大鼠骨桥蛋白重组腺病毒的构建及体外表达

大鼠黏结蛋白聚糖1基因重组腺病毒载体的构建及感染效率雷娟;伍卫;周淑娴;张玉玲;薛声能【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2008(012)042【摘要】背景:重组腺病毒质粒的构建方法主要有体外连接法和同源重组法.同源重组法有操作复杂、耗时长、效率低、纯化难的缺点.体外连接法又不可避免非特异性的基冈重组及基因突变.目的:应用改良体外连接法构建携带黏结蛋白聚糖1基因的重组腺病毒载体,测定其在心肌成纤维细胞中的感染效率.设计、时间及地点:单一样奉实验,于2007-08/2008-02在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:穿梭载体pShuttle-CMV(含绿色荧光撒告基因)和腺病毒骨架质粒pAdxsi购自诺赛皋因组研究中心有限公司.方法:核苷酸序列鉴定pCMV-Sport6.1-Sdcl质粒:用Kpn Ⅰ+Xho Ⅰ从质粒pCMV.Sport6.1-Sdc1切出黏结蛋白聚糖1 基因片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,形成重组穿梭质粒.用Ⅰ-CeuI+I-SceI双酶切出重组穿梭质粒中CMV-Sdc1片段,亚克隆至腺病毒基因组质粒中,得到重组腺病毒质粒.将重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒AdCMVSdc1,转化体外培养的心肌成纤维细胞.主要观察指标:用DNA测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的滴度和感染效率.结果:①核苷酸序列分析表明,pCMV-Sport6.1-Sdc1质粒正确携带大鼠黏结蛋白聚糖1 cDNA;黏结蛋白聚糖1基因被克隆于载体pShuttle-CMV上,以Kpn Ⅰ+Xho Ⅰ双晦切可回收3 kb的克隆片段和5.1 kb的载体片段;重组腺病毒质粒用Xho Ⅰ酶切得到7个片段而空载体仅得到6个片段.②重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;提取病毒DNA行聚合酶链反应鉴定可扩增出1.13 kb的特异性片段:用病毒上清多次重复感染293细胞扩增重组腺病毒后,病毒滴度检测达2.0×1011 PFU/mL.③用纯化浓缩后的重组腺病毒以感染复数为100感染心肌成纤维细胞,24 h后所有细胞均表达绿色荧光.结论:成功构建了携带人鼠黏结蛋白聚糖l基因的重组腺病毒载体,经纯化浓缩后具有较高的滴度,能有效转染心肌成纤维细胞.【总页数】4页(P8290-8293)【作者】雷娟;伍卫;周淑娴;张玉玲;薛声能【作者单位】中山大学附属第二医院心血管内科,广东省广州市,510120;中山大学附属第二医院心血管内科,广东省广州市,510120;中山大学附属第二医院心血管内科,广东省广州市,510120;中山大学附属第二医院心血管内科,广东省广州市,510120;中山大学附属第二医院心血管内科,广东省广州市,510120【正文语种】中文【中图分类】R541【相关文献】1.hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究 [J], 李慧勇;袁志诚;陈波;陆培松;李巧玉;曹侃2.构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率 [J], 袁桂仪;伍卫;周淑娴;张玉玲;雷娟3.人骨保护素基因重组腺病毒载体在大鼠骨髓基质细胞中的表达效率 [J], 王晓军;王爱民;张忠荣;吴思宇;郭庆山;贺伟峰;汤守营;张全顺4.HGF基因重组腺病毒载体构建及其转染对大鼠骨髓间充质干细胞增殖和迁移的影响 [J], 罗晓红;曾雯;巨容5.大鼠蛋白聚糖Ⅱ重组腺病毒载体的构建及生物学功能的鉴定 [J], 吴芳;姚航平;董凤芹;李红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

CRT/MAGE -A3重组腺病毒载体的构建及体外表达的研究刘新莉，陈洋，马萍（中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所，沈阳110001）摘要：目的构建钙网织蛋白/黑素瘤抗原基因-A3（CRT/MAGE -A3）双基因重组腺病毒载体，并进行体外表达研究。

方法从表达质粒pcDNA3/CRT 中切取目的片段CRT ，定向克隆至穿梭载体pShuttle -GFP -CMV 。

根据Genbank 中提供的黑素瘤基因序列，设计并合成引物，以人肺癌组织cDNA 文库为模板采用RT -PCR 技术扩增人黑素瘤抗原基因-A3基因片段，测序后将黑素瘤抗原基因-A3基因片段定向克隆至穿梭载体，进而将穿梭载体克隆至Pac Ⅰ限制性内切酶线性化的腺病毒载体pAdxsi 。

结果目的片段CRT 转入穿梭载体后，酶切鉴定pShuttle -（ΔGFP ）-CRT 正确。

人肺癌组织经RT -PCR 扩增出大小约950bp 的基因片段，测序证实为MAGE -A3DNA 后，克隆至穿梭载体pShuttle -（ΔGFP ）-CRT 构建穿梭载体pShuttle -CRT -MAGE -A3，酶切鉴定证实构建正确。

酶切穿梭载体将双基因片段克隆至腺病毒载体pAdxsi 得到Ad -CRT/MAGE -A3病毒载体，酶切鉴定证实构建成功。

转染293LP 细胞并用Western blot 检测到其体外表达。

结论成功构建CRT/MAGE -A3重组腺病毒载体并证实其能在体外有效表达CRT 蛋白及MAGE -A3蛋白。

关键词：钙网织蛋白；黑素瘤抗原基因-Ａ３；腺病毒；基因治疗中图分类号：R73文献标志码：A文章编号：0258-4646（2009）07-0493-04Construction and Expression of Recombinant Adenovirus for CRT/MAGE -A3抗原特异性肿瘤免疫治疗结合抑制肿瘤血管生成治疗的方法能够区分肿瘤与非肿瘤细胞，进而达到系统性治疗肿瘤的目的［1，2］。

·基础研究·骨桥蛋白对鼠皮肤表皮干细胞的生物学影响李琴，王佐林（同济大学附属口腔医院口腔种植科，上海200072）[摘要]目的：分离、培养并鉴定SD大鼠表皮干细胞；观察骨桥蛋白重组因子(recombinant rat osteopontin,rrOPN)对表皮干细胞体外增殖作用及促IL-6和IL-1β炎性因子分泌作用的影响。

方法：体外分离培养大鼠表皮干细胞，用倒置显微镜及电镜观察其形态，采用β1-整合素、CK15、CK19、CK5及CK10染色鉴定,并进行细胞生长曲线测定,流式细胞仪分析及细胞克隆形成率测定,以角质形成细胞作为对照。

实验对不同浓度rrOPN处理的表皮干细胞采用MTT法测定细胞生长率，ELISA法测定IL-6、IL-1炎性因子分泌的变化。

结果：倒置显微镜观察所得鼠表皮干细胞呈上皮样生长，电镜观察细胞胞核大，较多处于分裂象。

免疫组织化学检测表皮干细胞β1-整合素、CK15、CK19、CK5及CK10染色均呈阳性。

细胞周期分析表皮干细胞中48.9%的细胞处于DNA合成期,细胞克隆形成率为34.7%。

5～50ng/mL 的rrOPN促进角质形成细胞生长，浓度为15ng/mL的rrOPN促进细胞生长作用最显著(P<0.05)。

rrOPN引起IL-6明显升高(P<0.05)，IL-1β未见明显上调。

结论：成功建立大鼠表皮干细胞分离、培养方法，rrOPN促进表皮干细胞增殖，并促其炎性因子分泌，影响创口愈合。

[关键词]表皮干细胞；骨桥蛋白（OPN）；细胞培养；创口愈合；鼠[中图分类号]R329.28[文献标志码]A[文章编号]1005-4979（2012）01-0008-07doi:10.3969/j.issn.1005-4979.2012.01.002The Biological Effects of OPN on Skin Epidermal Stem Cells of RatLI Qin,WANG Zuo-lin(Department of Oral Implantology,Hospital of Stomatology,Tongji University,Shanghai200072,China)[Abstract]Objective:The present study was designed to investigate the effects of recombinant rat osteopontin(rrOPN) on the proliferative effects of epidermal stem cells in vitro and the secretion of IL-6and IL-1βby the cells.Methods:The epidermal stem cells were isolated from SD rats and cultured in vitro.The cell growth was observed by an inverted microscope and electron microscope.Immunocytochemistry was used to observed the expression ofβ1-integrin,keratin15 (CK15),keratin19(CK19),keratin5(CK5)and keratin10(CK10).The characteristics of the growth curve were explored, and the cell cycle was determined with flow cytometry(FCM)analysis and the colony forming efficiency(CFE)was studied.Keratinocytes were served as controls.The epidermal stem cells were treated with rrOPN at different concentrations.The influences of rrOPN on the proliferation of epidermal stem cells were checked by MTT assay.The secretion levels of IL-6 and IL-1βin culture supernatant were determined with ELISA.Results:Epidermal stem cells showed an epithelial-like appearance under inverted microscopy.Many mitotic figures were observed by electron microscopy.Positive expression of β1-integrin,CK15,CK19,CK5and CK10of cultured cells were detected by immunocytochemistry.The cell cycle profile analysis showed that48.9%cells were in the S stage.The CFE of the epidermal stem cell was34.7%.Concentration of rrOPN ranging from5ng/mL to50ng/mL could stimulate the proliferation of epidermal stem cells,while most remarkable at the concentration of15ng/mL.The IL-1βlevels were significantly increased after induced with rrOPN(P<0.05),but the IL-6levels had no statistically changed(P＞0.05).Conclusion:Skin Epidermal stem cells of rats can be successfully isolated and cultured in vitro;and rrOPN stimulated the proliferation of epidermal stem cells,and the secretion of IL-1βin epidermal stem cells could be induced with rrOPN.[Key words]epidermal stem cell;osteopontin(OPN);cell culture;would healing;rat收稿日期：2011-11-02基金项目：国家自然科学基金资助项目（30872904）作者简介：李琴（1986—），女，上海人，硕士研究生.E-mail:liqintj1986@通信作者：王佐林，教授.E-mail:zuolin@表皮干细胞在皮肤组织的自我更替及维护机体内环境稳态中发挥着重要作用，应用干细胞的无限增殖和多向分化潜能进行表皮重建将有重大实用价值。

大鼠HSG基因重组腺病毒载体的构建及鉴定郭晖;王占伟;郝文炯;赵巍;沈冰【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2013(0)6【摘要】目的构建大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene,rHSG)的腺病毒载体,观察其在转染大鼠C6胶质瘤细胞后的表达.方法由前期构建的pGM-T-rHSG质粒中酶切rHSG基因片段,亚克隆入 pShuttle-CMV-EGFP重组穿梭载体中,而后与腺病毒骨架质粒pAdxsi酶切连接,经过抗性筛选及酶切鉴定得到阳性的pAdxsi-GFP-rHSG重组质粒；pAdxsi-GFP-rHSG质粒经PacI线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒,进行PCR鉴定和PCR产物测序鉴定,Westem-blot法检测C6胶质瘤细胞转染rHSG后的表达效果.结果酶切鉴定证实rHSG基因正确插入穿梭载体pShuttle-CMV-EGFP,收获病毒后的PCR及测序鉴定pAdxsi-GFP-rHSG重组成功,并能在C6胶质瘤细胞内高效表达.结论成功构建出了介导大鼠增殖抑制基因的腺病毒载体pAdxsi-GFP-rHSG,能在C6胶质瘤细胞内高效表达.%Objective To construct a recombinant adenovirs encoding rat hyperplasia suppressor gene (rHSG) and to investigate the the expression of it on rat C6 brain glioma cells.Methods The rHSG gene was extracted by enzymaticcuting the used pGM-T-rHSG and was identified in previous experiment.It was subcloned in the pShuttle-CMV-EGFP plasmid.The rHSG gene was transferred from pShuttle-rHSG to pAdxsi viral DNA by double enzymatcuting obtaining the recombinant plasmid pAdxsi-GFP-rHSG.The recombinant pAdxsi-GFP-rHSG was selected by kansmycin resistanc andrestriction endonuclease; After linearized by Pac Ⅰ,the recombinant adenovirus DNA pAdxsi-GFP-rHSG was transfected into 293 cells for packaging and amplification.Adxsi-GFP-rHSG was further identified by PCR analysis and PCR products sequencing analysis.The expression was detected by Western-blot analyses with rat C6 brain glioma.Results Restriction enzyme digestion confirmed that rHSG gene was correctly inserted into pShuttle-CMV-EGFP.After being packaged in 293 cells,the recombinant adenovirus Adxsi-GFP-rHSG was identified by PCR analysis and DNA sequencing analysis.The cells transfected with Adxsi-GFP-rHSG resulted in positive expressing the rHSG protein.Conclusion Recombinant adenovirus encoding rat hyperplasia suppressor gene (rHSG) Adxsi-GFP-rHSG was successfully constructed.The expression on rat C5 brain glioma cells was more effective.It wil be helpful to use it in the research of the role rHSG specific therapy in the spongioblastoma tissue.【总页数】5页(P679-682,封3)【作者】郭晖;王占伟;郝文炯;赵巍;沈冰【作者单位】宁夏医科大学,银川750004;宁夏医科大学总医院神经外科,银川750004;宁夏医科大学总医院神经外科,银川750004;郑州市第七人民医院神经外科,郑州450016;延安大学附属医院神经外科,延安716000;宁夏医科大学医学科学技术研究中心,银川750004;宁夏医科大学总医院神经外科,银川750004【正文语种】中文【中图分类】R318【相关文献】1.大鼠ZnT1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 胡英明;梅晰凡;宋长威;李谌2.大鼠TP73基因重组腺病毒载体构建及鉴定 [J], 黄玲玲;张云云;王滨;张瑞;万鹤鸣;洪侃3.大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 袁静;葛坚;俞建雄;4.大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 袁静;葛坚;俞建雄5.大鼠Otos基因重组腺病毒载体的构建和鉴定 [J], 卓贤露;姜振东;魏运军;鲁立;张学渊;袁伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

论著文章编号:100025404(2007)0920806204重组V I P腺病毒载体的构建及其在293细胞的表达宋　敏,白　云,段文元,章　波,杨晓亚,许雪青 (第三军医大学基础医学部医学遗传学教研室,重庆400038) 提　要:目的　构建血管活性肠肽重组腺病毒载体,以期用于体内实验研究。

方法　利用RT2PCR扩增小鼠大脑V I P mRNA,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack2C MV,在pAdeasy内同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增,利用报告基因EGFP对病毒滴度进行监测。

PCR、免疫荧光鉴定pAdeasy2V I P感染293细胞后V I P基因的表达,EL I S A检测重组病毒转染后293细胞上清中的表达。

结果　测序、酶切证实V I P基因重组腺病毒载体构建成功。

RT2PCR,免疫荧光检测pAdeasy2V I P病毒感染的293细胞,均有V I P的表达。

与对照组相比,重组病毒转染后293细胞上清中V I P多肽的表达明显增高。

结论　成功构建了含小鼠V I P基因的重组腺病毒载体,并成功表达V I P多肽。

关键词:血管活性肠肽;腺病毒;基因治疗 中图法分类号:R392.11;R394233;R394.2 文献标识码:ACon structi on,expressi on and i den ti f i ca ti on of reco m b i n an t adenov i rus Ad2V I P i n 293cellsS ONG M in,BA I Yun,DUAN W en2yuan,Z HANG Bo,Y ANG Xiao2ya,XU Xue2qing(Depart m ent of M edical Genetics, College of Medicine,Third M ilitary Medical University,Chongqing400038,China) Abstract:O b jec tive　To construct a recombinant adenovirus encoding vas oactive intestinal pep tide (V I P)f or future gene therapy in vivo.M e tho d s　Full length mouse V I P c DNA linked with an internal ribo2 s ome entry site(I RES)2EGFP cassette was subcl oned int o pAdTrack2C MV shuttle p las m id.The p r oduct was linearized t o mediate homol ogous recombinati on with pAdeasy21vect or in BJ5183host bacteria.The positive cl one was identified by restricti on endonuclease digesti on and further confir med by sequencing.The recombinant adenovirus DNA was transfected int o293cells f or packaging and a mp lificati on of pAdeasy2V I P virus,which was purified by S ART OB I N D Me mbrane Ads orbers.The exp ressi on of V I P was monit ored by EGFP fluorescence in infected cells.V I P pep tide exp ressi on on293cells was detected by PCR,i m munofluorescent method andE L I S A.R e su lts　After transfected with adenovirusDNA,infecti ous viruswas only p r oduced t o cause cyt opath2ic effect in the per m issive cell line293but not in the non2per m issive cell line He La,confir m ing only rep licati on defective but not wild type virus was generated.The s pecific exp ressi on of mouse pAdeasy2V I P was verified by RT2PCR and i m munofluorescent method in293cells after infecti on with pAdeasy2V I P,but not Ad2EGFP,a si m ilarly constructed contr ol virus.pAdeasy2V I P,but not pAd2EGFP,significantly secretes V I P pep tide in su2 pernatant.Co nc l u s i o n　W e have successfully constructed a recombinant adenovirus pAdeasy2V I P that exp res2 ses V I P pep tide in vitro. Key words:vas oactive intestinal pep tide;adenovirus;gene therapy 血管活性肠肽(vas oactive intestinal pep tide,V I P) 基金项目:国家自然科学基金海外青年学者合作研究基金(30228018) Supported by the Nati onal Natural Science Foundati on of China2Joint Research Fund f or Overseas Chinese Young Scholars(30228018) 作者简介:宋　敏(1979-),男,江西省九江市人,博士研究生,助教,主要从事神经免疫方面的研究。

存活蛋白重组腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达[ 08-03-08 14:15:00 ] 编辑：studa20作者：朱雄鹏，陈志哲，林旭，胡建达，李纯团，杨婷，许贞书，吕璐璐，陈彩平，张浪辉【摘要】本研究旨在构建含有人存活蛋白（survivin）基因的重组腺病毒载体，并探讨其在转染树突状细胞中的表达。

以质粒pcDNA3.0-survivin为模板，通过PCR 扩增获得survivin基因全长序列。

PCR产物回收后经酶切，定向插入腺病毒穿梭质粒，获得重组质粒pShuttle-CMV-survivin。

通过双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后，将正确重组体pShuttle-CMV-survivin 转化E.coli BJ5183 菌（含腺病毒骨架质粒）并进行同源重组，然后筛选阳性克隆，提取质粒，将此重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化，用脂质体LipofectamineTM 2000介导转染293 细胞。

制备病毒上清并测定其滴度，将病毒上清转染树突状细胞，应用Western blot方法分析survivin的表达。

结果表明：成功构建了含有人survivin基因的重组腺病毒，病毒滴度为：2.65×109pfu/ml。

Western blot鉴定显示，经重组腺病毒转染的DC可有效表达survivin。

结论：含survivin基因的重组腺病毒载体的构建成功，为下一步开展抗白血病免疫研究奠定实验基础。

【关键词】腺病毒载体；存活蛋白基因；树突状细胞Construction of Recombinant Adenovirus Vector Containing Human Survivin Gene and Its Expression in Dentritic CellsAbstract The study was aimed to construct the recombinant adenovirus vectors containing human survivin gene，and to investigate their expressionin transfected dentritic cells. Full length cDNA encoding survivin was obtained by PCR amplification from plasmid pcDNA3.0-survivin. The PCR product was restricted，and then inserted into pShuttle-CMV. The plasmids of pShuttle-CMV-survivin werelinearized with PmeⅠ，and the fragment containing survivinwas ligated with pShuttle-CMV and transfected into E.coli BJ5183. After homologous recombination in bacteria，the extracted plasmid from the positive bacteria were linearized with PacⅠ，transfected into HEK293 cells with liposome LipofectamineTM 2000. Then，the harvested adenovirus supernatants were transfectedinto dendritic cells. The results showed that the recombinant adenovirus-survivin was constructed successfully and its titer was about 2.65×109 pfu/ ml. The expression of survivin in transfected dentritic cells was confirmed by Western blot analysis. It isconcluded that the recombinant adenovirus vector containing human survivin was constructed successfully，which may provide preliminary laboratory evidence for anti-leukemia immunotherapy.Key words adenovirus vector; survivin gene; dendritic cell重组腺病毒载体具有宿主细胞范围广、高转移效率、高滴度和高表达等优点，是目前基因治疗研究中应用最为广泛的载体之一［1-3］。

骨桥蛋白在体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化中的作用吴沁民;王东;孙海钰;张磊【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2009(000)036【摘要】目的:观察骨桥蛋白是否能诱导体外培养的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化,探讨其在骨折愈合过程中的作用机制,为其以后在骨折愈合方面的研究提供确切的理论依据.方法:以冲洗法获取Wistar大鼠骨髓,用贴壁法分离提纯BMSCs,传至第3代后分组,体外培养的BMSCs分为实验组和对照组.实验组添加含0.2 nmol/L骨桥蛋白的DMEM条件培养基;对照组为不含骨桥蛋白的DMEM培养基,于不同时间点收集细胞.通过光镜观察培养的细胞形态,以细胞计数法测定生长曲线,应用流式细胞仪分析细胞周期,并行碱性磷酸酶(ALP)染色和活性测定及骨钙素(OCN)含量测定.结果:实验组细胞具有成骨细胞的形态学特征;实验组细胞生长曲线右移,细胞G0/G1,期比例平均增加13.17%(P<0.01),S期比例减少74.93%(P<0.01);实验组ALP染色呈阳性,且ALP活性、OCN含量均较对照组明显提高.结论:骨桥蛋白对BMSCs有促进成骨分化的作用.【总页数】3页(P14-16)【作者】吴沁民;王东;孙海钰;张磊【作者单位】山西医科大学第二医院,山西太原,030001;山西医科大学第二医院,山西太原,030001;山西医科大学第二医院,山西太原,030001;山西医科大学第二医院,山西太原,030001【正文语种】中文【中图分类】R329.2+8【相关文献】1.依达拉奉体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的电生理研究 [J], 曾荣;胡资兵;郭伟韬;林颢;孙欣;魏劲松;吴少科2.SD大鼠骨髓基质干细胞体外诱导成骨分化实验研究 [J], 曾铁功;赵晋英;黄泽智3.体外诱导骨髓与脐血间充质干细胞向成骨细胞分化及其成骨活性的比较 [J], 邵帅;周晨红;徐丽丽4.体外诱导骨髓与脐血间充质干细胞向成骨细胞分化及其成骨活性的比较 [J], 邵帅;周晨红;徐丽丽;5.辛伐他汀作用下大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化中相关基因表达谱:基因芯片的分析 [J], 孟亚强;张柳;田发明;韩大成;郑杰;蔡俊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

骨桥蛋白体外诱导大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化中的作用的开题报告一、研究背景和意义干细胞是具有自我更新和分化能力的一类细胞，有着广泛的应用前景。

骨髓基质干细胞（BMSCs）是一类成熟的干细胞，具有向多种细胞类型分化的能力，包括成骨细胞。

BMSCs在组织工程和再生医学领域具有重要的应用价值。

骨桥蛋白（BMP）是一类生长因子，能够促进骨组织的修复和再生。

通过体外诱导，BMP可以驱动BMSCs向成骨细胞分化，促进骨组织的生长和修复。

因此，研究BMP体外诱导BMSCs向成骨细胞分化的机制，可以为骨组织工程和再生医学的应用提供理论基础和实践指导。

二、研究内容和方法本研究将利用大鼠的BMSCs，加入适当的培养基和BMP，进行体外诱导实验，研究BMP对BMSCs向成骨细胞分化中的作用。

具体内容如下：1. 建立大鼠BMSCs培养体系。

将大鼠骨骼肌骨骼通过胶原酶和胰酶消化，分离出BMSCs。

将BMSCs培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，进行培养和扩增。

2. BMP体外诱导BMSCs向成骨细胞分化。

将BMSCs转移到含有10ng/ml BMP-2的培养基中，进行体外诱导实验。

分析BMP诱导下BMSCs向成骨细胞分化的程度和机制。

3. 检测BMSCs分化成骨细胞的标志物。

通过qPCR、免疫荧光染色和转化器活性检测等方法，检测分离出的BMSCs分化后相应细胞表面标志物、胞内蛋白表达和酶活性。

三、研究预期结果本研究旨在探讨BMP体外诱导BMSCs向成骨细胞分化的机制，预期结果如下：1. 成功建立大鼠BMSCs培养体系。

2. BMP可以促进BMSCs向成骨细胞分化，且BMP-2的作用效果较好。

3. BMP-2作用下，BMSCs分化为成骨细胞的标志物表达量和酶活性均会显著增加。

四、研究意义和应用前景本研究可以为骨组织工程和再生医学的应用提供理论基础和实践指导，包括：1. 为BMP在骨组织工程和再生医学中的应用提供理论支持，指导体外反应器的优化设计和制备。

专利名称：骨形态发生蛋白重组腺病毒及其激发骨生成的方法专利类型：发明专利
发明人：楼觉人
申请号：CN00127115.6
申请日：20001102
公开号：CN1353185A
公开日：
20020612
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了用于刺激骨生成的新方法和材料。

具体地,公开了一种复制缺陷型的病毒,该病毒编码的骨形态发生蛋白家族中的蛋白,并且所述的病毒选自:腺病毒、腺伴随病毒和逆转录病毒。

还公开了用所述病毒转染的间充质细胞,含该间充质细胞的接种物,以及在体内和体外刺激骨生成的方法。

本发明可有效、方便和/或价廉地刺激骨生成。

申请人：上海兆安医学科技有限公司
地址：200021 上海市淮海中路283号香港广场南座2005室
国籍：CN
代理机构：上海专利商标事务所
代理人：徐迅
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钙网织蛋白重组腺病毒载体构建及体外表达赵丹刘新莉马萍（中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所，辽宁沈阳110001）〔摘要〕目的构建钙网织蛋白（CRT ）基因重组腺病毒载体，并检测其在293LP 细胞中的表达。

方法根据Genbank 中提供的CRT 基因序列，设计并合成引物，以人乳腺癌组织cDNA 文库为模板采用RT-PCR 技术扩增人CRT 基因片段，测序后将CRT 基因片段定向克隆至pShuttle-CMV 重组穿梭载体，进而将穿梭载体克隆至Pac Ⅰ限制性内切酶线性化的腺病毒载体pAdxsi 。

结果重组穿梭载体pShuttle-CRT 经EcoRI /Kpn Ⅰ酶切鉴定连接成功。

酶切穿梭载体将CRT 片段克隆至腺病毒载体pAdxsi 得到Ad-CRT ，鉴定证实Ad-CRT 载体构建成功。

Ad-CRT 转染293LP 细胞并通过Western 印迹法和Real-time PCR 法证实其体外表达。

结论成功构建CRT 重组腺病毒载体Ad-CRT 并证实其在293LP 细胞中表达。

〔关键词〕钙网织蛋白（CRT ）；腺病毒载体；基因治疗〔中图分类号〕R73〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）12-2561-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.053通讯作者：马萍（1960-），女，教授，博士生导师，主要从事分子肿瘤学研究。

第一作者：赵丹（1986-），女，硕士，主要从事分子肿瘤学研究。

抗原特异性肿瘤免疫治疗和抑制肿瘤血管生成治疗的方法能够区分肿瘤与非肿瘤细胞，进而达到全身系统性治疗肿瘤的目的〔1，2〕。

钙网蛋白（CRT ）是热休克蛋白家族成员，为哺乳动物体内高度保守的Ca 2+结合蛋白。

近期研究表明，由抗原转运蛋白（TAP ）转运到内质腔内的肽段与CRT 相连，成为抗原处理及递呈过程中热休克蛋白（HSP ）的交接分子，参与诱导MHC-Ⅰ类分子限制的抗原特异性的CTL ，产生细胞免疫。

大鼠微管相关蛋白4重组腺病毒载体的构建及在细胞中的表达鉴定房亚东;徐雪;党永明;郑霁;张西联;张家平;陈渝;张琼;黄跃生【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2006(28)9【摘要】目的构建大鼠微管相关蛋白4(m icrotubu le-ossoc iated prote in 4,MAP4)重组腺病毒载体,并转染新生大鼠体外培养的心肌细胞进行表达和鉴定,为真核表达及有关实验研究提供基础。

方法设计1对引物,应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,从大鼠心肌细胞总mRNA中扩增出MAP4 cDNA,并将MAP4 cDNA克隆到腺病毒穿梭质粒pShuttle2中,构建pShuttle2-MAP4表达质粒。

将此表达质粒扩增纯化酶切获得含有目的片段MAP4 cDNA的表达盒与Ad-eno-X V iru l DNA重组并线性化后转染HEK293T细胞,包装产生大鼠MAP4重组腺病毒。

并且转染新生大鼠原代心肌细胞,应用免疫组化的方法进行表达鉴定。

结果扩增所得的MAP4 cDNA片段经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序最终确定为大鼠MAP4基因,所得大鼠MAP4重组腺病毒滴度为2.3×108pfu/m l。

转染原代心肌细胞48 h后MAP4表达显著增强。

结论为研究MAP4的生物学活性及功能的基因治疗提供了基础。

【总页数】3页(P880-882)【关键词】MAP4;腺病毒;cDNA;微管相关蛋白【作者】房亚东;徐雪;党永明;郑霁;张西联;张家平;陈渝;张琼;黄跃生【作者单位】第三军医大学西南医院全军烧伤研究所创伤烧伤与复合伤国家重点实验室;成都军区总医院普通外科【正文语种】中文【中图分类】Q51;Q782【相关文献】1.大鼠弹力蛋白原基因重组腺病毒载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达 [J], 熊江;殷恒讳;朱易凡;叶财盛;王深明2.hTERT启动子调控的SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及在不同肿瘤细胞中的表达鉴定 [J], 司少艳;刘俊丽;王晓菲;谭小青;宋淑军3.核心结合因子(Cbfa1/Runx2)重组腺病毒载体的构建、鉴定及在脂肪来源干细胞中的表达 [J], 张辛;杨民;林霖;陈苹;马康涛;敖英芳;周春燕4.人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达 [J], 蒲超;倪卫东;高仕长;邱宇5.人脑源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建、鉴定及其在HEK293A细胞中的表达 [J], 丛明;李谌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

力生长因子重组腺病毒载体构建及其在成骨细胞中的表达邱敏;唐丽灵【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2010(014)037【摘要】背景:研究表明,力生长因子(mechano-growth faotor,MGF)能激活卫星细胞,促进成肌细胞增殖.在治疗肌损失、预防心肌损伤和修复神经损伤等方面有重要的作用.机械拉伸可使成骨细胞表达MGF,但是MGF对骨组织生理生化行为的影响机制尚不清楚.目的:应用携带MGF基因的重组腺病毒载体转染成骨细胞,观察MGF在成骨细胞中的表达.方法:将MGF基因插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,构建pAdTmck-MGF重组体.pAdTrack-MGF与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组,生成重组腺病毒质粒pAdEasy-MGF.脂质体介导pAdEasy-MGF转染293A细胞,包装成整的重组腺病毒Ad/MGF.用Ad/MGF感染原代培养的大鼠成骨细胞,荧光示踪计数法测定感染效率,RT-PCR法对重组腺病毒感染结果进行鉴定.结果与结论:实验构建的重组腺病毒载体Ad/MGF 滴度可达8.5×108pfu/mL.Ad/MGF能高效感染体外培养的Wistar大鼠成骨细胞并表达目的基因,当感染复数为100时,感染效率最高.说明实验构建的Ad/MGF重组腺病毒可在大鼠成骨细胞中有效表达.【总页数】5页(P6847-6851)【作者】邱敏;唐丽灵【作者单位】重庆大学生物工程学院"生物流变科学与技术"教育部重点实验室,重庆市400044;重庆大学生物工程学院"生物流变科学与技术"教育部重点实验室,重庆市400044【正文语种】中文【中图分类】R318【相关文献】1.大鼠血小板衍生生长因子C重组腺病毒载体的构建及在内皮祖细胞中的表达 [J], 李锋;罗文军;唐博;陈以宽;孙建明;付健2.血管内皮生长因子121和骨形态蛋白2双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定 [J], 钟声;刘丹平;刘素伟;李晓禹;李谌;李媛3.人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达[J], 刘铁连;谢宇锋;盛伟华;缪竞成;单云波;胡志清;井莹莹;杨吉成4.小鼠角质化细胞生长因子及其受体的重组腺病毒表达载体的构建 [J], 陈力;黎檀实5.转化生长因子-β3基因重组腺病毒载体的构建及表达 [J], 邱林;吴清华;肖军;李明勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

Vasostatin重组腺病毒的构建和体外表达的研究丁振宇;杨莉;田聆;刘芬;肖飞;魏于全【期刊名称】《四川大学学报：医学版》【年(卷),期】2004(35)4【摘要】目的构建 vasostatin重组腺病毒表达载体 ,并进行体外表达研究。

方法根据 Gen Bank中提供的钙网蛋白序列 ,设计并合成引物 ,以人骨骼肌 c DNA 文库为模板用 PCR扩增出人 vasostatin基因 ,将其克隆入 T载体。

经酶切及测序鉴定后亚克隆至穿梭载体 ,与经过限制酶处理的骨架腺病毒载体 DNA- TPC复合物共转染 2 93细胞。

用 Western blot检测体外表达。

结果 PCR扩增出约 5 90 bp产物 ,测序结果与文献报道一致。

用 PCR及Western blot证实重组腺病毒构建成功 ,能有效的表达出 vasostatin蛋白。

结论 vasostatin重组腺病毒载体能有效的在体外表达出【总页数】4页(P460-462)【关键词】vasostatin;腺病毒;基因治疗【作者】丁振宇;杨莉;田聆;刘芬;肖飞;魏于全【作者单位】四川大学华西医院人类疾病生物治疗教育部重点实验室肿瘤中心【正文语种】中文【中图分类】R739.63【相关文献】1.细菌内同源重组快速构建和制备表达hSDF-1α的重组腺病毒 [J], 唐俊明;郭凌郧;孔霞;杨建业;潘国栋;陈龙;黄永章;王家宁2.携带miR-34a重组腺病毒的构建及其体外表达研究 [J], 娄文加;陈青;李伟;王刚;钱程;刘立3.鸡survivin重组腺病毒载体的构建和体外表达 [J], 李秋;田聆;文艳君;吴扬;罗彦4.hNET基因重组腺病毒载体构建和体外表达 [J], 贾志云;欧晓红;魏海燕;邓候富;黄蕤;王金蓉;张仕琼5.细菌内同源重组快速构建和制备表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒 [J], 王家宁;黄永章;孔霞;郭凌郧因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

骨形成蛋白7重组腺病毒的构建及诱导成骨的研究孙大铭;侯树勋;付小兵【期刊名称】《中国骨与关节杂志》【年(卷),期】2008(007)005【摘要】目的探讨骨形成蛋白7(BMP7)重组腺病毒异位诱导成骨的作用.方法将BMP7基因克隆到转移载体pAdTrack-CMV中,在细菌BJ5183中与pAdEasy腺病毒基因组进行同源重组,得到BMP7重组腺病毒基因组,通过转染HEK293细胞包装出重组腺病毒,然后在裸鼠小腿肌肉中进行异位诱导成骨实验.结果经过PCR 及酶切鉴定证明获得了BMP7转移质粒pAdTrack-BMP7和BMP7重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒.组织学观察显示2周时实验局部大量纤维样细胞聚集,软骨细胞分化,5周时骨小梁形成,软骨细胞已退化.结论 BMP7重组腺病毒的构建以及其异位诱导成骨的成功,为BMP7基因治疗的研究提供了确切的实验依据.【总页数】4页(P268-271)【作者】孙大铭;侯树勋;付小兵【作者单位】100037,北京,解放军总医院第一附属医院骨科;100037,北京,解放军总医院第一附属医院骨科;100037,北京,解放军总医院第一附属医院骨科【正文语种】中文【中图分类】R6【相关文献】1.骨形成蛋白2重组腺病毒的构建及异位诱导成骨的研究 [J], 孙大铭;侯树勋;付小兵2.重组人骨形成蛋白-2、胶原、珊瑚复合人工骨异位诱导成骨的实验研究 [J], 尉文华;毛天球;陈富林;王贺忠;张忠友3.骨诱导和骨形成机制的研究:β转化生长因子增强人重组骨形态发生蛋白-2在体内的诱导成骨作用 [J], 杜俊杰;罗卓荆;胡蕴玉;李志创;吕荣4.重组人骨形成蛋白-2胶原珊瑚复合人工骨异位诱导成骨的实验研究 [J], 尉文华;毛天球;陈富林;王贺忠;张忠友;;5.重组人骨形成蛋白-2/珊瑚复合人工骨的研制及其诱导成骨的实验研究 [J], 张森林;毛天球;王会信;赵明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

sCD40LIg重组腺病毒载体的构建鉴定和体外表达李钊伦;田普训;薛武军;吴军;贺伟峰;易绍萱;陈希炜;张小容【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2005(27)21【摘要】目的构建含有分泌型人胞外区CD40L融合蛋白(sCD40LIg)基因的重组腺病毒载体,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础。

方法分别以质粒pAdCTLA4Ig和pGEM-T-easy-sCD40L为模板,通过PCR扩增获得人源IgGFc和sCD40L基因全部序列。

分别回收用连接酶连接,以连接产物为模板PCR,获得sCD40LIg基因全部序列,插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV的启动子下游BglⅡ及XhoⅠ位点之间,获得重组质粒pAdTrack-sCD40LIg。

将正确重组体pAdTrack-sCD40LIg转化含腺病毒骨架质粒的pAdEasy-1-BJ5183细菌行同源重组。

提取重组成功质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因,Western blot分析蛋白表达等方法鉴定重组的腺病毒。

结果成功构建了含有sCD40LIg基因的重组腺病毒并在体外表达。

结论该重组腺病毒的构建为下一步研究其在哺乳动物细胞内表达及在移植排斥的基因治疗中的作用提供了一定的基础。

【总页数】4页(P2107-2110)【关键词】sCD40L融合蛋白;重组腺病毒;基因表达;免疫耐受【作者】李钊伦;田普训;薛武军;吴军;贺伟峰;易绍萱;陈希炜;张小容【作者单位】西安交通大学医学院第一附属医院肾移植科;第三军医大学西南医院全军烧伤研究所,重庆器官移植基础研究室【正文语种】中文【中图分类】Q782;R392.11【相关文献】1.hTERT启动子调控的SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及在不同肿瘤细胞中的表达鉴定 [J], 司少艳;刘俊丽;王晓菲;谭小青;宋淑军2.重组腺病毒载体AdOX40Ig的构建、表达及相关体外实验 [J], 陈志红;赵媛媛;张守亮;林建扬;魏法星;朱伟3.体外重组酶法快速构建表达增强型绿色荧光蛋白的复制型人14型腺病毒载体[J], 陈咏; 田新贵; 周荣4.P1/Fas-CCL19双表达重组腺病毒载体的构建及表达鉴定 [J], 姜兆静;李纪强;张积仁5.肝癌靶向性SEA基因重组腺病毒载体的构建及体外生物学活性鉴定 [J], 司少艳;隋延仿;张秀敏;李侠;冯凯;韩瑞刚因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

骨形成蛋白2重组腺病毒的构建对骨缺损基因治疗的价值王德利;阮狄克;李海峰;马巍;刘碧波;杨敏杰【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2005(009)038【摘要】背景:目前,人们利用基因重组技术已经表达出人类基因重组骨形态发生蛋白2,并且在常位和异位成功地诱导出新骨.但由于重组人骨形态发生蛋白2比天然骨形态发生蛋白2的诱导成骨活性较低,且尚未找到十分理想的载体.目的:通过构建骨形成蛋白重组腺病毒,为骨缺损的基因治疗提供可行载体.设计:单一样本实验.单位:西安交通大学第一医院分子生物学实验中心.材料:PACCMV-PLPA质粒,PJM17质粒,293细胞系.方法:实验于2001-09/02-06在西安交通大学第一医院分子生物学实验中心完成.应用反转录-聚合酶链反应法克隆出骨形态发生蛋白质类2全长基因,构建重组腺病毒载体,DNA-磷酸钙共沉法将辅助质粒PJM17转染293细胞,同源重组构建出重组腺病毒.测滴度并用氯化铯梯度离心纯化备用.主要观察指标:①聚合酶链反应产物克隆结果.②PACCMV-BMP2穿梭质粒的鉴定结果.③重组腺病毒的构建结果.结果:①聚合酶链反应产物克隆结果:克隆构建的重组质粒命名为pGEM-T/hBMP2,大小为(3015+1213)bp.琼脂凝胶电泳结果显示实际值与理论值完全一致.②PACCMV-BMP2穿梭质粒的鉴定结果:质粒大小约为10 Kbp,因PACCMV-PLPA质粒多克隆位点属PUC质粒系列,故用EcoRⅠ酶切,可将重组质粒线性化,大小为10 Kbp.而EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切时,可得到8.8 Kbp和1.2 Kbp两个可见片段.③重组腺病毒的构建结果:重组病毒的鉴定应用聚合酶链反应技术,利用BMP2全长特异引物扩增出目的片段1.2 Kbp,与理论值完全一致.结论:骨形态发生蛋白2重组腺病毒的构建成功为骨缺损等疾病的基因治疗奠定了可行的载体基础.%BACKGROUND: At present, genetic recombinant technique has been utilized to express recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2)and to induce either orthotopic or ectopic regenerated bone successfully. But,because that osteoblastic activity induced by rhBMP-2 is lower than that by natural BMP-2, the perfect vectors have not been discovered yet.OBJECTIVE: BMP recombinant adenovirus (rAdV) was constructed so as to provide feasible vector for the basic treatment of bone defect.DESIGN: Single sample was designed in theexperiment.SETTING: Experimental Center of Molecular Biology in First Hospital of Xi'an Jiaotong University.MATERIALS: PACCMV-PLPA plasmid, PJM17 plasmid, 293-cell line.METHODS: The experiment was performed in Experimental Center of Molecular Biology in First Hospital of Xi'an Jiaotong University from September 2001 to June 2002. Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) was used to clone the whole-length gene of BMP-2 and construct AdV vector. DNA-calcium phosphate coprecipitation was used to transfect accessory plasmid PJM17 into 293cell and homologous recombination was used to construct rAdV. The titer was assayed and CsC1 density gradient centrifugation and purification were applied.construction of rAdV.binant plasmid is named as pGEM-T/hBMP2, (3 015+1 213)bp in size.It was indicated in agar gel electrophoresis that the practical value was in BMP2 shuttle plasmid: The plasmid was about 10 Kbp in size. Since PACCMV-PLPA plasmid multiclone sites belonged to PUC plasmid series,EcoR Ⅰ enzyme digestion was used to linerarizate recombinant plasmid,10 Kbp in size. 8.8 Kb and 1.2 Kbpvisible fragments were obtained durtion of rAdV: PCR technique was used to identify rAdV. The target fragment 1.2Kbp that was amplified by BMP2 specific primer of the whole length was in conformity completely with the theoretic value.CONCLUSION: Successful construction of BMP2 rAdV lays a foundation for the feasible genetic treatment with vector of bone defect.【总页数】2页(P172-173)【作者】王德利;阮狄克;李海峰;马巍;刘碧波;杨敏杰【作者单位】解放军海军总医院骨科,北京市,100037;解放军海军总医院骨科,北京市,100037;解放军海军总医院骨科,北京市,100037;西安交通大学第一医院骨科,陕西省西安市,710061;西安交通大学第一医院骨科,陕西省西安市,710061;西安交通大学第一医院骨科,陕西省西安市,710061【正文语种】中文【中图分类】R68【相关文献】1.骨形成蛋白2重组腺病毒的构建及异位诱导成骨的研究 [J], 孙大铭;侯树勋;付小兵2.骨形成蛋白7重组腺病毒的构建及诱导成骨的研究 [J], 孙大铭;侯树勋;付小兵3.人骨形成蛋白-2基因的克隆及其重组腺病毒载体的构建 [J], 张莉;马宁;高文信;张明4.大鼠骨形成蛋白4基因重组腺病毒的构建 [J], 万小平;李小荣;谭辉;何峰;裴海平;申竑;李小刚5.人骨形成蛋白7基因重组35型腺病毒载体的构建与鉴定 [J], 康焱;廖威明;袁振华;张珑涓;原向伟;雷磊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。