双向电泳仪-说明书

蛋白质的双向电泳一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。

这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。

二、实验步骤：1. 芽孢杆菌蛋白质的提取2. 蛋白质样品的纯化将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻干燥，放在-80度冰箱里备用，取出蛋白质干粉300mg 加水化液(尿素水化储备溶液)400ul，加丙酮酸（加DTT）1.6ml，放置-20度冰箱2h，离心，吸除丙酮酸，用超纯水中（加DTT），清洗两次，离心，加水化液溶解。

水化液配置：用dd H20定容水化液浓度100ml 20ml尿素（60.06）7M/L 42.0g 8.4g硫脲（76.12）2M/L 15.2g 3.04gCHAPS 4% 4g 0.8gDTT(154.2) 1% 1g 0.2g（注：DTT现用现加）3. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。

取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul , 100ul的BSA溶解液，在分别加入100ul,80ul,60ul ,40ul,20ul,0ul, 分别加入4ml的Bradfor。

另取2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，各管中分别加入4ml的Bradfor，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。

(测量过程要在一个小时内完成)。

例如：标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为OD值，X为蛋白含量。

a、b通过作图输入数据可知G250的配置：称取G250 固体0.1g加水定容至1L。

使用前滤纸过滤。

比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。

（五）报警1、如果出现过载运行，显示“ERROR1！”，蜂鸣器响报警；2、如果出现空载运行，显示“ERROR2！”，蜂鸣器响报警；3、故障报警后，电泳仪电源输出自动关断，必须关电源认真检查！（六）备份1、为了方便重复性实验，每次运行的程序都会自动备份为0#程序，既将上一次运行所设置参数自动储存到0#程序中。

2、每次电泳仪电源开机，均自动调出0#程序（上一次运行程序），可以直接运行。

二、使用注意事项1、避免使液体溅入仪器内；2、若风扇出现较大噪音后，应及时注入风机润滑油；3、仪器应放在良好通风处，远离高温发热体或爆晒。

三、随机附件1、《DYY系列双恒电泳仪电源使用说明书》1份2、电源线1付3、2A/3A保险管2个《DYY-C系列电泳仪电源使用说明书》仅适用于：DYY-200C/DYY-300C/DYY-600C/DYY-1000C/DYY-300D型/ DYY-600D型/DYY-5000/DYY-ECP3000电泳仪电源DYY-C系列电泳仪电源输出指标对照表型号最大输出电压最大输出电流最大输出功率DYY-200C200V2000mA300WDYY-300C300V400mA120WDYY-600C600V500mA300WDYY-1000C1000V500mA300WDYY-300D300V1500mA450WDYY-600D600V1000mA300WDYY-50005000V200mA100W DYY--ECP30003000V200mA200W DYY-C系列电泳仪电源执行标准安全标准GB9706.1-95《医用电气设备第一部分安全通用要求》GB/T14710-93《医用电气设备环境要求及试验方法》技术标准YY0087-92《医药行业标准电泳仪电源》DYY-C系列电泳仪电源使用条件环境温度：5℃~40℃相对湿度：≤80%大气压力：70.0~106.0Pa电源要求：交流电50HZ±2%、220V±10%一、使用方法：（一）设置1、当连接好电泳槽后，接通电源开关即可进入停机/设置状态；2、按“↑”键或“↓”键，可修改闪动位置的极限设置参数；3、按“ENT”键，选择电压U、电流I、功率、时间的设置换挡。

BIO-RAD双向电泳中文手册ProteomicBio-Rad蛋白质组双向电泳实验操作手册ProteomeWorkTMSytem双向电泳实验流程z样品制备（Samplepreparation）z固相预制胶条的水化（IPGtriprehydration）z第一向等电聚焦（IEF）z胶条的平衡（IPGtripequilibration）z第二向SDS-电泳（SDS-electrophrei）z凝胶的染色及检测（Detection/Staining）zPDQuet软件分析（Softwareanalyi）z质谱鉴定（Proteinidentification）目录第一章实验材料1．1IPG预制胶条及载体两性电解质1．2蛋白质定量试剂盒及其试剂1．3试剂盒及其试剂1．4化学试剂1．5蛋白质Marker1．6染色试剂1．7注意事项第二章SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳2.1溶液的配制2.2SDS-凝胶的配制2.3操作方法2.4注意事项第三章双向电泳3.1溶液配制3.2操作步骤3.3注意事项附录1双向电泳完整的操作步骤附录2聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配置附录3细胞样品的一般处理步骤附录4组织样品的一般处理步骤第一章实验材料1．1IPG预制胶条及载体两性电解质（一）IPG预制胶条（美国Bio-Rad公司），-20℃冰箱保存IPG预制胶条pH3-10，7cm163-2000IPG预制胶条pH3-10，7cm，nonlinear（NL）163-2002IPG预制胶条pH4-7，7cm163-2001IPG预制胶条pH3-6，7cm163-2003IPG预制胶条pH5-8，7cm163-2004IPG预制胶条pH7-10，7cm163-2005IPG预制胶条pH3-10，17cm163-2007IPG预制胶条pH3-10，17cm，nonlinear（NL）163-2022IPG预制胶条pH4-7，17cm163-2022IPG预制胶条pH3-6，17cm163-2022IPG预制胶条pH5-8，17cm163-2022IPG预制胶条pH7-10，17cm163-2022IPG预制胶条pH3-10，18cm163-2032IPG预制胶条pH3-10，18cm，nonlinear（NL）163-2033IPG预制胶条pH4-7，18cm163-2034IPG预制胶条pH3-6，18cm163-2035IPG预制胶条pH5-8，18cm163-2036IPG预制胶条pH7-10，18cm163-2037IPG预制胶条pH3-10，11cm163-2022IPG预制胶条pH3-10，11cm，nonlinear（NL）163-2022IPG预制胶条pH4-7，11cm163-2022IPG预制胶条pH3-6，11cm163-2022IPG预制胶条pH5-8，11cm163-2022IPG预制胶条pH7-10，11cm163-2022IPG预制胶条pH3.9-5.1，17cm163-2022IPG预制胶条pH4.7-5.9，17cm163-2022IPG预制胶条pH5.5-6.7，17cm163-2022IPG预制胶条pH6.3-8.3，17cm163-2023IPG预制胶条pH3.9-5.1，18cm163-2038IPG预制胶条pH4.7-5.9，18cm163-2039IPG预制胶条pH5.5-6.7，18cm163-2040IPG预制胶条pH6.3-8.3，18cm163-2041IPG预制胶条pH3.9-5.1，11cm163-2024IPG预制胶条pH4.7-5.9，11cm163-2025IPG预制胶条pH5.5-6.7，11cm163-2026IPG预制胶条pH6.3-8.3，11cm163-2027IPG预制胶条pH3.9-5.1，7cm163-2028IPG预制胶条pH4.7-5.9，7cm163-2029IPG预制胶条pH5.5-6.7，7cm163-2030IPG预制胶条pH6.3-8.3，7cm163-2031Bio-Rad公司），4℃冰箱保存Bio-Lyte3/10Ampholyte，40%，10ml163-1112Bio-Lyte3/10Ampholyte，40%，25ml163-1113Bio-Lyte3/5Ampholyte，20%，10ml163-1132Bio-Lyte4/6Ampholyte，40%，10ml163-1142Bio-Lyte4/6Ampholyte，40%，25ml163-1143Bio-Lyte5/7Ampholyte，40%，10ml163-1152Bio-Lyte5/7Ampholyte，40%，25ml163-1153Bio-Lyte6/8Ampholyte，40%，10ml163-1162Bio-Lyte6/8Ampholyte，40%，25ml163-1163Bio-Lyte7/9Ampholyte，40%，10ml163-1172Bio-Lyte8/10Ampholyte，20%，10ml163-1182Bio-Lyte5/8Ampholyte，40%，10ml163-1192Bio-Lyte5/8Ampholyte，40%，25ml163-1193Bio-Rad公司），4℃冰箱保存100某ReadyStripBuffer，forpH7-10IPGStrip，1ml163-2093Bio-Lyte3/10Ampholyte，100某，1ml163-2094100某ReadyStripBuffer，forpH6.8-8.3IPGStrip，1ml163-2095100某ReadyStripBuffer，forpH5.5-6.7IPGStrip，1ml163-2096100某ReadyStripBuffer，forpH4.7-5.9IPGStrip，1ml163-2097（二）载体两性电解质（美国（三）等电聚焦上样缓冲液（美国100某ReadyStripBuffer，forpH3.5-5.1IPGStrip，1ml163-20981．2蛋白质定量试剂盒及其试剂ProteinAayKitI，bovineγ-globulintandard500-0001ProteinAayKitII，BSAtandard500-0002ProteinStandardI，bovineγ-globulin，1bottle500-0005ProteinAayDyeReagentConcentrate，450ml500-0006ProteinStandardII，bovineerumalbumin，1bottle500-0007RCDCProteinAayKitI，bovineγ-globulintandard500-0121RCDCProteinAayKitII，BSAtandard500-01221．3试剂盒及其试剂ReadyPrepSequentialE某tractionKit163-2100Tributylphophine （TBP），200mM，0.6ml163-2101ReadyPrepSequentialE某tractionKitReagent1，1vial163-2102ReadyPrepSequentialE某tractionKitReagent2，1vial163-2103ReadyPrepSequentialE某tractionKitReagent3，1vial163-2104ReadyPrep2-DStarterKit163-2105ReadyPrep2-DStarterKitRehydration/SampleBufferReadyPrepStarterKitEquilibrationBufferI，withDTT163-2107ReadyPrepStarterKitEquilibrationBufferII163-2108Iodoacetamide，30g163-2109E.coliProteinSample，lyophilized，2.7mg163-2110ReadyPrepOverlayAgaroe，50ml163-21111．4化学试剂尿素Urea，250g尿素Urea，1kgAG501-某8（D）Mi某edBedRein142-6425CHAPS，1g161-0460CHAPSO，1gTriton某-100，500ml161-0407DTT（Dithiothreitol），1g161-0610DTT（Dithiothreitol），5g163-2106161-0730161-0731161-0465161-0611Tributylphophine（TBP），200mM，0.6ml163-2101溴酚蓝（BromophenolBlue），10g161-0404矿物油（MineralOil），500ml163-2129SDS，25g161-0300SDS，100g161-0301SDS，1kg161-0302Tri，100g161-0715Tri，500g161-0716Tri，1kgIodoacetamide，30g163-2109低熔点琼脂糖，25g甘氨酸，250g161-0717甘氨酸，1kg甘氨酸，2kg丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，100g161-0100丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，500g161-0101丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，2kg161-0103丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，1kg161-0107丙烯酰胺（Acrylamide），99.9%，5kg161-0108甲叉双丙烯酰胺（Bi），5g161-0200甲叉双丙烯酰胺（Bi），50g161-0201PDA （PiperazineDiacrylamide），10g161-0202PDA （PiperazineDiacrylamide），50g161-0203过硫酸氨（AmmoniumPerulfate），10g161-0700过硫酸氨（AmmoniumPerulfate），100g161-0754TEMED，5mlTEMED，50ml161-0801甘油硫尿Marker2-DSDS-Standard，500μl161-0320SDS-Standard，highrange，200μl161-0303SDS-Standard，lowrange，200μl161-0304161-0719161-3111161-0718161-0724161-0800国产或SigmaSigma1．5蛋白质SDS-Standard，broadrange，200μl161-0317PolypeptideSDS-Standard，200μl161-0326PreciionProteinStandard，untained，1500μl，150application161-0362PreciionProteinStandard，pretained，500μl，50application161-0372KaleidocopePolypeptideStandard，500μl161-0325KaleidocopePretainedStandard，broadrange，500μl161-0324PretainedSDS-Standard，highrange，500μl161-0309PretainedSDS-Standard，lowrange，500μl161-0305PretainedSDS-Standard，broadrange，500μl161-0318IEFStandard，pIrange4.45-9.6，250μl161-0310CoomaieBrilliantBlueR-250，10g161-0400CoomaieBrilliantBlueG-250，10g161-0406IEFGelStainingSolution，1L161-0434CoomaieBrilliantBlueR-250StainingSolutionKit161-0435CoomaieBrilliantBlueR-250StainingSolution，1L161-0436CoomaieBrilliantBlueR-250StainingSolution，4某1L161-0437CoomaieBrilliantBlueR-250DetainingSolution，1L161-0438CoomaieBrilliantBlueR-250DetainingSolution，4某1L161-0439Bio-SafeCoomaieStain，1L161-0786Bio-SafeCoomaieStain，5L161-0787SYPRORubyProteinGelStain，200ml170-3126SYPRORubyProteinGelStain，1L170-3125SYPRORubyProteinGelStain，5L170-3138SilverStainKit161-0443SilverStainPluKit161-04501.双向电泳中所用的化学试剂纯度要高，至少为分析级。

蛋白质差异双向电泳仪技术参数要求：第一向等电聚焦电泳系统1. 工作条件:温度：15 –32℃；相对湿度：0 - 70%；2. 应用范围：进行固相pH梯度等电聚焦分离，应用于蛋白质组研究中；3. 技术规格3.1 电极区：铜镀金表面；3.2 胶条槽容量：最多12 个相同长度的胶条槽；3.3 电泳平台温度：15 - 31℃±1℃；3.4 控制面板：7个触摸式按键和液晶显示器(LCD)：4行,每行24个字符；3.5 程序参数：溶胀时间, 电泳平台温度, 每根胶条最大电流极限, 升压设定, 电压上升模式和电压持续时间；3.6 方法存储：主机可生成10个, 每个方法可以多达9步；通过电脑可以生成、存储和编辑任何数目的方法；3.7 电脑控制：电脑控制最多4台主机；3.8 控制软件3.8.1开始、暂停和终止主机运行, 针对每种胶条推荐优化的等电聚焦参数；3.8.2实时监控电泳时的电压、电流、伏小时，以图形方式显示，可存储或输出到其它应用程序如Excel中；3.8.3通过网络远程监控仪器；3.8.4输出、存储和打印专业的报告；3.9 水平调节：可调节水平的支脚；3.10 灵活的盖子，适合运行对光敏感的蛋白标记样品，并有开盖自动断电的高压保护装置；3.11 电源：内置电源3.11.1 电压：0 - 10000 V, 分辨率: 10 V；3.11.2 电流：0 - 1.5 mA, 分辨率：1 µA；3.11.3 功率：最大12 W ；3.12 胶条槽：3.12.1 材料：氧化铝陶瓷,导热性能高，避免出现热点(hot spot)；3.12.2 涂层：表面疏水涂层，防止蛋白粘附；3.12.3胶条槽：13cm、24cm 陶瓷胶条槽各6根；3.13 固相pH梯度干胶条24cm pH3-10非线性干胶条，(12根/包)IMM. DRYSTRIP PH 3-10 NL, 24CM 5包；13cm pH3-10非线性干胶条，(12根/包)IMMOBILINE DRYSTRIP PH3-10NL 2包；4. 原装进口必备附件碘乙酰胺25g；IPG缓冲液PH 3-10NL 1ml；平衡管12根第二向中等通量高分辨率垂直电泳系统1. 工作条件温度：4 - 40℃；相对湿度：0 - 90%；2. 应用范围：中等通量分离生物分子，进行蛋白质组研究中的第二向SDS PAGE 分离蛋白；3. 技术规格3.1 凝胶容量：在一个电泳槽中同时运行1 到6 块胶，适合7-24cm任何长度的一向胶条；3.2 最大凝胶尺寸：26 x 20cm, 1.0mm 厚；3.3 电泳缓冲液体积：阳极：4.5 升；阴极：0.8升；3.4 内置缓冲液循环泵，流速10L/min；3.5 制冷：通过陶瓷热交换器；3.6 灌胶模具：一次同时灌1到6块胶，内含分隔片和填充片，方便卸胶，节省胶液；3.7 电源3.7.1输出电流：1-400mA，1mA递进；3.7.2输出电压：6-600V，1V 递进；3.7.3 输出功率：100W；3.7.4 输出类型：恒电压, 恒电流或恒功率，并自动切换；3.7.5 储存和调用最多3个方法；3.7.6 输出终端：并行两套；3.7.7 计时器：1min-500h, 1Vh-500kVh，连续可调；3.7.8 安全特性：超载/短路监测；3.8冷却水循环装置；3.8.1 工作温度范围：-10 到90℃；3.8.2 温度控制精度：< ± 0.1℃(在20℃)；3.8.3 水浴体积：2.8升；3.8.4 泵容量, 流速17 L/min，压力0.3 bar；3.8.5 功率：1200W；4. 原装进口必备附件玻璃板（包括长板，短板和垫片）：7对；空白板：5套；灌胶模具1个；胶盒支架：2个；5. 质量保证期：自仪器安装验收合格后，提供整机一年免费保修。

双向电泳操作步骤双向电泳操作步骤及相关溶液配置A(实验过程一实验原理:2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。

这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。

二实验步骤:1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。

其中每隔10,15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。

2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。

取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul,10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。

(测量过程要在一个小时内完成)。

3. 双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05, 的溴酚兰，3.5ul(0.5,v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。

在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。

3.2 点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。

3.1 全菌蛋白的制备将细菌接种于DMEM培养基，置于28℃培养箱培养18h。

参照Coelho 等（Coelho et al. 2004）的方法，略有改动。

用Wash buffer（10mmol/L TrisCl pH8.0，5mmol/L 醋酸镁）清洗细胞3次。

离心，细胞沉淀在Lysis Buffer( 7mol/L 尿素，2mol/L硫尿，1% IPG Buffer pH3-10或pH4-7，4% CHAPS，1% DTT，1%蛋白酶抑制剂，1%核酶抑制剂)中悬浮，使其浓度范围在5~10mg/mL。

置于冰上裂解2h。

13000r/min离心1h取上清，-80℃保存。

用2-D clean-up Kit 纯化蛋白，再用2-D Quant Kit测定样本中蛋白浓度。

3. 2 2-D Clean-Up Kit的使用方法（全程小心）蛋白质样本在1.5mL微型离心管中处理，所有步骤均在冰上进行。

1）将体积100μL的蛋白质样本（含1~100μg蛋白质）置于1.5mL微型离心管中。

加入300μL沉淀剂。

振荡或倒置搅匀。

冰浴中（4~5℃）培育15min。

2）加入300μL共沉淀剂，简单振荡混合一下，12000r/min离心5min。

3）将上清液尽量多地倾析或吸出，不要搅散沉淀。

保持沉淀不变，在其上面加入一层40μL共沉淀剂，冰上培育5min。

后离心5min，去上清。

4）往沉淀加入25μL蒸馏水或去离子水。

将管振荡5~10s，这时沉淀应散开，但并未溶解于水中。

在管中加入1mL洗涤缓冲液（在-20℃下至少预冷1h）和5μL洗涤添加剂，振荡直至沉淀完全散开。

-20℃下培育至少30min，每10min振荡20~30s。

5）将离心管以最大速度（至少12000r/min）离心5min。

小心地将上清液移走弃去。

此时应可见白色沉淀，将沉淀简单风干一下（不要超过5min）。

6）用裂解液溶解沉淀，以备第一向IEF电泳。

振荡管子至少30s，在室温下孵育，振荡或用移液管抽吸使之完全溶解。

Ettan IPGphor 3简要操作指南-标准型胶条槽注意：●使用过程中，确保室内温度在20摄氏度！保持设备及周围环境干燥！●该设备为高压设备，不当操作可能导致电击危险！●该设备为双向电泳系统中的一个设备，请阅读双向电泳原理和方法手册了解其他信息！1.调节仪器水平。

2.参照水化液用量表（如下），样品与适量水化液混合，小心加入胶条槽。

3.胶条室温平衡30min，从酸性端（尖端）一侧剥去IPG胶条的保护膜。

胶面朝下，先将IPG胶条尖端(阳性端)放入胶条槽中，慢慢放下胶条，并前后拖动，避免生成气泡。

4.从两端向中间加入1-2ml覆盖油防止水分蒸发。

5.盖好胶条槽盖。

确保电极和胶条的两端有良好的接触。

6.水化：水化可以在20摄氏度进行（被动水化）或Ettan IPGphor 3仪器内提供低电压（主动水化）进行。

水化时间至少10小时。

7.将胶条槽放置在Ettan IPGphor 3的电极平台上。

酸端在正极，碱端在负极。

放置位置参考电极盘左侧刻度。

平台上一次最多可平行放同长度的胶条槽12根。

8.将两条透明的压板分别放在正极端和负极端以施加合适的压力确保胶条与电极完全接触；盖好安全盖，轻轻下压，使其锁紧。

9.盖上安全盖后，开启电源，开关在仪器背面左侧。

开机后，系统经过自检后进入待机状态。

10.程序设置和选择：可通过安装在PC上的控制软件或在Ettan IPGphor 3面板上按键设置程序，在Ettan IPGphor 3上可以储存10个多达9步设置好的程序；这些设置好的程序可以直接调用，也可以在编辑后运行。

可以设置的参数包括水化温度和时间，等电聚焦时的最大电流，电压，温度及电压改变模式等。

请参见双向电泳原理和方法手册了解不同长度和pH范围胶条的推荐运行条件。

11.用左、右箭头将光移至Prot# 1处，用上、下箭头选择被调用的方法号。

使用右向箭头移动光标至File，并用上、下箭头编辑方法名。

12.如果需要，设定水化时间（对于主动水化设为0h）、温度和等电聚焦的温度20度、最大电流50uA/strip。

双向电泳操作步骤双向电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化方法。

下面是一篇超过1200字的双向电泳操作步骤：双向电泳是一种通过两个不同方向的电场来进行蛋白质分离的方法。

它可以更好地区分具有不同等电点和分子质量的蛋白质，并用于研究蛋白质组学以及生物化学等领域。

以下是一般的双向电泳操作步骤：1.确保准备充足的电泳装置，包括双向电泳槽、平衡缓冲液、电泳缓冲液、电泳细胞等。

2.准备样品：将待分离的蛋白质样品进行适当的前处理，包括样品提取、蛋白质浓缩、去除干扰物等。

将样品溶解在适当的电泳缓冲液中。

3.将样品加载到电泳槽中：在准备好的电泳缓冲液中加入样品，然后将样品加载到电泳槽中的样品孔中。

注意，为了保持电泳稳定性，在样品孔加载样品后，要尽快将缓冲液加入到其他储备槽以保持全面和均匀的电解质浓度。

4.进行等电点电泳：将电泳槽中的样品浸没在平衡缓冲液中，并在两侧分别连接正负极。

设置合适的电流和电压，开始进行等电点电泳。

在等电点电泳过程中，蛋白质根据它们的等电点被定向地分离。

5.停止等电点电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为2-3小时。

等电点电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。

6.水平电泳：停止等电点电泳后，将样品塘从上清洗掉，并用水平电泳缓冲液进行冲洗。

然后，在两侧连接正负极，设置合适的电流和电压，开始水平电泳。

在水平电泳过程中，蛋白质根据它们的分子质量被定向地分离。

7.停止水平电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为4-5小时。

水平电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。

8.染色和图像采集：将分离完毕的样品进行染色，常用的染色方法包括银染和荧光染色。

然后，使用图像采集系统获取电泳图像，可根据需要调整采集参数。

9.数据分析和解释：通过对电泳图像的分析，包括珠状图、分子质量标准物的修正和待测蛋白质的标定等，将分离出来的蛋白质鉴定和定位。

10. 验证和验证：对其中感兴趣的蛋白质进行验证和验证。

双向电泳实验操作流程机器型号：GE第一向：等电聚焦（IEF）1．对样品的要求：IEF能否成功主要取决于样品状态和离子强度，一般蛋白制备采用Trin-HCl 为缓冲液，加等渗蔗糖。

根据染色方法和胶条的长度决定上样量，一般是20μg/mL -1mg/mL。

考马斯亮蓝染色较银染需要较大的上样量。

2．IEF准备注意事项：DTT和IPG现用现配，由于DTT是还原剂，长时间放置易氧化，所以可以选择干物质使用。

DTT的作用是和尿素配合打散蛋白质结构，CHAPS为碱性去垢剂，和SDS作用相似，溶解尿素时温度不可超过37℃，因为超过37℃蛋白质会发生氨甲酰化，尽量在生产日期一年内使用。

清洗IEF胶条槽时用专用清洗剂，原液清洗或2%浓度浸泡清洗。

3．上样：胶条使用前20min从冰箱（4℃）中取出。

上样可以采用水化上样或者使用上样杯（先水化，后上样），上样杯上样适用于极性等电点蛋白质，水化12h后，在电泳槽上样。

以水化上样为例：先将250μL样品和水化液（需要当天配制）混合物加到胶条槽里，然后从尖端（阳性端）撕掉保护膜（带IO号），将胶条支持膜向上，胶面向下，用配用镊子夹住平端放入胶条槽中，注意不要产生气泡，用覆盖油覆盖，盖上盖子。

说明：放入胶条槽中的胶条上的字应该顺向能够读出，说明胶条放的对，如果读不出来，说明放反了。

在电脑软件中设置操作参数：水化上样分为被动上样（就是这种浸泡状态维持约16h）和主动上样（加电压30V，大约需要10h）。

上样后即可进行IEF电泳。

注意每种胶条最大的电流不能超过50μA。

一般是30V电压水化12h，然后200V、500V、1000V各1h，最后用8000V电压电泳至结束。

4.胶条的平衡：平衡液制备时先将SDS在加热的条件下溶解于水中，SDS溶解后冷却至20℃左右，在加入尿素充分溶解，然后加甘油混匀成水溶液。

将该水溶液分成两份，每份15mL，分装到两个平衡管中，其中一个管中加DTT，另一个管中加IAA，DTT可以打开蛋白的二硫键，防止在聚焦时形成的氧化导致在第二向拖尾，尿素、甘油可以降低电离效应，使胶条可以很好的转入第二向，IAA可以将去除DTT。

双向电泳完整操作流程仪器：Eppendorf 冷冻离心机 (Eppendorf)、Beckman Coulter 高速冷冻离心机（Beckman Coulter）、IPGhor 等电聚焦仪（GE Healthcare）、DALT-SIX SDS-PAGE电泳仪（GE Healthcare）、ImageScanner扫描仪（GE Healthcare）、ImageMaster 2D Platinum 7.0分析软件（GE Healthcare）、电子天平、分光光度计、旋涡混和器、PH计、真空冷冻干燥机、液氮、离心管、研钵主要溶液配置：三氯乙酸-丙酮沉淀液：10%三氯乙酸、0.07%巯基乙醇溶于100%丙酮丙酮洗涤液：0.07%巯基乙醇溶于丙酮样品裂解液：9mol/L尿素、4％CHAPS、1%IPG buffer（GE Healthcare）、1%DTT样品水化液：9mol/L尿素、4％CHAPS、1%IPG buffer（GE Healthcare）、1%DTT、少量溴芬兰定量染色液：0.01%（w/v）G250，8.5%磷酸和4.75%乙醇标准蛋白溶液：1mg/ml牛血清蛋白平衡缓冲液1：6mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=8.8)、30%甘油、2%SDS，1%DTT，痕量溴酚兰平衡缓冲液2：6mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCL(pH=8.8)、30%甘油、2%SDS，4%碘乙酰胺，痕量溴酚兰12%SDS-PAGE凝胶溶液：12%丙烯酰胺、0.32%双丙烯酰胺、0.375mol/L Tris-HCL（pH=8.8）、0.1%SDS、0.05%过硫酸铵、0.05%TEMED 电泳缓冲液：25mmol/L Tris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS封胶液：25mmol/L Tris、192mmol/L甘氨酸、0.1%SDS、0.5%琼脂糖考染固定液：12%（W/V）三氯醋酸考染染色液：0.12%G-250、10%（NH4）2SO4、10% H3PO4、20%甲醇。

双向凝胶电泳（2-DE）双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。

近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。

分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。

在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm×20cm）可分出3～4千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。

80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。

由于可以建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率。

此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。

这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。

第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10～100kD分子量的蛋白质。

其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的还是用同位素标记，20ppm 的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。

用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即所谓“参考胶图谱”。

蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的分析。

最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析，确定它们是已知还是未知蛋白。

现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做4～5个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。

第一部分介绍1.0手册的介绍这本手册分五大部分。

第一部分对手册进行了介绍。

第二部分介绍了样品预处理的方法。

第三部分细叙了进行双向电泳第一向电泳的过程。

第四部分介绍了利用IPG胶条进行第二向电泳的一般方法。

第五部分讨论了双向电泳的显影和结果分析。

在这里，使用Amersham pharmacia Bioteeh公司的产品进行双向电泳介绍，设备的选择我们在1、2节中介绍。

1.1 双向电泳的介绍双向电泳是分析从细胞、组织或其它生物样品中提取出来的蛋白混合物最有力和广泛运用的方法。

这项技术利用蛋白质在两次独立的分离步骤中的特性将蛋白质分开：第一向步骤——等电聚焦（IEF）根据蛋白质的等电点（PI）将蛋白质分离。

在第二向步骤中SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）利用蛋白质的分子量（MW）大小将它们分离。

二向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。

因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。

双向电泳在1975年由P.H.OFarrel[1]和J.Klose[2]提出，在早先的技术中，第一向分离在含有载体两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶载体中进行，这种胶在狭窄的试管中灌注而成。

样品放入管胶的某一端，并且在很高的电压下将它们分开。

在完成等电聚焦（IEF）以后，凝胶棒从管子中取出来，在SDS样品缓冲液中平衡。

随后，放在垂直SDS—聚丙烯酰胺凝胶上，进行第二向分离。

自从双向电泳被被提出以来，双向电泳作为生化分离技术的重要性事实上早已被承认。

但是，它是在最近几年被广泛应用的，由于在各方面的改进。

■2—D技术被改进而产生了2—D的图象，这在分辨率和重复性上有很大提高。

这项新技术是由A.Gorg和他的同事发明的。

在2—D技术中，使第一向电泳得到了改进，利用固定的pH梯度代替了载体两性电解质产生的pH梯度，并且用塑料胶片支撑的凝胶条代替了柱状凝胶。

在章节3.1“Background to IEF”中阐述了这种技术的优越性。

一、分子生物学实验室仪器电泳仪使用方法：
1、接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定电泳终止时间，此时电泳即开始进行。

2、首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。

3、工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拨出电泳插头。

4、电泳仪电源开关调至关的位置，电压旋钮转到最小，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。

二、分子生物学实验室仪器电泳仪注意事项：
1、在总电流不超过仪器额定电流时(最大电流范围)，可以多槽关联使用，但要注意不能超载，否则容易影响仪器寿命。

2、电泳仪通电进入工作状态后，禁止人体接触电极、电泳物及其它可能带电部分，也不能到电泳槽内取放东西，如需要应先断电，以免触电。

同时要求仪器必须有良好接地端，以防漏电。

3、某些特殊情况下需检查仪器电泳输入情况时，允许在稳压状态下空载开机，但在稳流状态下必须先接好负载再开机，否则电压表指针将大幅度跳动，容易造成不必要的人为机器损坏。

4、仪器通电后，不要临时增加或拨除输出导线插头，以防短路现象发生，虽然仪器内部附设有保险丝，但短路现象仍有可能导致仪器损坏。

5、使用过程中发现异常现象，如较大噪音、放电或异常气味，须立即切断电源，进行检修，以免发生意外事故。

6、由于不同介质支持物的电阻值不同，电泳时所通过的电流量也不同，其泳动速度及泳至终点所需时间也不同，故不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。

细胞裂解（蛋白质提取）一、试剂配置：PBS配方氯化钠(MW 58.44) 130mM 8g氯化钾(MW 74.5) 2.7mM 0.2g十二水和磷酸氢二钠(MW 358) 10 mM3.63g磷酸二氢钾(MW 136) 2 mM0.24g加水至1L配好后进行高压灭菌。

Washing buffer（500mL）配方Tris（MW 121.1） 10mM 0.605g蔗糖（MW 342） 250mM 42.75g加水溶解，用HCl调pH至7.0后用孔径为0.22µm滤膜过滤（使用1M盐酸略高于2750uL调pH）裂解储液配方（细胞）：尿素(MW 60.06) 7M 4.2g硫脲(MW 76.12) 2M 1.52gCHAPS(MW614.89) 4%（W/V）0.4g 加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。

裂解储液配方（组织）：尿素(MW 60.06)5M3g硫脲(MW 76.12) 2M1.52gCHAPS(MW614.89) 2% 0.2gTris（MW 121.1）40mM 0.048g加超纯水定容至10mL后经0.22µm一次性滤膜过滤，过滤后分装成20小管，每小管500uL，-20℃冰箱保存。

裂解液：裂解液储液 100uLIPG buffer（pH可选） 2% 2uLPi 2uLNucLease mix（100×） 1uLPMSF（100mM：20mg/mL） 1mM 1uLDTT（0.411g/mL） 40mM 1.5uLPi：每片使用200uL超纯水溶解后按10 uL分装考马斯亮蓝G-250：考马斯亮蓝G-250 0.01% 100g95%乙醇 4.7% 50mlH3PO4 8.5% 85g 将考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，与用水溶解的100ml H3PO4混合后稀释至1000ml，之后使用滤纸过滤。

双向电泳的操作步骤一、第一向等电聚焦1、从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液,置室温溶解。

2、从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条，室温中放置10分钟。

3、沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。

在槽两端各1cm 左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。

注意：不要产生气泡。

否则影响到胶条中蛋白质的分布。

4、当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。

5、分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。

确保胶条与电极紧密接触。

不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。

同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。

如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。

6、在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。

需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

7、对好正、负极，盖上盖子。

设置等电聚焦程序。

8、聚焦结束的胶条。

立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。

二、第二向SDS-PAGE电泳1、配制10%的丙烯酰胺凝胶两块,从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。

2、配制胶条平衡缓冲液I。

3、在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。

将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。

这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

4、将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I。

将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

5、配制胶条平衡缓冲液II。

6、第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。

双向电泳仪使用注意事项双向电泳仪是一种常用的实验仪器，广泛应用于蛋白质分析、基因测序等领域。

正确使用双向电泳仪能够提高实验结果的准确性和可靠性。

下面将介绍一些双向电泳仪的使用注意事项，以帮助读者更好地操作该仪器。

1. 仪器检查和准备在使用双向电泳仪之前，需要进行仪器的检查和准备工作。

首先，确保仪器的电源和连接线路正常无损，并检查仪器的各个部件是否完好。

接下来，检查电泳槽中的缓冲液是否充足，并根据实验需要进行调整。

此外，还需要检查电泳槽的温度控制系统是否正常工作，以及电泳槽内的电极是否安装正确。

只有在仪器检查和准备工作完成后，才能进行实验操作。

2. 样品处理和加载在进行双向电泳实验之前，需要对样品进行处理和加载。

首先，将待测样品进行蛋白质提取或基因提取，并根据实验目的选择相应的电泳胶进行凝胶制备。

凝胶制备完成后，将样品加载到凝胶的适当位置上。

在加载样品之前，可以在凝胶的加载点处加入一定量的标记染料，以便观察电泳进程和结果。

3. 电泳条件设置在进行双向电泳实验时，需要合理设置电泳条件。

首先，根据样品的性质和实验目的选择合适的电泳缓冲液和电泳温度。

然后，根据凝胶的大小和样品的数量设置电场强度和运行时间。

通常情况下，电泳开始时先采用较低的电场强度进行预运行，然后逐渐增加电场强度进行正式运行。

在整个电泳过程中，需要注意保持电场强度和温度的稳定，以确保实验结果的可重复性和准确性。

4. 实验记录和数据分析在进行双向电泳实验时，需要及时记录实验过程和观察结果。

记录的内容包括实验日期、样品名称、电泳条件、实验操作等。

同时，还需要记录凝胶的电泳进程和结果，包括蛋白质或基因的迁移位置和带状图案。

实验记录的完整和准确对于后续的数据分析和结果解释至关重要。

5. 仪器维护和清洁在使用双向电泳仪之后，需要进行仪器的维护和清洁工作。

首先，及时清除电泳槽内的残留凝胶和缓冲液，避免其对仪器产生腐蚀和污染。

其次，对仪器的电极进行清洗和消毒，以保持其表面的洁净。

电泳仪使用说明书一、简介电泳仪属于生物实验室中常用的仪器设备，用于分离和检测生物样品中的DNA、RNA或蛋白质等分子。

本使用说明书旨在帮助用户正确、安全地操作电泳仪，并获得准确可靠的实验结果。

二、安全操作须知1. 请在设备通电前检查电源线是否有损坏，若发现损坏应及时更换。

2. 在搬动和操作电泳仪时，请确保双脚保持稳定，避免发生滑倒或跌倒等意外情况。

3. 使用仪器时，避免将手指或金属物体放入仪器内部。

同时，请务必配备防护手套，避免化学药品的直接接触。

4. 在更换试剂或样品时，应先关闭电源，并将电泳仪调至待机状态。

5. 如需进行高压操作，请确保所使用的试剂和样品具有足够的电泳条件，以免发生电弧和其他危险。

6. 使用本电泳仪应有专业人员指导，未经培训或经验不足者应在有资质指导下进行操作。

三、技术参数1. 电压范围：0-300V2. 电流范围：0-500mA3. 温控范围：室温至80℃4. 液舱尺寸：20cm×20cm×5cm5. 最大样品加载量：50μg四、使用步骤1. 首先，将电泳仪放置在平稳的工作台上，并确认电源线已插入电源插座。

2. 将所需试剂加入电泳仪液舱中，并确保试剂达到液舱的最低液位线。

3. 打开电泳仪面板上的电源开关，并调节到所需的电压和电流设置。

4. 确认电泳仪的盖板已经安全关闭，并将试样架放入液舱中。

5. 打开电泳仪的定时器和温度控制器，并设置所需的运行时间和温度。

6. 等待电泳仪运行完毕后，关闭电源开关，将电泳仪内的试样架取出，并进行下一步处理。

7. 清洗电泳仪液舱及相关配件，并妥善保管在指定位置，以备下次使用。

五、常见故障及排除方法1. 电泳不完整或不均匀：可能是电泳液中试剂浓度不足，可尝试提高试剂浓度或延长电泳时间。

2. 电泳结果模糊：可能是试样加载不规范或电泳时间过长，可尝试重新加载试样和减少电泳时间。

3. 电泳仪不工作：请检查电源线是否插紧，并确认电源是否正常。