菌种与种子扩大培养
2008-05-11 15:12:43| 分类： 默认分类 阅读337 评论0 字号：大中小 订阅
1.1 微生物工业用菌种
1.1.1 发酵工业对生产菌种的要求
1) 能在易得、价廉的原料制成的培养基上迅速生长，且代谢产物产量高（目标产物的产量尽可能接近理论转化率）。目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离。
2) 发酵条件粗放、易于控制，且所需的酶活性高。
3) 菌种生长和发酵速度较快，发酵周期短。发酵周期短的优点在于感染杂菌的机会减少；提高设备的利用率。
4) 根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变菌株（微生物菌种缺少或丧失了合成某种或多种必需生长因子的能力）或调节突变菌株或野生菌株。
5) 抗杂菌、抗噬菌体能力强。
6) 菌种纯粹，遗传性状稳定（不易变异退化），以保证发酵生产和产品质量的稳定性。菌种退化，生产性能下降是生产中常碰到的问题。
7) 菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素等），以保证安全。使用新菌种时更应注意；应用食品领域更需经严格鉴定，如早期酱油生产采用黄曲霉，现已停止。
1.1.2 工业上常用的微生物
微生物的共同特性
1) 个体小、构造简单；
2) 容易培养、易于代谢；
3) 生长旺盛、繁殖迅速；
4) 适应性强、容易变异；
5) 分布广泛、种类繁多
工业上常用的微生物
发酵工业上常用的微生物有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌四大类群。要求复习微生物知识，掌握工业上常用微生物的基本形态。此处介绍其中具有工业价值的主要微生物。
细菌 细菌是自然界中分布最广、数量最多、与人类关系最为密切的一类微生物，也是发酵工业上使用最多的一种单细胞生物。细菌的一般结构包括细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体及内含物几部分；特殊结构是某些细菌所特有的，如荚膜、鞭毛、芽胞等，它们在细菌的分类鉴定中有重要的意义。
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-1 简答题
1、请简述发酵工程发展史上的四个转折点。
答：第一个转折点：非食品工业；
第二个转折点：青霉素→抗菌素发酵工业；
第三个转折点：切断支路代谢:酶的活力调控,酶的合成调控(反馈控制和反馈阻遏),解除菌体自身的反馈调节,
突变株的应用,前体、终产物、副产物等； 近代转折点：基因、动物、海洋
2、请简述20世纪70年代现代生物技术取得的标志性进展有哪些？
答：细胞融合技术、基因操作技术等生物技术发展，打破了生物种间障碍，能定向地制造出新的有用的微生物；基因组与基因组功能；细胞大规模培养──微生物、动植物细胞、藻类细胞等。
3、请简述工业化生产对菌种的要求有哪些？
答：能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物；有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强；遗传性能要相对稳定；不易感染它种微生物或噬菌体；生产菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）；生产特性要符合工艺要求。
4、请简述菌种选育与分子改造的目的与方法。
答：目的：防止菌种退化；解决生产实际问题；提高生产能力；提高产品质量；开发新产品。 方法： 基因突变：自然选育、诱变育种；
基因重组：杂交、原生质体融合、基因工程； 百度文库 - 好好学习，天天向上
-2 基因的直接进化：点突变、易错PCR、同序法DNA Shuffling等.
5、请简述工业生产对发酵培养基的要求。
答：1.培养基能够满足产物最经济的合成。
2.发酵后所形成的副产物尽可能的少。
3.培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。
4. 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。
6、请解释在发酵培养基中添加产物促进剂为什么能够提高产量？
第四章 种子扩大培养 第一节 种子扩大与制备 定义 种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 这些纯种培养物称为种子。 种子制备的工艺流程 •种子制备的过程大致可分为： •实验室种子制备阶段 •生产车间种子制备阶段 华南农业大学食品学院生物工程系
Slant stock Shake flask 1 to 20 L fermentor Laboratory Pilot Plant Plant
20 to 5000 L fermentor ＞5M3 fermentor 培养15小时的枯草芽孢杆菌 一、实验室种子制备 实验室种子的制备一般采用两种方式 对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，操作简便，不易污染杂菌。 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。 （一）孢子的制备 1、细菌孢子(芽孢)的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。 培养温度一般为37℃。 细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。 （一）孢子的制备 2、霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基 培养的温度一般为25~28℃。 培养时间一般为4~14天。 （三）孢子的制备 3、放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。 培养温度一般为28℃。 培养时间为5~14天。 （二）液体种子制备 1、好氧培养： 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S. Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。 试管→三角瓶→摇床→种子罐 2、厌氧培养： 对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐 3. 表面培养法： 对于不产孢子的细菌，如谷氨酸棒杆菌等。可利用茄子瓶，克氏瓶等。 4. 固态培养法： 对于一些产孢子能力强，以及孢子发芽，生长繁殖快的菌种。用孢子直接接种罐，简便，不易污染。 利用三角瓶，克氏瓶等。 二、生产车间种子制备 •实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。满足发酵灌对种子 的要求。 1. 种子罐级数的确定 种子罐的作用：主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌丝，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。 种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于： —菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； —所采用发酵罐的容积 —所需种子数量(1%-5%计算) 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27℃,40小时孢子发芽，产生菌丝 ）→二级种子罐（ 27℃,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵 酵母：比细菌慢，比霉菌、放线菌快，通常用一级种子 确定种子罐级数需注意的问题 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会; 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐生产率，增加染菌机会; 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。 第二节 影响种子质量的因素及控制 菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短； 生理形状稳定； 生长一致； 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求 无杂菌污染； 保持稳定的生产能力。 从菌体形态、生化指标等方面判断 一、理想种子的标准 •培养基与培养条件 •接种龄与接种量 二、影响种子质量的因素 接种龄与接种量 种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。 不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好。
发酵工程的发展历史
第一个转折点：非食品工业
第二个转折点：青霉素→抗菌素发酵工业
第三个转折点：切断支路代谢:酶的活力调控,酶的合成调控(反馈控制和反馈阻遏),解除菌体自身的反馈调节, 突变株的应用,前体、终产物、副产物等
近代转折点：基因、动物、海洋
传统的粗放型经济增长方式必定走到尽头，必需走资源节约型、环境友好型的道路
发酵工程的主要：过程优化与放大
工程菌和工程细胞：工程菌就是采用生物工程技术将多种微生物的降解性基因从细胞中取出，然后组装到细菌细胞中，使这个菌株具有多种微生物的降解性功能，同时可降解多种化合物。具有多功能、高效和适应性强等特点
工程菌和工程细胞的区别
工程菌是经过改造了被转入了基因的细菌。
工程细胞就经过改造了被转入了基因的细胞
1989年，我国批准了第一个在我国生产的基因工程药物——重组人α-1b 干扰素
菌种选育
原理：依据微生物的代谢调节机制人为定向控制目的产物的积累。
目的：经过人工选育得到具有一定生产能力的菌种，提高我们的生产效率。几种常见 的育种技术
自然选育
自然选育的定义：在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程。
自然突变的定义：是指某些微生物在没有人工参与下的基因改变。
自然突变的原因： 低剂量诱变效应和互变异构效应。
自然突变导致的结果：有利的和不利的。
自然选育的优 点认为简单易行，缺点使效率低、进展慢。
诱变育种；
定义：利用物理、化学或生物因素处理微生物细胞群体，促使其中少数细胞中的遗传物质的结构发生改变，从而引起微生物的遗传性状发生变化，然后通过一定方法筛选出性状优良的突变菌株的过程。
常用的物理和化学诱变剂：
紫外线，快种子，氨芥，亚硝酸，亚硝基胍，航天 育种
优点：提高了菌种的突变和变异的幅度，缺点：长期使用诱变剂处理后，菌种生活能力下降。
杂交育种；
