日期：2005-10-10作者简介：金基强（1983— ），男，河南信阳人，硕士研究生，研究方向为植物诱变遗传与分子改良。
*通讯作者茶树EST-SSR 的信息分析与标记建立金基强1，崔海瑞1*，陈文岳2，卢美贞1，姚艳玲1，忻雅2，龚晓春1(1. 浙江大学原子核农业科学研究所，浙江 杭州 310029；2. 杭州市农业科学院，浙江 杭州 310024)摘要：在1589条茶树EST 中，共发掘出了281个EST-SSR ，分布于246条EST 中，出现频率是17.68%，平均长度为33.06 bp ，平均分布频率是1/2.61 kb 。
在茶树EST-SSR 中，二核苷酸重复是主要的重复类型，出现最多的重复基元类型是AG/CT 重复。
设计了19对SSR 引物，在对引物、dNTP 、MgCl 2的浓度及退火温度等参数进行测试后，建立了合适的PCR 反应体系。
以衍生绝大多数EST-SSR 的龙井43 DNA 为模板，对引物进行了筛选，有16对引物显示扩增，可用率为84.2%；进一步在10个茶树品种中进行多态性测试，显现出多态性的引物占可扩增引物的62.5%。
本文研究结果证明了根据茶树EST 建立SSR 标记是有效、可行的。
关键词：茶树；EST ；SSR 信息；标记建立中图分类号：S571.1; Q523 文献标识码：A 文章编号：1000-369X （2006）01-017-07Data Mining for SSRs in ESTs and Development ofEST-SSR Marker in Tea Plant (Camellia sinensis )JIN Ji-qiang 1, CUI Hai-rui 1*, CHEN Wen-yue 2, LU Mei-zhen 1,YAO Yan-ling 1, XIN Ya 2, GONG Xiao-chun 1(1.Institute of Nuclear and Agricultural Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China; 2. Hangzhou Academy ofAgricultural Sciences, Hangzhou 310024, China)Abstract ：Totally 281 SSRs distributed in 246 ESTs were mined out, accounting for 17.68% of 1589 ESTs updated in tea. The average length of tea plant EST-SSRs searched out is 33.06 bp and the average distance of distribution is 1/2.16 kb. The dinucleotide repeat is the dominant type with repeat motif AG/CT being the most common. 19 primer pairs for EST-SSRs were designed. After testing on the annealing temperature and the concentration of primers, dNTP and MgCl 2, a suitable PCR system was established. Under the condition of reaction system developed, the primers designed were screened against genomic DNA of Longjing 43 from which most EST-SSRs were derived, and 16 primer pairs showed the amplification ，accounting for 82.4% of total primers. Then the primers showing amplification were subjected to PCR for DNAs from 10 tea plant cultivars and 10 primer sets showed polymorphisms, accounting for 62.5% of primers available. Results prove that it is an effective and feasible approach to develop SSR markers based on ESTs in tea.Key words ：tea plant, ESTs, SSR information, marker development目前尽管已有多种分子标记应用于茶树遗传育种研究[1~4]，但其中利用最多的为随机扩增长度多态性DNA(Random amplifiedpolymorphic DNA, RAPD)和限制性片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphic, AFLP)等。
简单序列重复(Simple sequence茶叶科学26卷18repeat，SSR)亦称微卫星(Microsatellite)，与其它分子标记技术相比，SSR标记具有多态性高、多等位性、共显性、易用PCR检测、重复性高、数量丰富和对基因组有很好的覆盖性等特点[5]。
根据建立SSR标记的序列性质不同，SSR标记可分为基因组SSR（Genomic SSR，gSSR）和表达序列标签SSR（Expressed sequence tag SSR, EST-SSR）等。
但与构建小片段基因组文库进行SSR的筛选建立gSSR标记相比，从EST数据库中获得SSR建立EST-SSR标记要经济得多，是对EST资源的充分利用。
EST是指通过对cDNA文库中随机挑取的克隆进行大规模测序所获得的cDNA的5’或3’端序列，长度一般为150~500 bp[6]。
近年来，随着EST计划在不同物种间的扩展和研究内容的深入，来源于不同物种、不同组织、不同细胞和不同发育阶段的EST数目急剧上升(/entrez/query.fcgi)。
快速增长的EST数据为SSR标记的开发提供了丰富的来源，在大麦、黑麦、甘蔗、小麦、水稻、高羊毛、猕猴桃、葡萄、棉花、甘蔗、黑麦草、云杉等植物中都建立了EST-SSR标记，已有的研究表明其为一种有多方面利用价值的分子标记[7]。
截止2005年5月13日，数据库中已有1989条茶树EST，但目前还没有利用这些序列来建立SSR标记的报道。
本研究在对现有茶树EST中的SSR信息进行全面分析的基础上建立了EST-SSR标记，并对它们的多态性作了分析和评价。
1 材料与方法1.1 植物材料与模板DNA的提取本研究用了10个茶树品种，分别是安徽9号、龙井43、浙农25、迎霜、碧云、浙农12、菊花春、黄叶早、紫芽种、安吉白茶，以改良的CTAB法[8]（提取液中添加0.5%维生素C和2%聚乙烯吡咯烷酮）从嫩叶中提取DNA。
1.2 茶树EST中SSR的发掘从美国NCBI (National Center for Biotechnology Information，美国国家生物技术信息中心)数据库中下载了1989条茶树EST，均为对茶树叶片cDNA文库测序的产物。
其中，1639条是由中国农业科学院茶叶科学研究所陈亮等[9]注册登记的，所用的茶树品种为龙井43；另350条是由韩国学者Park 等[10]测序并登记，但未标明所用材料的具体品种名称。
首先利用软件Clustal W (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/clus talw.html)进行EST比对，剔除冗余的EST；再剔除长度过短的序列（小于150 bp）和低质量的序列，最终得到1589条EST。
利用RepeatMasker程序(http://repeatmasker. org/cgi~bin/WEBRepeatMasker)，结合人工搜寻，对1589条EST中所含有的SSR进行了查找。
搜索的单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为18次、7次、5次、5次、4次、4次，包括完全重复、不完全重复和低复杂性重复（仅存在于单核苷酸重复和二核苷酸重复中）三种类型，并对搜索出的SSR的频率与长度进行统计和分析。
1.3 EST-SSR引物设计为进一步利用茶树EST建立SSR标记，在剔除那些SSR旁邻序列小于20 bp的EST 后，对余下的EST-SSR用PRIMER3(http:// /cgi-bin/primer3/primer3_www .cgi)设计PCR引物，共设计了143对EST-SSR 引物。
设计引物时设置的主要参数为：GC含量40%~60%，退火温度（Tm）约60℃（59~61℃），引物长度约20 bp（19~21 bp），预期扩增产物长度在120~350 bp之间。
本研究对其中的19对引物（编号P02~P20）进行了测试，有关这19对引物的具体情况参见表1，由上海Sangon生物技术公司合成。
1期 金基强，等：茶树EST-SSR 的信息分析与标记建立19表1 19对EST-SSR 引物的信息Table 1 Information of 19 EST-SSR primer pairs tested引物编号重复基元 EST 预测功能 预期产物(bp) 引物序列退火温度 GGATGCAAGCAGTTGAAGC 59.54 P02 (AG)n 线粒体ATP 合成酶6 KD 亚基131GGTTACGAAGAAACCGACCA 59.97 GGAGCATTGAAGCGAGAAAT 59.40 P03 (TC)n CGI-203类蛋白 189 ACGCTTCGAGTACTCCCTGA 60.01 GTTGTCGCTGGTGTCTTTGA 59.88 P04 (A)n 未知功能 292 AATTGGCAGTGAGCTCGAA 59.54 GCGTCGTCCCTTCTTTCTAA 59.45 P05 (ATG)n 未知功能 149 GGGCAGCCATAACCACTACT 59.08 AAGGGGCTCTATGGGTCAAG 60.46 P6 (TAA)n 未知功能 157 TGTGTAACCTGCCAAGACCA 60.15 GGGGGAGCTTACAAAGAGTCA 60.62 P07 (TC)n 未知的蛋白 232 AACACCCAATCCTTTTGCAC 59.84 TAACGCAGAGTGGCATTACG 59.90 P08 (A)n 未知功能 227 CGAACCGATGGAGAAGAAAG 59.81 CAGGGTTGCAAGAAGTACCG 60.68 P09 (TTC)n含有三十四肽重复单位的蛋白质122ATCAACCGTATGGGCAAAAG 59.82 GGGGGAACAACGAACAGAT 59.77 P10 AG-rich 未知功能 135 TCTCTGAGGGCTTCGATCAT 59.91 ACCTCGAAGCTGCATTCTGT 60.02 P11 (TG)n (AG)n 脂转运家族蛋白 273 ACAATCATTGCCACCACATC 59.22 TCGTATGCATGTTTTGTGTGG 60.43 P12 (AG)n未知功能 278ATCGCATTTCGCTACGTTCT 59.87 GCTGCCGCTCTTCTTAAGTG 60.29 P13 (TC)n GTP 结合蛋白 240 CGCAAATCTCCAAACAGACC 60.64 CGACCCTCTTCTCTCACCAG 59.98 P14 T-rich 未知功能 325 TACCCATTTCCCTTCTTTGC 59.02 TGGATTCCACCCAGAGTCC 60.88 P15 (TG)n (AG)n 未知功能 262 CCACCGACTCGATGACATAA 59.52 TAGCTCGCACACAACACCAC 60.94 P16 (GGAAA)n 未知功能 265 TCCAACGACACACTCTCTGC 60.03 GGGAGAACCAACCCAGTCTAT 59.31 P17 (AG)n未命名的蛋白 148CCCAATCCGCTGTAGTAGGA 60.09 GGGGACAGAACAGAGGAGAGA 60.78 P18 CT-rich 核糖蛋白体CS17或S17270CGAGTCGTACCACCTCAACC 60.57 CTCTTCGTCCATGTTGGTGA 59.68 P19 (T)n 黄酮醇合成酶 273 AGGCCATTGTGACAGGAAAG 60.11 TTGGGGAAGAAGATGTGGAG 60.04 P20 (TC)n 氨基苯甲酯磷酸核糖基转移酶类似蛋白209 GGCAGGTACCAGAGGTCAAT 59.021.4 PCR 反应体系的建立及扩增产物的检测PCR 反应在25 µl 的体积中进行，含PCR 缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl, 40 mmol/L KCl, 0.08% NP-40, pH=9.0)、50~80 ng 的模板DNA 、1单位Taq 聚合酶，对引物（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 µmol/L ）、dNTP （100、150、200、250 µmol/L ）和MgCl 2（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L ）的浓度进行测试，以确定合适用量。
