氨基酸的薄层层析剖析

氨基酸薄层层析实验报告篇一：生物化学实验-氨基酸分析实验报告【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】一、预习报告? 实验原理：根据固定相基质的形式，层析可分为纸层析、薄层层析和柱层析。

薄层层析是在玻璃或塑料等光滑表面铺一层很薄的基质进行层析。

薄层层析（thin layer chromatography，TLC）：是将吸附剂均匀地在玻璃板上铺成薄层（固定相），再把样品点在薄层板一端，再把板的这端浸入适当的溶剂（流动相）在薄层板上扩展。

并在此过程中通过吸附——解吸附——再吸附——再解吸附的反复进行，而将样品各组份分离出来。

本次实验：? 具体原理：当流动相在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。

? 吸附剂（固定相）：硅胶（C.P.）。

为使制成的薄层板不易松散，加入5%羟甲基纤维素钠（CMCNa）作黏合剂。

? 展开剂：正丁醇、冰醋酸和蒸馏水的混合液（80:10:10,V/V/V）。

? 展层-显色剂：按照10:1比例（V/V）混匀的展开剂和0.1%茚三酮溶液。

? 活化（activation）：在一定温度下，对吸附剂硅胶加热去除水分。

可使硅胶的活性提高，吸附能力加强。

? 氨基酸与茚三酮的显色反应：茚三酮水化后生成的水合茚三酮在加热时被还原，此产物与氨基酸加热分解产生的氨结合，以及另一分子水合茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。

? Rf值：Rf?斑点中心到样品原点的距离对应溶剂前沿到样品原点的距离由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。

?实验材料：? 样品：1、0.01mol/L丙氨酸;2、 0.01mol/L精氨酸;3、0.01mol/L甘氨酸;4、混合氨基酸溶液。

氨基酸的薄层层析（TLC）【实验原理】聚酰胺薄膜层析是60年代以后发展起来的一种新的层析方法，特别适用于氨基酸及其衍生物的分析。

具有灵敏度高、分辨率强、操作方便快捷等特点。

聚酰胺是一类化学纤维素原料，即锦纶（尼龙）。

由乙二酸和乙二胺聚合而成的，称锦纶66。

由于分子中含有大量的酰胺基团，故称聚酰胺。

聚酰胺薄膜是在涤纶片基上涂上一层锦纶制成的。

聚酰胺对许多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的-C=O和 -NH- 能与被分离物质的一定基团形成H键。

如酚类（黄酮类、鞣质）和酸类（氨基酸、核苷酸）能以其羟基与酰胺键的羰基形成H键。

在层析过程中，当样品随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于聚酰胺与各极性分子产生H键吸附能力的强弱不同，从而可将样品中各成分分离。

物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在滤纸上的移动速率，用Rf来表示。

在一定条件下，每个物质都有特定的Rf值，因此，用Rf可鉴定不同的物质。

无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外照射）或显色法鉴定。

氨基酸层析图谱常用茚三酮作显色剂。

本实验利用单向上行层析法鉴定氨基酸。

【实验试剂和器材】(一) 试剂1. 氨基酸标准液(10mg/ml)：三种氨基酸是赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸，分别配成上述浓度的溶液。

2. 氨基酸混合液（每种氨基酸5mg/ml）3. 展层剂：正丁醇：12％氨水：95％乙醇＝13: 3: 3（V/ V）4. 0.1%茚三酮－正丁醇液。

(二) 器材聚酰胺薄膜，毛细管，层析装置，电吹风机，喷雾器，塑料手套等。

【实验方法】(一) 薄膜的剪裁取薄膜（7cm×10cm）一张，在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一直线，在此直线上每隔1厘米作一记号为点样处（外侧两点距边缘2c m）。

(二) 点样氨基酸的点样量以5ul为宜。

点样时，用毛细管吸取氨基酸样品，与薄膜垂直方向轻轻碰点样处，每点在纸上扩散的直径最大不超过2mm。

点样过程中，必须在第一点样品干后再点第二滴。

氨基酸纸层析法氨基酸纸层析法（paper chromatography of amino acids）是一种常用的分离和鉴定氨基酸的方法。

本文将详细介绍氨基酸纸层析法的原理、步骤、实验条件和数据处理方法等内容，以帮助读者更好地了解并应用这一实验技术。

一、氨基酸纸层析法的原理氨基酸纸层析法是利用氨基酸在纸上的分布系数和溶剂的渗透速度差异进行分离的方法。

其原理是在一根滤纸条上画上水平的线，将待测的氨基酸溶液直接点于纸条上，待溶液中的氨基酸离子在滤纸上沿渗透液前进，不同氨基酸在滤纸上的迁移速度不同，从而实现氨基酸的分离和测定。

二、氨基酸纸层析法的步骤1. 实验前准备（1）准备氨基酸样品，将其溶解在适当的溶剂中，并使用pH 计调节至适当的酸碱度。

（2）准备滤纸条，按照实验需要确定滤纸的宽度和长度。

（3）准备层析槽，将槽中的溶剂预先与上盖采光纸取代，避免有光照射到。

2. 进行层析实验（1）在滤纸条上绘制水平基线，并将标记的点分开，便于后续氨基酸的测定。

（2）将氨基酸溶液直接点于滤纸条上，点的位置要尽量靠近基线，以避免扩散的影响。

（3）将纸条的一端浸入含有适当溶剂的层析槽中，保持溶剂的面平稳。

（4）待溶液中的氨基酸在滤纸上渗透，不同氨基酸迁移的距离不同，最终在纸条上形成清晰的色斑。

（5）将纸条取出，用热风干燥，然后在紫外灯下进行观察和记录。

3. 数据处理将滤纸上的色斑分别用铅笔勾画出来，并测量它们与基线之间的距离。

然后，根据距离之间的比例关系来计算氨基酸在纸上的迁移速度，并与标准曲线进行比较，从而得出待测氨基酸的浓度。

三、氨基酸纸层析法的实验条件1. 溶剂体系常用的溶剂体系有正丙醇/ 乙酸/水 = 4:1:5、正丙醇/氨水/水 = 70:2:25等，需要根据实验需要确定溶剂的组成和比例。

2. 滤纸条的准备常用的滤纸有菱形滤纸和圆形滤纸，需要根据所需分离的氨基酸种类和数量决定滤纸的大小。

3. 实验条件实验应在干燥、通风的环境中进行，避免光照和温度过高。

生物化学实验报告姓名:学号:专业年级:组别: 第四实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称氨基酸得薄层层析实验日期2015-11-09 实验地点第四实验室合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目得1.掌握薄层层析法得一般原理。

2.掌握氨基酸薄层层析法得基本操作技术,包括制板、点样、层析、显色。

3.掌握如何根据样品得移动速率(Rf值)来鉴定被分离得物质(本实验中即氨基酸混合液)。

二、实验原理1.薄层层析法:本实验将硅胶作为固相支持物,羧甲基纤维素钠作为黏合剂,两者得混合物作为固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。

当液相展开溶剂在固定相上流动时,由于吸附剂对不同氨基酸得吸附力不一样、不同氨基酸在展开溶剂中得溶解度不一样,点在薄板上得混合氨基酸样品随着展开剂得移动速率也不同,通过吸附-解吸-再吸附-再解吸得反复进行,混合液中得氨基酸可以彼此分开。

2.硅胶吸附薄层层析得特点:层析用硅胶就是一种多孔性物质,它得硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基(－Si－OH),这种极性得硅醇基能与许多化合物形成氢键而产生吸附。

硅胶得吸附能力比氧化铝稍弱,其吸附活性也与含水量呈负性相关,故涂布操作前必须保证平板足够干燥。

硅醇基显较弱得酸性,因而,硅胶只能用于中性、或酸性成分得分离,碱性成分不能用它分离,故混合氨基酸样品中得氨基酸组分均为中性或酸性氨基酸。

硅胶得活化温度通常为105℃－110℃,不能过高,故活化过程中得烘干温度控制在70℃左右。

3.氨基酸得显色反应:茚三酮水化后生成水化茚三酮,它与氨基酸得羧基反应生成还原茚三酮、氨基醛,与此同时,还原茚三酮又与氨基茚三酮缩合生成紫红色化合物而使氨基酸斑点显色。

(氨基酸显色反应得化学方程式参见下图)4. Rf值鉴定混合氨基酸中含得氨基酸种类:层析中,物质沿溶剂运动方向迁移得距离与溶液前沿得距离之比为Rf值。

由于物质在一定溶剂中得分配系数就是一定得,故移动速率(Rf值)也就是恒定得,因此可以根据Rf值来鉴定被分离得物质。

氨基酸的薄层层析[原理]氨基酸薄层层析属于吸附层析，主要根据各种氨基酸在吸附剂表面的吸附能力不同进行分离或提纯的一种方法。

将硅胶（吸附剂—作为固定相的支持剂）均匀地铺在玻璃片上，并将氨基酸样品点于吸附剂上。

在密闭容器中，由于吸附剂的毛细管作用使展开剂上行将样品展开。

被分离的氨基酸因结构不同，在吸附剂上的吸附亲和力也不同。

吸附力大的就容易被吸附剂吸附，而较难被溶剂所冲洗（即解吸）；吸附力小的就容易被溶剂携带至较远的距离。

氨基酸在吸附剂和展开剂之间反复多次的进行吸附和解吸附，从而使不同的氨基酸达到分离的目的。

[试剂]（一）硅胶G（二）0.2%羧甲基纤维素钠称取羧甲基纤维素钠1g溶于蒸馏水100 ml中，在沸水浴中煮沸至无气泡，冷却，置冰箱储存，临用前稀释至0.2%。

（二）氨基酸溶液制备下列各氨基酸的异丙醇（90%）溶液各10ml。

1．0.01mol/L精氨酸精氨酸15.9mg溶于90%异丙醇10ml中。

2．0.01mol/L甘氨酸甘氨酸7.5mg溶于90%异丙醇10ml中。

3．0.01mol/L酪氨酸酪氨酸18.1mg溶于90%异丙醇10ml中。

将上述溶液各取出1ml，混合均匀作为氨基酸混合溶液。

（三）展开剂按4：1：1体积比例混合正丁醇，冰乙酸及水。

临用时配置。

（四）0.5%茚三酮丙酮溶液茚三酮0.5g溶于无水丙酮100ml中。

[主要器材]（一）玻璃板（4×10cm）（二）层析缸。

（三）喷雾器。

（四）长颈漏斗。

（五）玻璃毛细管。

（六）恒温干燥箱。

[操作步骤]（一）薄板的制备1．称取硅胶G 0.5g放入研钵中，加1.5ml0.2%羧甲基纤维素钠，研磨成均匀的稀糊状。

2．将上述糊状物倾倒在4×10cm的玻璃片（图11）上，使之均匀地布满于玻片，将玻片轻轻地晃动，使硅胶G均匀分布，表面平坦，光滑，无水层及气泡，然后水平放置在空气中使其自然干燥。

1．薄板上硅胶干后，放入105℃的恒温干燥箱内活化，半小时后取出，晾凉备用。

一、实验目的1. 掌握氨基酸纸层析技术的基本原理和操作方法。

2. 通过纸层析分离和鉴定氨基酸，了解不同氨基酸在纸层析中的行为差异。

3. 熟悉实验仪器的使用和试剂的配制。

二、实验原理纸层析法是一种常用的分离和鉴定小分子化合物的方法。

其原理是利用不同物质在固定相（纸张）上运动速度不同，从而使它们在水平方向上分离。

对于氨基酸来说，它们的极性不同，因此在纸层析过程中，它们的移动速度也会有所不同。

实验中，将混合氨基酸样品点在滤纸上，然后在密闭的层析缸中用适宜的溶剂进行展开。

溶剂在滤纸上向上移动，氨基酸样品随溶剂移动，由于不同氨基酸的极性不同，它们在固定相和流动相之间的分配系数不同，导致移动速度不同，从而在滤纸上形成不同的层析点。

通过比较层析点与标准氨基酸图谱或标准Rf值，可以鉴定不同的氨基酸。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：- 混合氨基酸样品（精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等）- 新华滤纸- 层析缸- 毛细管- 显色剂（茚三酮）- 标准氨基酸溶液2. 实验试剂：- 展层剂：正丁醇：88%甲酸：水 = 15：3：2- 12%氨水- 0.2%茚三酮显色液- 0.5%标准氨基酸溶液四、实验步骤1. 准备层析缸，加入适量的展层剂，使其液面略低于滤纸边缘。

2. 将新华滤纸裁剪成适当大小，放入层析缸中。

3. 用毛细管将混合氨基酸样品点在滤纸的原点处。

4. 将层析缸密封，等待溶剂前沿到达预定距离。

5. 取出滤纸，晾干。

6. 用喷雾器将0.2%茚三酮显色液均匀喷洒在滤纸上。

7. 观察层析点，与标准氨基酸图谱或标准Rf值比较，鉴定不同的氨基酸。

五、实验结果与分析实验中，混合氨基酸样品在纸层析过程中形成了不同的层析点，根据层析点的位置和形状，可以鉴定出精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸。

六、实验讨论1. 展层剂的选择对实验结果有较大影响，应选择合适的展层剂以保证实验的准确性。

2. 层析点的位置和形状与氨基酸的极性有关，极性较大的氨基酸在固定相中分配系数较大，移动速度较慢，层析点距离原点较远；极性较小的氨基酸在固定相中分配系数较小，移动速度较快，层析点距离原点较近。

氨基酸的薄层层析实验2 氨基酸的薄层层析一、目的熟悉层析技术的一般原理，分类及应用范围。

重点掌握薄层层析法的原理及操作技术，用以分离混合氨基酸中各游离氨基酸组分。

了解层析技术来分离不同物质的基本原理，以及层析技术的优点。

二、原理层析法又称色谱法、色层法或层离法，是广泛应用的一种生物化学技术。

根据流动相不同分为液相层析和气相层析。

按照层析过程的机理不同，层析法分为以下几种类型：1、吸附层析：利用吸附剂表面对不同物质吸附性能的差异进行分离。

例如活性炭，硅胶等。

2、分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，使之分离。

3、离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。

对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。

4、凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。

例如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。

5、亲和层析：利用某些蛋白质能与配体分子特异而非共价地结合进行分离。

例如酶和抑制剂，抗原和抗体，激素和受体等按操作形式不同，层析法分为以下几种类型：1、柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。

2、纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。

3、薄层层析：薄层层析是一种微量而快速的层离方法，与纸层析方法类似。

这种层析方法是把吸附剂如氧化铝或硅胶涂布于薄板上（玻璃或金属等）形成薄层，把要分析的样品溶液滴加到薄层的一端，然后在此薄层上用适当的溶剂进行展开即为薄层层析。

本实验中用到薄层层析是一种微量而快速的层离方法。

这种层析方法是把吸附剂如氧化铝或硅藻土涂布于薄板上（玻璃或金属等）形成薄层，把要分析的样品溶液滴加到薄层的一端，然后在此薄层上用适当的溶剂进行展开即为薄层层析。

本实验中硅胶作为一种固相支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。

层析时吸着在硅胶上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。

当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。

薄层色谱法氨基酸薄层色谱法是一种常用的分离和检测技术，广泛应用于化学、生物化学和药学等领域。

本文将介绍薄层色谱法在氨基酸分析中的应用。

1.薄层色谱法原理薄层色谱法基于分配作用和吸附作用实现物质的分离。

其原理可以简单概括为：样品溶液在固定相上经过分配和吸附作用，不同成分会因相互作用力的不同而在固定相上表现出不同的迁移速度，从而实现分离。

在薄层色谱法中，通常使用硅胶或者氧化铝作为固定相，涂布在玻璃、铝板或塑料片等载体上形成薄层。

样品溶液通过毛细管作用被带上薄层，然后放置在合适的溶剂系统中，待溶剂沿薄层上升至一定高度后，取出晾干，最后使用染色剂或显色剂进行可视化检测。

2.氨基酸分析中的薄层色谱法应用薄层色谱法在氨基酸分析中得到广泛应用，其主要包括以下方面：2.1氨基酸定性分析薄层色谱法可以用于氨基酸的定性分析。

首先，将待测样品中的氨基酸经过适当的前处理步骤（如水解、衍生化等），得到能够在薄层上显示明显色斑的化合物。

然后，在薄层色谱板上涂布固定相，并将样品溶液加在起点处。

通过与已知标准氨基酸进行比较，根据色斑的位置和颜色来确定待测样品中存在的氨基酸种类。

2.2氨基酸含量测定薄层色谱法也可用于氨基酸的含量测定。

这需要事先制备一系列含有不同浓度氨基酸的标准曲线。

然后，将待测样品和标准曲线的氨基酸溶液分别涂布在薄层上，并使用相同的溶剂系统进行开发。

通过比较待测样品和标准曲线上色斑的相对强度，可以计算出待测样品中各种氨基酸的含量。

2.3氨基酸纯度检验薄层色谱法还可用于检验氨基酸的纯度。

将纯净氨基酸和待测样品溶液分别涂布在薄层上，并使用相同的溶剂系统进行开发。

比较两者的色斑位置和颜色，如果一致则说明待测样品为纯净氨基酸，否则可能存在杂质或其他成分。

3.TLC与其他方法的比较与其他氨基酸分析方法相比，薄层色谱法具有以下优点：快速：薄层色谱法分析时间短，通常只需要数分钟至数小时。

灵敏度高：对于某些氨基酸，薄层色谱法的检测限可以达到微克甚至亚微克的级别。

薄层色谱法分析氨基酸一、实验目的1 了解利用硅胶G薄层色谱法分离氨基酸的原理；2 掌握薄层色谱的操作技术。

二、实验原理将一定粒度的吸附剂均匀的涂铺在表面光洁的玻璃或朔料平板上，制成薄层板。

然后把待分析试样的溶液滴加在薄层板一端的起始线上。

再把点样后的薄板放在层析缸中，使薄层板的底端浸入适当的溶剂，展开剂在薄层的毛细管作用下。

缓慢的在薄层上向前移动，当展开剂经过原点时，就带着试样组分一起向前移动，在展开的过程中，组分在俩相之间发生多次的吸附-解吸平衡，由于吸附剂对不同组分的吸附能力不同。

展开一定时间后，不用组分互相分离。

各组分在薄层板上的距离用比移值Rf表示。

公式 Rf=a/c(a 为原点中心至斑点中心的距离，c 为原点中心至溶剂前沿的距离）R f 值相差越大则分离越好。

一般在0.2～0.8之间，各组分的Rf值之差应大于0.05。

三、仪器与试剂仪器：层析缸、硅胶板、玻璃毛细管、研钵、干燥箱玻璃喷雾器试剂：、展开剂(正丁醇：乙酸：蒸馏水=3：1：1)、甘氨酸、色氨酸、HCl溶液(0.01mol/L)、显色剂（茚三酮）四、实验步骤1 点样在薄层板一端距离边缘2cm处作起始线。

用玻璃毛细管吸取待测液点在起始线中央处，同法将标准液点在样点一侧，相邻斑点之间距离1-1.5cm，斑点直径控制在2～3mm左右。

2层析在层析缸中倒入适量展开剂（展开剂深度约1.0-1.2cm），加盖密封0.5小时，使展开槽内展开剂蒸汽饱和。

然后把点好样的薄层板近垂直放到层析缸中，点样端倾入层析液约0.5cm（注：样点不能浸入到溶液中）。

展开适当时间后取出硅胶板，并标出前沿位置，吹干，均匀地喷洒茚三酮显色剂，吹干后置于烘箱中（40度）烘干，使斑点显色，用铅笔尖标出斑点中心位置。

3定性分析测量各斑点的“原点中心至斑点中心”和“原点中心至溶剂前沿”的距离，分别计算出各自的R f值。

将展开后的样品斑点与氨基酸标准斑点比较，Rf值相等或相近的斑点为同一种氨基酸。

薄层层析法分离氨基酸实验报告一、实验目的1、掌握薄层层析法的基本原理和操作技术。

2、学会使用薄层层析法分离和鉴定氨基酸。

二、实验原理薄层层析法（Thin Layer Chromatography，TLC）是一种快速、简便、灵敏的分离分析技术。

它基于混合物中各组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，从而实现分离。

在本实验中，硅胶板作为固定相，展开剂作为流动相。

氨基酸在硅胶板上的吸附能力和在展开剂中的溶解度不同，导致它们在板上移动的速度不同，从而实现分离。

三、实验材料与仪器1、材料标准氨基酸溶液：丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro）、苯丙氨酸（Phe）。

样品溶液：含有上述几种氨基酸的混合溶液。

展开剂：正丁醇：冰醋酸：水＝ 4:1:1（体积比）。

显色剂：025%茚三酮溶液。

硅胶 G 板。

2、仪器层析缸。

毛细管。

电吹风。

喷雾器。

直尺。

四、实验步骤1、硅胶板的制备称取适量硅胶 G 于研钵中，加入一定量的蒸馏水，研磨均匀至无颗粒感，形成糊状。

将糊状硅胶均匀涂布在干净的玻璃板上，厚度约为 025 05mm，用直尺刮平。

放置在水平台上，自然晾干后，在 110℃烘箱中活化 30 分钟，取出后置于干燥器中备用。

2、点样用毛细管分别吸取标准氨基酸溶液和样品溶液，在硅胶板的一端约1cm 处，轻轻接触硅胶板，点样直径控制在 2 3mm 之间，每次点样后用电吹风吹干，重复点样 2 3 次，以保证样品量足够。

3、展开将适量展开剂倒入层析缸中，使其深度约为 05 1cm。

将点样后的硅胶板小心放入层析缸中，确保样品点在下方，盖好盖子。

当展开剂前沿上升至距板顶约 1cm 处时，取出硅胶板，用电吹风吹干。

4、显色用喷雾器将 025%茚三酮溶液均匀喷在硅胶板上，然后用电吹风吹干，置于烘箱中加热（约 100℃）5 10 分钟，使氨基酸显色。

五、实验结果与分析1、实验结果观察硅胶板上的斑点，记录标准氨基酸和样品中各氨基酸的位置和颜色。