生化药物生产
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⽣化药物⽣产
-------夏⼩落
项⽬⼆核酸的⽣产1、预⽅案
2、确定⽅案
3、实训过程
4、实训报告
预⽅案
⼀、简单介绍
在1869年，F. Mischer从细胞核中分离得到⼀种酸性物质，即现在被称为核酸的物质。1939年，E. Knapp等第⼀次⽤实验⽅法证实核酸是⽣命遗传的基础物质。
核酸不仅携带有各种⽣物所特有的遗传信息⽽且影响⽣物的蛋⽩质合成和脂肪、糖类的代谢。
核酸包括DNA、RNA两种，DNA主要存在于细胞核中，占总DNA的98%，另2%存在于线粒体和叶绿体：RNA主要存在于细胞质中，约占总RNA的90%，另10%存在于细胞核⾥的核仁、核浆和染⾊体中。核酸的含量与细胞的⼤⼩⽆关，所以制备核酸时常采⽤⽣长较旺盛的组织，如胰、脾、胸腺等，这类组织⽐同样体积的其他组织，如肌⾁、脑等组织含有更多的细胞数，因⽽就有更⾼的核酸含量。核酸的组成
⼆、核酸类药物的分类及应⽤
核酸类药物可分为两⼤类：
第⼀类为具有天然结构的核酸类物质，这类药物有助于改善机体的物质代谢和能量代谢平衡，加速受损组织的修复，促使机体恢复正常⽣理机能。临床上⼴泛使⽤于⾎⼩板减少症、⽩细胞减少症、急慢性肝炎、⼼⾎管疾病、肌⾁萎缩等代谢障碍性疾病。该核酸类药物有肌苷、ATP、辅酶A等。这些药物多数是⽣物体⾃⾝能够合成的物质，它们基本上都可以经微⽣物发酵或从⽣物资源中提取⽣产。
第⼆类为⾃然结构碱基、核苷、核苷酸的结构类似物或聚合物，这类药物⼤部分由⾃然结构的核酸类物质通过半合成⽣产，此类药物是治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要药物，也是产⽣⼲扰素、免疫抑制剂的临床药物。临床上⽤于抗病毒的这类药物有三氟代胸苷、叠氮胸苷等8种。此外还有氮杂鸟嘌呤、巯嘌呤、氟胞嘧啶、聚肌胞、阿糖胞苷等都已⽤于临床。
三、核酸类药物的⽣产⽅法
（1）酶解法
酶解法是先⽤糖质原料、亚硫酸纸浆废液或其他原料发酵⽣产酵母，再从酵母菌体中提取核糖核酸(RNA)，提取出的核糖核酸经过青霉菌属或链霉菌属等微⽣物产⽣的酶进⾏酶解，制成各种核
（2）半合成法
半合成法即微⽣物发酵和化学合成并⽤的⽅法。例如由发酵法先制成5-氨基4-甲酰胺咪唑核苷(AICAR)，再⽤化学合成制成鸟苷酸。⼜如⽤发酵法先制成肌苷，再利⽤微⽣物的或化学的磷酸化作⽤，使肌苷转变为肌苷酸。
（3）直接发酵法
直接发酵法是根据⽣产菌的特点，采⽤营养缺陷型菌株或营养缺陷型兼结构类似物抗性菌株，通过控制适当的发酵条件，打破菌体对核酸类物质的代谢调节控制，使之发酵⽣产⼤量的⽬的核苷或核苷酸。例如⽤产氨短杆菌腺膘呤缺陷型突变株直接发酵⽣产肌苷酸。
四、核酸分⼦提取的技术路线
（⼀）核酸的释放I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或⽔中
细胞破碎的⽅法机械法
⾼速组织捣碎机
玻璃匀浆器
研钵
物理法
超声匀浆器
冻融法
化学法
⾃溶法
酶处理
表⾯活性剂处理法
（⼆）核酸的提取过程
破碎细胞核酸从细胞中游离出来
酚和氯仿
沉淀核酸除去蛋⽩质
⼄醇
（三）DNA的⽣产DNA提取的⼏种⽅法
（1）. 浓盐法，
（2）. 阴离⼦去污剂法，
（3）. 苯酚抽提法，
（4）. ⽔抽提法，
步骤：动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍重量⽣理盐⽔经组织捣碎机捣碎1分钟，匀浆于2500rpm离⼼30分钟，沉淀⽤同样体积的⽣理盐⽔洗涤3次，每次洗后离⼼，将沉淀悬浮于20倍重量的冷⽣理盐⽔中，再捣碎3分钟，加⼊2倍量5％的（⽤45%⼄醇作溶剂）⼗⼆烷基磺酸钠，并搅拌2～3⼩时，在0℃2500rpm离⼼，在上层液中加⼊等体积的冷95％⼄醇，离⼼即可得到纤维状DNA，再⽤冷⼄醇和丙酮洗涤，减压低温⼲燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏⽔，加⼊5％⼗⼆烷基磺酸钠达1/10体积，搅拌1⼩时，经5000rpm离⼼1⼩时，清液中加⼊NaCl达1mol/L，再缓慢加⼊冷95%⼄醇，DNA析出，经⼄醇、丙酮洗涤，真空⼲燥得具有⽣物活性的DNA（活性DNA制备需在0～3℃操作）。
（四）RNA提取⽅法
（1）稀碱法：是⽤氢氧化钠溶液（1%），使细胞壁变性，
使核酸从细胞内释放出来。需⽤酸中和pH＝7。然后除去菌体，将pH调⾄RNA的等电点（pH2.5），使RNA沉淀出来。
（2）浓盐法：是⽤⾼浓度盐溶液（6%~8%）处理，同时加
热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。脱氧核糖核蛋⽩溶于浓盐溶液1mol/L，不溶于0.14mol/L，⽽核糖核蛋⽩溶于0.14mol/L盐溶液。
要避免分⼦降解，可采⽤苯酚法制备RNA。⽤苯酚处理⽣物材料，使蛋⽩质变性，然后离⼼，上层⽔溶液内含有全部RNA，可⽤⼄醇沉淀出来。
步骤：1．提取
称取⼲酵母粉2g于50mL三⾓瓶内。加10% Nacl溶液10mL，搅拌均匀，然后于沸⽔浴中提取半⼩时。2.分离
将上述提取液取出，⽤⾃来⽔冷却，分装在离⼼管内，以3500r/min离⼼10min，使提取液与菌体残渣等分离。
3.沉淀RNA
将离⼼得到的上清液倾于50mL烧杯内，并置于放有冰块250mL烧杯中冷却。待溶液冷⾄10℃以下时，在搅拌下⼩⼼地⽤6mol/L HCL 溶液调节pH⾄2.0～2.5。随着pH值的下降，溶液中⽩⾊沉淀逐渐增加，到等电点时沉淀量最多（注意严格控制pH值）。调好后继续于冰浴中静置10min，使沉淀充分，颗粒变⼤。
4.冼涤
上述悬浮液3000r/min离⼼5min，得到RNA沉淀。⼩⼼弃去上清液，加⼊3mL 0.5mol/L碳酸氢钠溶液溶解沉淀（必要时⽤玻捧搅拌沉淀物以助溶解，如有不溶物则为杂质）。在4000r/min离⼼1min。取上清液于另⼀离⼼管中，加⼊2倍体积的95%⼄醇，混匀。重新沉淀RNA，3000r/min离⼼5min，即得湿RNA粗制品。
（如果要⼲燥的RNA制品，可在真空⼲燥箱内烘⼲。如果要得到精制可进⾏多次沉淀。）
五、离⼼机使⽤的注意事项
（1）实验室离⼼机在预冷状态时，离⼼机盖必须关闭，离⼼结束后取出转头要倒置于实验台上，擦⼲腔内余⽔，离⼼机盖处于打开状态。
（2）转头在预冷时转头盖可摆放在离⼼机的平台上，或摆放在实验台上，千万不可不拧紧浮放在转头上，因为⼀旦误启动，转头盖就会飞出，造成事故！
（3）转头盖在拧紧后⼀定要⽤⼿指触摸转头与转盖之间有⽆缝隙，如有缝隙要拧开重新拧紧，直⾄确认⽆缝隙⽅可启动离⼼机。
（4）在离⼼过程中，操作⼈员不得离开离⼼机室，⼀旦发⽣异常情况操作⼈员不能关电源(POWER），要按STOP。在预冷前要填写好离⼼机使⽤记录。
（5）不得使⽤伪劣的国产离⼼管，不得使⽤⽼化、变形、有裂纹的
离⼼管。
（6）在节假⽇和晚间最后⼀个使⽤离⼼机例⾏安全检查后⽅能离去。
项⽬三丙种球蛋⽩的制备
任务1 丙种球蛋⽩分离制备⽅案的制定
――聚丙烯酰胺凝胶电泳制备丙种球蛋⽩
1、预⽅案
2、确定⽅案
3、实训过程
4、实训报告
项⽬三丙种球蛋⽩的制备
任务2 丙种球蛋⽩分离制备⽅案的制定
――Sephadex G-50 分离丙种球蛋⽩1、预⽅案
2、确定⽅案
3、实训过程
4、实训报告
项⽬四超氧化物歧化酶（SOD）的⽣产
任务1 SOD 制备⽅案的制定1、预⽅案
2、确定⽅案
3、实训过程
4、实训报告
⼀、简单介绍
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)，作为⼀种专⼀清除⽣物体内超氧阴离⼦⾃由基(O2-)的酶，催化超氧阴离⼦⾃由基发⽣歧化反应，减少超氧阴离⼦⾃由基对⽣物体的毒害。它是1968年由Mocord和Fmidovich发现的。此酶属⾦属酶，⼴泛存在于动植物、微⽣物细胞中。⽬前，⼈们已从动物、植物和微⽣物体内分离得到，并且通过多种⽅法应⽤到实际中，如应⽤到医药⽅⾯、⾷品、农业、化妆品及⼈和动植物许多疾病的监测⽅⾯等。
何为⾃由基？
⾃由基，机体氧化反应中产⽣的有害化合物，具有强氧化性，可损害机体的组织和细胞，进⽽引起慢性疾病及衰⽼效应。
⾃由基引发的疾病：
脑：⽼年痴呆、帕⾦森⽒症、脑循环障碍
⽪肤：异位性⽪肤炎、⾊素沉着⿊斑、⽼⼈斑、
⽪肤过敏
⼼⾎管：⾼⾎压、动脉硬化、⼼肌梗塞、⼼肌
⽆⼒、⼼律不整
眼睛：⽩内障、退化性眼底病变，新⽣⼉视⽹
膜病变
呼吸系统：⿐⼦过敏、⽓喘、肺⽓肿、肺纤维
化、成⼈呼吸窘迫症
泌尿系统：肾脏病、蛋⽩尿、膀胱炎、肾丝球 发炎 其它：便秘、⼝臭、糖尿病及共并发症、风湿性关节炎、癌症、化疗副作⽤⼿术、器官移植、肝炎、更年期。 SOD----震惊世界的发现！
⽣物学及医学界称—SOD 为氧⾃由基的唯⼀清除剂 ！
中国的医⽣们把—SOD 作为最有效的⽣命抗衰剂！ 英国的医⽣们把—SOD 作为抑制癌症最好的新药药品！
美国的医⽣们把—SOD 作为伤⼝最好的愈合剂！
欧洲的医⽣们把—SOD 作为⼼脑⾎管疾病最新医学⼿段！
社会科学界称——SOD 为“⼈体垃圾的清道夫！神奇魔⼒的酶！SOD 清除
中和修复SOD⼗⼤功效
1，清除⾃由基，提⾼免疫⼒，改善睡眠，增强记忆⼒，延缓衰⽼2，有效降低⾎脂，⾎压，胆固醇，⾎粘度，预防⽼年性痴呆3，增强肝胆功能
4，预防⽼年性⽩内障，提⾼视⼒
5，对糖尿病有明显的辅助治疗作⽤
6，调节⼥性⽣理周期，推迟更年期，防治前列腺炎
7，提⾼关节活动能⼒，防治⾻性关节炎，类风湿性关节炎
8，有效预防肿瘤，癌症的发⽣发展
9，防治⿊⾊素的形成，美⽩祛斑，祛皱，祛痘
10，增强创伤愈合能⼒
SOD在各产业中的应⽤⽐例
SOD的分类介绍：
1、铜和锌型，称为Ｃｕ、Ｚｎ-ＳＯＤ，是最常见的⼀种，动物SOD呈蓝绿⾊，植物SOD呈⽩⾊，主要存在于真核细胞的细胞浆内。2、锰，称为Ｍｎ-ＳＯＤ，呈粉红⾊，主要存在于原核细胞体、真核细胞的细胞浆和线粒体内。
3、铁，称为Ｆｅ-ＳＯＤ，呈黄褐⾊，主要存在于原核细胞中。
⼆、SOD的理化性质SOD是⼀种⾦属蛋⽩，因此它对热、对pH值在某些性质上表现出异常的稳定性。
1、对热稳定性：构象熔点温度Tm的测定表明SOD是迄今发现稳定性最⾼的球蛋⽩之⼀。
2、pH值对SOD的影响：SOD在pH =5.3-10.5范围内其催化速度不受影响。但pH=3.6是SOD中Zn要脱落95%；pH=12.2时，SOD的构象会发⽣不可逆的转变，从⽽导致酶活性丧失。3、吸收光谱：取决于酶蛋⽩和⾦属辅基，⼏乎所有的Cu，Zn-SOD 的紫外吸收光谱的共同特点是在250-270nm均有不同程度的吸收，⽽在280nm的吸收将不存在或不明显。Cu，Zn-SOD的可见光吸收光谱反应⼆价铜离⼦的光学性质，不同来源的SOD都在680nm处附近呈现最⼤吸收。
4、⾦属辅基与酶活性：Zn仅与酶分⼦结构有关，⽽与催化活性⽆关；Cu与催化活性有关（透析去除Cu则酶活性全部丧失）
三．超氧化物歧化酶的制备
植物超氧化物歧化酶的制备⼯艺，其主要⽬的是纯化植物中的SOD，最⼤限度地清除杂蛋⽩，因此，常⽤的⽅法主要有热变性法、等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、超滤法、层析法等
实验原理（沉淀法)
超氧化物歧化酶（SOD）是⼀种具有抗氧化、抗衰⽼、抗辐射和消炎作⽤的药⽤酶。它可催化氧负离⼦（O2-）进⾏岐化反应，⽣成氧和过氧化氢：2O2- + H2 = O2 + H2O2 。⼤蒜蒜瓣和悬浮培养的⼤蒜细胞中含有较丰富的SOD，组织或细胞破碎后，可⽤pH7.8的磷酸缓冲液提取。由于SOD不容于丙酮，可⽤功丙酮将其沉底析出。
