细菌的人工培养方法及意义(平板划线)

实验六平板划线法分离菌种一、实验目的1、了解平板划线法分离菌种的基本原理2、练习平板划线法分离菌种的基本操作，掌握无菌操作技术二、实验原理平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。

一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。

通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。

实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。

平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化。

具体的划线形式有多种，这里仅介绍一种经过长期实践并证明可获得良好实验效果的方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。

由此可知，这4个区的面积安排应做到D>C>B>A。

鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。

这样的培养基称之为鉴别培养基。

例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。

（参考GB4789.38-2012食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数）其配方中含有乳糖、伊红和美蓝，用以鉴别肠道病原菌及其他杂菌。

伊红、美蓝作为指示剂，伊红系酸性染料，当大肠埃希氏菌或产气肠杆菌分解乳糖产酸时，由于细菌带正电荷，所以被伊红着色。

在大肠埃希氏菌中因为伊红与美蓝结合，所以菌落不呈红色，而是蓝紫黑色，且具有绿色金属光泽；菌落呈棕色者为产气肠杆菌；不分解乳糖的肠道病原菌则不着色，有时因产生碱性物质较多，细菌带负电荷，被美蓝着色后，菌落并不呈蓝色，因美蓝与伊红结合，所以菌落为淡紫色。

细菌的人工培养方法[适用对象]生物工程专业[实验学时] 4学时一、实验目的了解常用的液体、固体和半固体培养基的成分、制备方法和用途。

初步掌握各种培养基接种技术；观察细菌在培养基中的生长现象；认识菌落、菌苔。

二、实验原理培养基是用人工方法将微生物生长繁殖所需的多种营养物质调配在一起，形成的一种营养物质的混合物，用以分离、传代和培养细菌。

按培养基的用途分为基础（普通）培养基、营养培养基、鉴别培养基，选择培养基、厌氧培养基等。

按培养基的物理形状又分为液体、固体和半固体三种。

三、仪器设备三角烧瓶、天平、试管、平皿、高压消毒灭菌器。

四、相关知识点培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。

在自然界，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究目的不同，所以培养基的种类很多。

但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、无机盐、生长因子等。

不同的微生物在固体、半固体和液体培养基中能表现出各自特有的培养特征，这些特征可以作为不同种类微生物的鉴别特征之一。

了解它们的培养特征、掌握其生长规律对识别、控制和利用微生物具有重要价值。

五、实验步骤（一）常用培养基的制备1、普通液体培养基(1)将新鲜的精牛肉除去脂肪和筋膜制成肉馅，取500克牛肉馅加l000ml蒸馏水，置4℃冰箱浸泡过夜，使牛肉中的水溶性营养物质充分浸出。

(2)次日将浸泡过夜的牛肉馅加热煮沸30分钟，放凉，使残余的脂肪凝固，然后用纱布和滤纸过滤，最后将滤液补足为原量，此种液体为牛肉浸汁。

(3)取1 000ml牛肉浸汁加蛋白胨10克，氯化钠5克加热溶解，冷至50℃左右时用氢氧化钠调整pH至7．6，再煮沸10分钟(因牛肉浸汁中部分碳水化合物，经加热破坏产酸，影响pH；产生多磷酸盐，培养基不澄清)待冷却后，再调整pH至7．6，然后以滤纸过滤，滤液必须澄清，此种液体称为肉汤培养基。

(4)将肉汤培养基分装于试管或三角烧瓶中，塞好试管和瓶塞，包装好后，用15磅(121℃)蒸气15～30分钟灭菌。

细菌的接种与培养方法操作规程一、细菌的接种根据待检标本的来源、培养目的及所用培养基的性状，采用不同的接种方法。

l、平板画线分离法（1）、连续画线分离法此法主要用于杂菌不多的标本。

用接种环取标本少许，于平板l/5处密集涂布，然后回来作曲线连续划线接种，线与线间有一定距离，划满平板为止。

（2）、分区画线分离法此法适用于杂菌较多的标本。

先将标本均匀涂布于平板边缘一小区(约占平板1/5)，再在二、三区依次连续画线，每画线一区均将接种针灭菌一次。

每一区的划线均接触上一区的接种线1～2次。

以获得单个菌落。

2、斜面接种法该法主要用于单个菌落的纯培养。

用灭菌接种针取菌少许，从培养基斜面底部向上划一直线，然后从底部向上作连续曲线画线。

一直画到斜面顶端。

3、液体接种法多用于一些液体生化试验管的接种。

用灭菌接种环取菌少许，在试管内壁与液面交接处的管壁上轻轻研磨，使细菌混合于液体中。

4、穿刺接种法主要用于半固体培养基、明胶及双糖铁的接种。

用接种针取菌少许，从半固体培养基中央，平行于管壁垂直刺入，接近管底但不可接触管底，然后接种针原路退出。

5、倾注平板法临床上主要用于尿液等标本的细菌计数。

将标本经适当稀释后，取一定量加入已灭菌的平皿内，倾入已经溶化并冷却至45℃左右的定量培养基，混匀，待凝固后倒置、培养。

6、涂布接种法常用于纸片药物敏感性测定，也可用于被检标本的细菌计数。

加定量的被检菌液于琼脂平板表面，然后用灭菌的棉签反复涂布几次，使被检菌均匀分布在琼脂平板表面。

然后贴上药敏纸片培养，或直接培养观察结果。

二、细菌培养方法根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同的环境进行培养。

常用的有需氧培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法。

1、需氧培养法本法是临床细菌室常用的培养方法，即将已经接种好的平板、斜面和液体培养基等。

置于35℃温箱中孵育18～24小时。

2、二氧化碳培养法本室用CO2孵箱将已接种好的培养基置于CO2孵箱内培养。

菌种划线平板标准操作规程菌种划线平板是一种常用的微生物学实验方法，主要用于菌种的分离和纯化。

为了保证实验的准确性和结果的可靠性，需要按照一定的操作规程进行操作。

如果存在多个菌种，则需准备相应数量的平板。

2. 准备培养基：根据菌种的生长特性选择合适的培养基，并按照菌种需求配制。

常用的培养基包括营养琼脂、肉汤葡萄糖琼脂平板等。

3. 准备培养器具：清洁培养皿、培养管、移液器、吸球等，并对其进行高温高压灭菌处理，确保无菌。

4. 暴露培养器具：开盖的培养皿、培养管等暴露在空气中易被细菌污染，使用前需进行烧烤消毒。

5. 准备菌种：选择需要划线的菌种，将其提取到无菌环境下，用吸液器或移液器进行分装，分装至不同的培养皿中。

二、实验操作步骤1. 消毒操作台：将操作台表面擦拭，用75%酒精喷洒，待酒精挥发后进行紫外线照射消毒，照射时间约15-30分钟。

2. 划线操作：将已经配制好的培养基倒入无菌平板中，使其均匀分布，待其固化后（约15-30分钟），开始划线。

(1) 布置待划线的培养平板：将待划线的培养平板放在炉盘或搁板上，不要弄湿培养平板。

(2) 取菌种：取一支已分装好的菌种，用吸球或移液器吸取适量的菌液，然后轻轻地均匀涂抹于培养平板上。

(3) 用划线针划线：用消毒的划线针，在培养平板上进行划线操作。

先将划线针消毒，再从菌液中取菌，然后从培养皿的一个角划至另一个角，最后将划线针消毒。

(4) 过程控制：整个划线操作应迅速、准确，并且尽量避免划重叠线。

3. 清理操作台：划线操作完成后，用75%酒精擦拭操作台表面，然后喷洒消毒液，待其挥发后，注意再次使用紫外线照射消毒。

三、实验后的处理工作1. 培养平板的封存：将培养平板进行密封，避免外界细菌的污染。

可使用透明胶带或锡纸进行包裹。

2. 培养平板的保存条件：将密封好的培养平板放入恒温培养箱中，设定适当的温度（如37℃），使其进行培养。

3. 培养结果的观察和分析：经过一定时间的培养后，观察培养平板上的菌落情况，分析并鉴定相应的菌种。