氨基酸的薄层层析实验_课件

氨基酸的薄层层析一、实验目的1．掌握薄层层析法的一般原理。

2．掌握氨基酸薄层层析法的基本操作技术。

3.掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）。

二、实验原理1．薄层层析法是色谱分析技术的一种一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。

当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。

（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）硅胶吸附薄层层析吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶硅胶：表达式为SiO2-XH2O。

层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（一Si —OH）,这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。

硅胶吸附薄层层析的特点：①硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。

②硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。

③硅胶的活化温度通常为105℃ —110℃,不能过高。

但是实际操作时为70℃,活化1h 2．氨基酸与茚三酮的显色反应茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。

3.记录结果，计算Rf值混合氨基酸被分离后，在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率一Rf值（rate of flow）来表示。

层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。

由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据 Rf值来鉴定被分离的物质。

三、材料与方法：材料：（一）分析样品：氨基酸混合液（二）试剂：吸附剂：硅胶粘合剂： 0.5%的羧甲基纤维素钠、氨基酸的异丙醇溶液、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸。

氨基酸的薄层层析[原理]氨基酸薄层层析属于吸附层析，主要根据各种氨基酸在吸附剂表面的吸附能力不同进行分离或提纯的一种方法。

将硅胶（吸附剂—作为固定相的支持剂）均匀地铺在玻璃片上，并将氨基酸样品点于吸附剂上。

在密闭容器中，由于吸附剂的毛细管作用使展开剂上行将样品展开。

被分离的氨基酸因结构不同，在吸附剂上的吸附亲和力也不同。

吸附力大的就容易被吸附剂吸附，而较难被溶剂所冲洗（即解吸）；吸附力小的就容易被溶剂携带至较远的距离。

氨基酸在吸附剂和展开剂之间反复多次的进行吸附和解吸附，从而使不同的氨基酸达到分离的目的。

[试剂]（一）硅胶G（二）0.2%羧甲基纤维素钠称取羧甲基纤维素钠1g溶于蒸馏水100 ml中，在沸水浴中煮沸至无气泡，冷却，置冰箱储存，临用前稀释至0.2%。

（二）氨基酸溶液制备下列各氨基酸的异丙醇（90%）溶液各10ml。

1．0.01mol/L精氨酸精氨酸15.9mg溶于90%异丙醇10ml中。

2．0.01mol/L甘氨酸甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇10ml中。

3．0.01mol/L酪氨酸酪氨酸18.1mg溶于90%异丙醇10ml中。

将上述溶液各取出1ml，混合均匀作为氨基酸混合溶液。

（三）展开剂按4：1：1体积比例混合正丁醇，冰乙酸及水。

临用时配置。

（四）0.5%茚三酮丙酮溶液茚三酮0.5g溶于无水丙酮100ml中。

[主要器材]（一）玻璃板（4×10cm）（二）层析缸。

（三）喷雾器。

（四）长颈漏斗。

（五）玻璃毛细管。

（六）恒温干燥箱。

[操作步骤]（一）薄板的制备1．称取硅胶G 0.5g放入研钵中，加1.5ml0.2%羧甲基纤维素钠，研磨成均匀的稀糊状。

2．将上述糊状物倾倒在4×10cm的玻璃片（图11）上，使之均匀地布满于玻片，将玻片轻轻地晃动，使硅胶G均匀分布，表面平坦，光滑，无水层及气泡，然后水平放置在空气中使其自然干燥。

1．薄板上硅胶干后，放入105℃的恒温干燥箱内活化，半小时后取出，晾凉备用。

氨基酸的薄层层析实验2 氨基酸的薄层层析一、目的熟悉层析技术的一般原理，分类及应用范围。

重点掌握薄层层析法的原理及操作技术，用以分离混合氨基酸中各游离氨基酸组分。

了解层析技术来分离不同物质的基本原理，以及层析技术的优点。

二、原理层析法又称色谱法、色层法或层离法，是广泛应用的一种生物化学技术。

根据流动相不同分为液相层析和气相层析。

按照层析过程的机理不同，层析法分为以下几种类型：1、吸附层析：利用吸附剂表面对不同物质吸附性能的差异进行分离。

例如活性炭，硅胶等。

2、分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。

3、离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。

对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。

4、凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。

例如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。

5、亲和层析：利用某些蛋白质能与配体分子特异而非共价地结合进行分离。

例如酶和抑制剂，抗原和抗体，激素和受体等按操作形式不同，层析法分为以下几种类型：1、柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。

2、纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。

3、薄层层析：薄层层析是一种微量而快速的层离方法，与纸层析方法类似。

这种层析方法是把吸附剂如氧化铝或硅胶涂布于薄板上（玻璃或金属等）形成薄层，把要分析的样品溶液滴加到薄层的一端，然后在此薄层上用适当的溶剂进行展开即为薄层层析。

本实验中用到薄层层析是一种微量而快速的层离方法。

这种层析方法是把吸附剂如氧化铝或硅藻土涂布于薄板上（玻璃或金属等）形成薄层，把要分析的样品溶液滴加到薄层的一端，然后在此薄层上用适当的溶剂进行展开即为薄层层析。

本实验中硅胶作为一种固相支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。

层析时吸着在硅胶上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。

当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。