L-天门冬酰胺酶

浅谈L—天冬酰胺酶与其重组表达载体的研究L—天冬酰胺酶（L-asparaginase，简称L-ASNase）是一种重要的酶类蛋白，能够催化天冬氨酸和水解为天冬酰胺和亮氨酸。

由于其能够降低机体内天冬氨酸的含量，从而抑制白血病细胞的生长，L-ASNase被广泛应用于白血病和淋巴瘤的治疗中。

近年来，随着生物技术的发展，对L-ASNase的研究也取得了重大突破，其中重组表达载体的研究尤为重要。

L-ASNase的传统生产方式主要依赖于放线菌属细菌的发酵产生，这种生产方式存在着生产周期长、纯度低、结构不稳定等诸多问题。

为了解决这些问题，研究人员转而将目光投向了重组表达技术，通过对L-ASNase基因进行重组，把其导入到适当的宿主细胞中，利用宿主细胞的生物合成能力来生产L-ASNase，从而得到高纯度、高稳定性的L-ASNase制剂。

在研究L-ASNase的重组表达过程中，选择合适的表达载体成为了关键。

表达载体是指将外源基因导入宿主细胞并在其内进行表达的工具，一般采用质粒作为表达载体。

质粒在重组表达过程中发挥着非常重要的作用，它能够提供适当的转录启动子、选择性标记基因和表达缓冲区等，从而确保外源基因在宿主细胞中得到高效表达。

目前，研究人员已经成功构建了多种不同的重组表达载体用于L-ASNase的表达。

采用大肠杆菌作为宿主细胞表达L-ASNase成为了研究的热点之一。

大肠杆菌因其生长速度快、易于培养以及基因工程改良方便等优点而成为了理想的宿主细胞。

目前已有多种大肠杆菌表达载体被用于L-ASNase的重组表达，通过对不同载体的比较研究，可以筛选出最适合L-ASNase表达的载体，提高L-ASNase的表达效率。

在研究L-ASNase的重组表达载体时，优化表达条件也是至关重要的。

通过对培养基组分、诱导条件、培养温度等进行优化，可以提高重组蛋白的表达量和纯度，从而为L-ASNase的工业化生产提供有力支持。

除了大肠杆菌表达载体外，还有一些其他宿主细胞被应用于L-ASNase的重组表达。

培门冬酶Pegaspargase【其它名称】PEG-L-天门冬酰胺酶、培加帕酶、Oncaspar【临床应用】用于治疗急性淋巴细胞白血病(适用于对门冬酰胺酶过敏者)。

国外资料提示可用于治疗非霍奇金淋巴瘤。

【药理】1．药效学本药为聚乙二醇(PEG)与门冬酰胺酶(Asparaglnase)的共价结合物，其抗肿瘤作用机制与门冬酰胺酶相同。

由于本药经过PEG的修饰，具有很高的底物专一性，克服了门冬酰胺酶的免疫原性和严重过敏反应衙性。

另外，本药具有更长的半衰期，可大大延长给药间隔时间。

2．药动学本药起效慢(急性淋巴细胞白血病肌内注射后14日起效)，可分布于胸水、腹水等渗出液中。

表观分布容积(嘲为2.1L/m2。

其代谢部位与门冬酰胺酶相似：通过血清蛋白酶分解和单核．吞噬细胞系统清除。

清除半衰期为5.73日。

几乎不通过肾脏排泄(静脉给药后4日在尿中未检测出本药)。

【注意事项】1．禁忌症 (1)对本药过敏者。

(2)胰腺炎患者或有胰腺炎病史者。

(3)使用门冬酰胺酶时有明显出血者。

2．慎用 (1)对门冬酰胺酶过敏者。

(2)糖尿病患者或血糖高于正常者。

(3)肝功能不全者。

(4)孕妇及哺乳期妇女。

3．药物对妊娠的影响美国FDA妊娠危险陛分级为c类。

尚不清楚本药对患者生育能力及胎儿的影响，故孕妇用药时应权衡利弊。

4. 药物对哺乳的影响尚不清楚本药能否分泌人人类乳汁。

鉴于很多药物都可从乳汁中分泌，故哺乳妇女用药时应谨慎。

5．用药前后及用药时应当检查或监测血常规、血糖、血淀粉酶、血浆总蛋白及凝血功能、肝肾功能。

治疗中建议连续监测本药的血药浓度。

【不良反应】主要不良反应为恶心、呕吐、腹泻、腹痛。

多数患者的凝血酶原时间(PT)和纤维蛋白原出现异常。

此外，尚可见发热、体重减轻、嗜睡、精神错乱、血脂异常、低血钙和氮质血症等。

[国外不良反应参考]1．血液系统有报道，本药可引起血清纤维蛋白原水平降低，抗凝血酶Ⅲ活性降低致血栓形成；也发现有患者用药后出现PT延长、白细胞减少、血小板减少、全血细胞减少等。

②中和、吸附、洗脱 提取液加氨水中和至pH7.5，在冰箱中静止沉淀杂蛋白， 吸取上层清液，每升提取液加入10g人造沸石，搅拌吸 附40min，静置倾去上层清液。收集吸附细胞色素 C的 人造沸石，用蒸馏水和氯化钠溶液反复洗涤，然后装
③盐析、浓缩、透析 洗脱液加入固体硫 酸镀达到 45％饱和度，使杂蛋白析出， 过滤。收集透明滤液，缓缓加入 20％ 三氯醋酸，边加边搅拌使细胞色素 C 沉淀析出，离心收集沉淀。再将沉淀 溶于蒸馏水，装入透析袋中，透析至 无硫酸根为止，过滤得细胞色素C粗品 溶液。
⑤精制、冻干 调节pH8.8离心弃去沉淀， 清液再调 pH7.7加入50％聚乙二醇，浓度 达到 16％。2～ 5℃放置 4～ 5天，离心得 沉淀。蒸馏水溶解加 4倍量的丙酮沉淀，同 法反复 1次，pH6.4,0.05mol/L磷酸缓冲液 溶解，50％聚乙二醇处理 1次，即得无热原 的 L一天门冬酸胺酶。溶于 0.8mol/L磷酸 缓冲液，在无菌条件下用 6号垂熔漏斗过滤， 分装，冷冻干燥制得注射用 L一天门冬酸 胺酶成品，每I支 1万或 2万单位。
二、细胞色素C生产工艺
临床上主要用于组织缺氧的急救和辅助治疗药物， 适用于治疗脑、心肌缺氧和其它因缺氧引起的一切 症状。
工艺过程 ①绞碎、提取、压滤
取新鲜或冷冻猪心，去血块、脂肪和肌健等，绞肉机 中绞碎。称取心肌碎肉，加1.5倍量蒸馏水搅拌均匀， 用硫酸调pH4左右，常温搅拌渣再加等量蒸馏水同上 法重复提取1次，合并两次提取液。
④提取、沉淀、热处理 每千克菌体干粉加入 0.01 mol/LpH8的硼酸缓冲液10L37℃搅拌 1.5h，30℃8mol/L醋酸调节pH4.2～4.4，压 滤，滤液加入2倍体积的丙酮，放置3～4h过滤， 收集沉淀，自然风干，得干粗酶。 取粗制酶，加入0· 3％甘氨酸，调节pH8.8搅拌 1.5h离心，上清液60℃30min热处理。上清液 加 2倍体积的丙酮，析出沉淀，离心，收集酶 沉淀，0.01mol/L，pH8磷酸缓冲液溶解，离 心得上清酶溶液。

【别名】L-天门冬酰胺酶、左旋门冬酰胺酶、天门冬酰胺酶【英文名】L-Asparaginase,Amidohydrolase,Crasnitin,Elspar,Kidrolase,Leunase,Colasp-as，L-As【作用特点】本品为取自大肠杆菌的酶制剂类抗肿瘤药物，能将血清中的门冬酰胺水解为门冬氨酸和氨，而门冬酰胺是细胞合成蛋白质及增殖生长所必需的氨基酸。

正常细胞有自身合成门冬酰胺的功能，而急性白血病等肿瘤细胞则无此功能，因而当用本品使门冬酰胺急剧缺失时，肿瘤细胞因既不能从血中取得足够门冬酰胺，亦不能自身合成，使其蛋白质合成受障碍，增殖受抑制，细胞大量破坏而不能生长、存活。

本品亦能干扰细胞DNA、RNA的合成。

可能作用于细胞G1增殖周期中，为抑制该期细胞分裂的细胞周期特异性药。

本品经肌肉或静脉途径吸收，血浆蛋白结合率仅约30%，吸收后能在淋巴液中测出，但在脑脊液中的浓度很低。

经肌内注射的血浆T1/2为39-49小时，静脉注射的血浆T1/2为8-30小时。

肌内注射后的达峰时间为12-24小时，但停用本品后的23-33日，血浆中还可以测出门冬酰胺，本品排泄似呈双相性，仅有微量呈现于尿中。

【功能主治】适用于治疗急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、何杰金病及非何杰金病淋巴瘤、黑色素瘤等。

本品对上述各种瘤细胞的增殖有抑制作用，其中对儿童急淋的诱导缓解疗效最好，有时对部分常用化疗药物缓解后复发的患者也可能有效，但单独应用时缓解期较短，而且容易产生耐药性，故现多与其他化疗药物组成联合方案应用，以提高疗效。

【用法用量】1.口服：溶液剂，每次5～15ml，睡前服。

2.静脉注射、静脉滴注、肌内注射:每次剂量为20～2000IU/kg，每周1～2次，3～4周为一个疗程，用生理盐水加5%葡萄糖注射液稀释后方可注射，输液在8小时内输完;肌内注射时可用2ml生理盐水溶解1万单位。