【精品课件】发酵工程第十三章发酵产物分离原理与技术

当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白等分子表面上荷电基团 或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低， 因而静电吸引力增大，带电溶质互相吸引而聚集。
对于具有表面水层的生物分子，有机溶剂与水的作用，使 这些分子表面水层厚度不断压缩，最后使这些分子脱水而 相互聚集析出。
不同浓度的有机溶剂可使不同的溶质沉淀，即分步沉淀法， 达到分离纯化的目的。
不少蛋白质与金属结合后会发生等电点偏移，如胰岛 素的等电点为5.3，在与Zn2+结合形成胰岛素锌盐，其 等电点升为6.2；故加入金属离子后选择等电点沉淀时， 要注意调整pH。
等电点沉淀法的实例
从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可 先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性 蛋白质(pI=3.0)。工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH 至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同 时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。
蛋白质分子表面
2、有机溶剂沉淀法的影响因素
1）有机溶剂的种类 2的）用羧低M温于基浓n度生、2度+物氨、样物基F品e质和需2沉+含要、淀有使C的氮o用有杂2有+机、环机溶C的溶u剂化剂2须+合的、能物量Z与结n较水合2大+互；，等溶但离，共子但沉能对作与蛋用蛋白小白无，质作 用仿3有 但 ；、）例多的更利共高CA乙p如数降好ag于沉浓H醚：生低地2+提作+度、等、乙物而保高用样H；B醇物降护分大品ga、质低生离，使22++甲在的物的分、、用醇有，物效离PM有、机因质b果效g机丙2溶此的；果2+溶+酮剂降活能但较、剂、与低性与低差P的二b水温巯浓。量2甲的度基度+较能基混可结样小与甲合增合品，羧酰液加形损减基胺中收成失少结、的率复较了合二溶；合大变；甲解低物，性基度温；回的亚是沉收危砜随淀率险、温还低；氯度能； 4）乙某蛋样醇些白品在是有质浓结核机分度构酸化子和稳、合质分定糖物量子范类能越质围、与大量内氨生，，基物产选酸大生择和分沉溶核子淀解苷形所度酸成需最等难加低物溶入时质复的的最合有p常物机H用.，溶的有剂沉助量淀于越剂； 的5少 这 响温）在。类蛋度提剂金沉复白显高的属淀合质著沉量离过物的升淀最子程在生高效小和中水物，果；离，或活这；子乙有性对在强醇机，热接度与溶同稳近水剂时定等混中还性电合的能较点时溶降差处放解低的，出度有产引大都机物起量大溶影沉的大剂响淀稀降的较所释低用大需热，量（有，而。少机使不量溶溶影多液次、 搅拌） 合适的pH还可大大提高分离的分辨能力
Байду номын сангаас
几种蛋白质析出时所需硫酸铵的离 子的强度
不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解 度与离子强度的关系
不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃） (○)NaCl; (▼)KCl;(◘)MgSO4;(▲)（NH4)2SO4;(●)Na2SO4;(□)K2SO4;(■)柠檬酸三钠
温度和pH值的影响
温度对碳氧血红蛋白盐析曲线的影响
pH值对β的影响
三、有机溶剂沉淀法
1. 有机溶剂沉淀法的原理 2. 有机溶剂沉淀法的影响因素 3. 有机溶剂沉淀法的优缺点 4. 有机溶剂沉淀法的注意事项 5. 有机溶剂沉淀法举例
1、有机溶剂沉淀法的原理
许多有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子 生物物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子发生沉淀 作用。这种沉淀作用是多种效应的结果，但主要作用是降 低水溶液的介电常数。
第十三章 发酵产物分离原理与技术
发酵产物分离原理与技术
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
沉淀分离法 吸附和树脂分离法 离子交换法和离子交换膜电渗析分离法 萃取与浸取分离法 膜分离技术
第一节 沉淀分离法
沉淀是物理环境的变化引起溶质的溶解度降低，生成固 体凝聚物的现象。
沉淀法方法简单、成本低、使用广泛，一般作为初步分 离的手段。
沉淀法的分类： 一． 等电点沉淀法 二． 盐析法 三． 有机溶剂沉淀法 四． 非离子型聚合物沉淀法 五． 聚电解质沉淀法 六． 生成盐复合物沉淀法 七． 热变性及酸碱变性沉淀法
一、等电点沉淀法
原理：利用两性电解质在电中性时溶解度最低； 优点：许多蛋白的等电点都在偏酸范围内，而许 多无机酸的价格低廉，并能为食品标准允许； 缺点：酸化时易引起蛋白失活。
碱性磷酸酯酶的pI沉淀提取：发酵液调pH4.0后出现含碱 性磷酸酯酶的沉淀物，离心收集沉淀物。用pH9.0的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液重新溶解，加入20～40%饱和度 的硫酸铵分级，离心收集的沉淀Tris-HCl缓冲液再次沉淀， 即得较纯的碱性磷酸酯酶。
等电点沉淀法
等电点沉淀法的适用范围： ① 明确pI的两性物质； ② 疏水性较大的蛋白质。
盐析原理示意图
盐析原理
蛋白质的溶解度与盐浓度间的关系可用Cohn方程 式表示：
logS/S0 = －Ks·I logS=β-KsI S — 离子强度为I时的蛋白溶解度 (g/L); S0 — 纯溶剂（即I = 0）时蛋白的溶解度； Ks — 盐析常数，与温度和pH无关； I — 离子强度 当温度一定时，S0对于某一溶质是一常数，即 logS0 = 是溶质的特征常数，对于蛋白质而言，其大小主 要取决于不同蛋白质的性质，它也与溶液的温度和 pH值有关，但与盐的种类无关。
盐3）溶温(sa度lting in)： 许多蛋白在低盐浓度下发生盐溶现象（比 在纯水中的溶解度大大增加）； 高4）温盐p度浓H是度影则响盐溶析质，溶离解子度强的度重越要大因，素蛋，白升质高的温溶度解可度以越增低加；许 多盐无析机剂盐种值和类除小很与分多蛋子，白有不质机同和化种温合类度物的有的盐关溶对外解蛋，度白还；溶与解pH度有的关影；响是不同的； 离大度子而的但半电升在径荷高盐高小低反析盐且的而p浓电离H减度荷子的小中高影选，的响择蛋离较要白子弱以质对；不等盐不降生析同低物作种产大用类物分的的的子影盐活物响对性质较溶为的强解原溶，度则解离的；度子影随半响温径，较主 要温是这度对主p升KH要s高由作值是有于为的因利蛋盐影为于白析响蛋蛋质p，白白H在K质质等s分值失电子越水点在大沉时水，淀最化该。易时盐沉要的淀吸盐，热析故，效可失果选水越择时好等则。电放点热的；
二、盐析法
蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，发生 沉淀的现象称为盐析。
1. 盐析法的原理 2. 盐析法的影响因素
1、盐析法的原理
原理： ①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶
解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度， 破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下 降； ②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降； ③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水 分子的极化，使水活度降低。
图1 碳氧血红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图
盐析法原理
盐析法分离蛋白质时，可分两类： 1）在一定的pH值和温度下，改变离子强度或盐浓
度的沉淀方法——“K”分级盐析法 2）在一定离子强度下，改变溶液的pH值及温度的
沉淀方法——“”分级盐析法
2、盐析的主要影响因素
1）高蛋浓白度质的浓蛋度白溶液，可减少盐的用量；但共沉现象严重 用低浓度蛋白溶液进行盐析，需用较多的盐，共沉作用 较2）轻离子强度和种类