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门冬酰胺酶的制备与分析

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重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定

赵雅嫱 黄妤璠 龙益如 王敏敏 白华山

1 原理

本实验主要是利用基因工程手段构建L-天冬酰胺酶基因工程菌。L-天冬酰胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性，特别是对非霍奇金淋巴瘤和ALL的有很强的抑制作用，目前适用于治疗黑色素瘤、非何杰金病淋巴瘤等，也可以用于治疗急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病等。

目前，我国虽已投入生产L-天冬酰胺酶，但是较国外生产成本高、菌种产酶活性低，提取纯化工艺落后。针对这些问题，本实验对大肠杆菌重组L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进行了系统性的探究，意图改进重组L-天冬酰胺酶的表达，优化其纯化工艺，分析其鉴定方法与性质。

本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的摸索；酶蛋白的诱导表达条件分析；酶蛋白分离纯化手段的比较和选择，如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose 离子交换层析以及亲和层析；重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测定等等。

2 实验材料

实验仪器见表1.1。型号和生产厂家根据实验室现有条件核定。

表1.1 实验仪器或装置

仪器名称 型号 生产厂家

超净工作台

PCR扩增仪

恒温培养箱

超低温冰箱

台式离心机

恒温摇床

涡轮振荡器

高压灭菌锅

蛋白电泳仪

核酸电泳仪

凝胶成像仪

紫外分光光度计

高效液相色谱仪

扫描型紫外分光光度计

制冰机

超声清洗机

实验试剂和材料见表1.2。材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室现有条件核定。

表1.2 试剂和材料

试剂或材料 材质或规格 来源

E.coli 野生型菌株 CPU21009 实验室储存

pMD18-T 50ng/μl 宝生物工程有限公司

pET-22b 50ng/μl 宝生物工程有限公司

Nde Ⅰ 10U/μl 宝生物工程有限公司

Xho Ⅰ 10U/μl 宝生物工程有限公司

T4 DNA Ligase 350U/μl 宝生物工程有限公司

DNA纯化试剂盒 离心柱型 天根生化科技（北京）有限公司

Ni-NTA树脂纯化试剂盒 离心柱型 天根生化科技（北京）有限公司

质粒提取试剂盒 离心柱型 天根生化科技（北京）有限公司

胶回收试剂盒 离心柱型 天根生化科技（北京）有限公司

CaCl2 60mmol/L 实验室储存

PBS 50x 实验室储存

NaCl 分析纯

Taq 酶 Mix 分析纯

(NH4)2S2O8 分析纯

C2H6OS 分析纯

CH4O 分析纯

冰乙酸 分析纯

C2H6O 分析纯

氨基丁三醇 分析纯

考马斯亮蓝 分析纯

SDS 分析纯

Nessler's 试剂 Reagent,ACS 美国Spectrum公司

酵母粉 分析纯

L-天冬酰胺 分析纯 英国OXOID公司

蛋白胨 分析纯

甘氨酸 分析纯

琼脂糖 分析纯

葡萄糖 食品级

TEMED 优级纯

溴酚蓝 分析纯

IPTG 优级纯

丙三醇 分析纯

3 实验思路与步骤

本实验设计从大肠杆菌野生型菌株CPU210009中提取总DNA，通过PCR扩增目的基因ansB，随后对PCR产物进行纯化。后分别构建重组克隆载体和表达载体，将克隆载体导入宿主中，筛选阳性克隆，再经双酶切和测序鉴定。后将

构建的工程菌在合适的培养条件下发酵培养，利用IPTG诱导表达重组蛋白，对重组蛋白进行提取纯化。再由考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，SDS-PAGE电泳测定分子量以及进行肽图分析和紫外扫描并与天然产品比较。同时，实验过程中以纳氏试剂法监控L-天冬酰胺酶酶活力，并计算回收率。

3.1 大肠杆菌L-天冬酰胺酶II基因ansB的获取

3.1.1 大肠杆菌ansB基因的选择与引物

从NCBI中查找获取大肠杆菌ansB的基因序列，其Gene ID 为947454，基因长度为1047bp,序列如下：

1 atggagtttt tcaaaaagac ggcacttgcc gcactggtta tgggttttag tggtgcagca

61 ttggcattac ccaatatcac cattttagca accggcggga ccattgccgg tggtggtgac

121 tccgcaacca aatctaacta cacagtgggt aaagttggcg tagaaaatct ggttaatgcg

181 gtgccgcaac taaaagacat tgcgaacgtt aaaggcgagc aggtagtgaa tatcggctcc

241 caggacatga acgataatgt ctggctgaca ctggcgaaaa aaattaacac cgactgcgat

301 aagaccgacg gcttcgtcat tacccacggt accgacacga tggaagaaac tgcttacttc

361 ctcgacctga cggtgaaatg cgacaaaccg gtggtgatgg tcggcgcaat gcgtccgtcc

421 acgtctatga gcgcagacgg tccattcaac ctgtataacg cggtagtgac cgcagctgat

481 aaagcctccg ccaaccgtgg cgtgctggta gtgatgaatg acaccgtgct tgatggccgt

541 gacgtcacca aaaccaacac caccgacgta gcgaccttca agtctgttaa ctacggtcct

601 ctgggttaca ttcacaacgg taagattgac taccagcgta ccccggcacg taagcatacc

661 agcgacacgc cattcgatgt ctctaagctg aatgaactgc cgaaagtcgg cattgtttat

721 aactacgcta acgcatccga tcttccggct aaagcactgg tagatgcggg ctatgatggc

781 atcgttagcg ctggtgtggg taacggcaac ctgtataaat ctgtgttcga cacgctggcg

841 accgccgcga aaaccggtac tgcagtcgtg cgttcttccc gcgtaccgac gggcgctacc

901 actcaggatg ccgaagtgga tgatgcgaaa tacggcttcg tcgcctctgg cacgctgaac

961 ccgcaaaaag cgcgcgttct gctgcaactg gctctgacgc aaaccaaaga tccgcagcag

1021 atccagcaga tcttcaatca gtactaa

根据该基因序列，使用Primer 5.0 设计引物，并考虑到后续构建克隆载体和表达载体的需求，在引物序列中添加限制性酶切位点和保护序列，获得引物如下：

上游引物 P1 ：GTGCAGCACATATGTTACCCAATATCACCA

下游引物 P2 ：GCGCTCGAGTTAGTACTGATTGAAAGATCTG

上游引物P1 中包含一个Nde Ⅰ酶切位点，下游引物中包含一个Xho Ⅰ酶切位点。所设计引物交由南京华大基因科技有限公司负责合成。

3.1.2 大肠杆菌全基因组DNA的提取

使用大肠杆菌基因组DNA全提取试剂盒提取E.coli全基因组DNA，具体步骤如下：

(1)从实验室斜面保存的E.coli 野生型菌株CPU21009上，取接种环，挑单菌落，转移到50 mL的液体LB培养基，在温度37Ⅰ、 180 r／min发酵过夜。

(2)取菌液1 mL至1.5 mL的离心管管中，离心机参数调至12000离心2 min，离心3 min，弃去上清液。

(3)加入0.2 mL GA缓冲液，用漩涡振荡器混合沉淀完全悬浮。加入4 μL

RNaseA(100mg／mL)溶液，用涡旋振荡器振荡振荡15 s，室温放置5 min。

(4)加入0.02 mL蛋白酶K，混合均匀。

(5)加入0.02 mL GB缓冲液，混合均匀，将水浴锅调到70Ⅰ，把离心管放入10

min，短暂离心除去离心管管盖和管壁的水珠。

(6)加入0．22 mL分析纯乙醇，在15 s内充分混匀，此时会出现絮状物，短暂离心除去EP管盖和管壁的水珠。

(7)将(6)中所得絮状物和液体均加入安装进收集管的吸附柱中，离心机参数调至12000离心1 min，弃去柱底液体，安装好吸附柱。

(8)加0.5 mL GD缓冲液至吸附柱中，离心机参数调至12000离心1 min，倒掉柱底液体，并安装好吸附柱。

(9)加0.6 mL PW漂洗液至吸附柱中，离心机参数调至12000离心1 min，倒掉柱底液体，并安装好吸附柱。

(10)再加0.5 mL GD缓冲液，离心机参数调至12000离心1 min倒掉柱底液体。

(11)将吸附柱放入收集管中，离心机参数调至12000离心2 min，倒掉柱底液体。在室温下静置20 min吸附柱，完全晾干漂洗液，使吸附材料干燥。

(12)将无乙醇气味的吸附柱放入干净的离心管中，悬滴0.04 mL双蒸水到吸附膜的中间部分，在室温静置5 min，离心机参数调至12000离心2 min，收集溶液。

(13)将(12)中收集的溶液吸净后加回吸附柱，放置5 min，离心机参数调至12000离心2 min。

(14)将提取后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，以便用于后续操作。

3.1.3 PCR扩增ansB基因

(1)在PCR扩增仪上设计如下反应程序：

①模板DNA预变性94Ⅰ 5 min；

②变性：94 Ⅰ条件下45 s；

③退火：58 Ⅰ条件下30 s；

④延伸：72 Ⅰ条件下1 min；

⑤循环步骤②～④30次；

⑥最后在72 Ⅰ延伸10 min。

(2)在PCR管建立整体为0.05 mL的PCR扩增反应体系：

大肠杆菌总DNA模板 0.003 mL

上游引物P1 0.001 mL

下游引物P2 0.001 mL

Taq酶Mix 0.025 mL

ddH2O 0.02 mL

(3)将样品混合后稍作离心，将反应管放入PCR扩增仪中进行PCR反应。

(4)结束PCR扩增，取0.005 mL溶液，进行1％Agarose gel electrophoresis鉴定，判断是否有基因片段存在于PCR中，以及其大小。

3.1.4 PCR扩增产物的纯化

(1)将0.04 mL PCR扩增后体系用双蒸水调整至0.1 mL，加入0.5 mL结合液DB，充分混匀。

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重组门冬酰胺酶II的表达及制备

重组门冬酰胺酶II的表达及制备

重组天冬酰胺酶II研究进展

摘 要 L-天冬酰胺酶Ⅱ因能够水解L-天冬酰胺而具有抗肿瘤活性，在急性淋巴母细胞白血病的治疗方面应用甚广。目前，利用重组DNA技术产生的重组菌表达产生的L-天冬酰胺酶Ⅱ是临床应用的一个重要来源，本文主要对这类重组菌的构建、表达研究及后续产物的分离纯化进行综述。

关键词 L-天冬酰胺酶Ⅱ；大肠杆菌；基因工程；分离纯化

Ⅰ引言

L-天冬酰胺酶（Asparaginase，门冬酰胺酶或天冬酰胺酶；EC3.5.1.1）用于急性淋巴母细胞性白血病的治疗已有30年了[1]。L-天冬酰胺酶可催化L-天冬酰胺（L-Asn）水解成L-天冬氨酸（L-Asp）和氨（NH3），此外它还能催化L-谷氨酰胺发生类似反应[2]。由于某些肿瘤细胞缺乏L-天门冬酰胺合成酶（正常人体细胞含有该酶），而细胞存活需要外源天冬酰胺的补充，L-天冬酰胺酶对天冬酰胺的降解作用恰好切断了门冬酰胺的血源性供给，肿瘤细胞由于缺乏该氨基酸不能进行蛋白质合成而死亡[1,3]。

目前，L-天冬酰胺酶分为I型和II型，尤其是II型，因其具有肿瘤抑制活性而被广泛研究[2]（下文如无特别说明，天冬酰胺酶即指L-天冬酰胺酶II）。天冬酰胺酶的谷氨酰胺水解活性给其临床应用带来了严重的副反应，因此筛选低谷氨酰胺酶活性的天冬酰胺酶是研究重点之一[2]。本文主要就L-天冬酰胺酶II的表达与制备进展进行综述。

Ⅱ工程菌的构建，发酵和分离纯化研究

1961年豚鼠血清中的抗肿瘤因子被证实为L-天冬酰胺酶[4]，随后科学家们又在大肠杆菌中发现了具有抗肿瘤活性的天冬酰胺酶，之后该酶又陆续在产气杆菌，芽孢杆菌，欧文氏菌，变形杆菌，链霉菌，曲霉，酵母等等微生物中被发现[5]。目前，临床使用的L-天冬酰胺酶主要从大肠杆菌，菊欧文菌和胡萝卜软腐欧文菌菌株中分离得到，这些来源的天冬酰胺酶其肿瘤抑制作用机制相同，差别主要在于药代动力学性质[1]。

尽管有很多菌株能产生天冬酰胺酶，国内外也已经构建了多株天冬氨酸酶高效表达的基因工程菌[6]，但是其中以大肠杆菌的研究最为充分[7]，接下来本文主要围绕表达天冬酰胺酶的大肠杆菌的研究进行展开。

实验三十 重组门冬酰胺酶Ⅱ的纯化与分析

实验三十 重组门冬酰胺酶Ⅱ的纯化与分析

实验三十 重组门冬酰胺酶Ⅱ的纯化与分析

注：此实验来自项目重组E.coli L-门冬酰胺酶制备研究（科技部）的成果

【目的要求】

1．了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原理。

2．掌握以基因工程菌种E.coli/pANS2为材料进行工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白重组门冬酰胺酶Ⅱ及表达酶蛋白制备和酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理和技术方法。

【实验原理】

L-门冬酰胺酶(L-asparaginase，EC3.5.1.1)广泛存在于动物的组织、细菌、植物和部分啮齿类动物的血清中，但在人体的各种组织器官中的分布未见报道。L-门冬酰胺酶活性形式为一同源四聚体，每一亚基由330个氨基酸组成，分子质量为34 564u，能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨。由于某些肿瘤细胞缺乏L-门冬酰胺酶合成酶，细胞的存活需要外源L-门冬酰胺的补充，如果外源门冬酰胺被降解，则由于蛋白质合成过程中氨基酸的缺乏，导致肿瘤细胞的死亡。因此，L-门冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物，多年来一直是小儿急性成淋巴细胞性白血病(Acute Lumphoblastic Leukaemia,ALL)和淋巴肉瘤(Lymphosarcoma)临床化疗中重要的配伍药物之一。

用微生物，特别是大肠杆菌来生产L-门冬酰胺酶已有广泛深入的研究。大肠杆菌能产生2种天冬酰胺酶，即L-门冬酰胺酶Ⅰ和L-门冬酰胺酶Ⅱ，分别由其染色体上基因ansA和ansB编码。只有L-门冬酰胺酶Ⅱ才有抗肿瘤活性。美、德、日均有L-门冬酰胺酶Ⅱ商品出售。我国天津生化厂曾于1974年投产，后因菌种退化，产量降低而停产。国内目前用药全靠进口。1995年，本院构建了高效分泌表达L-门冬酰胺酶Ⅱ的基因工程菌， 重组L-门冬酰胺酶Ⅱ(rL-ASPⅡ)在大肠杆菌细胞中合成后分泌到细胞周质中。表达的rL-ASPⅡ相对分子质量为138 356 Da，pI为4.85，紫外最大吸收值在278nm处。

处方分析与工艺制备

处方分析与工艺制备

1 处方分析与工艺制备

1. VB2 注射液（riboflavin injection） 本品为维生素类药，参与体内生物氧化作用，用于预防和治疗口角炎、舌炎、结膜炎、脂溢性皮炎等维生素 B2 缺乏症。

【处方】维生素B2（主药） 2.575g

烟酰胺（助溶剂） 77.25g

乌拉坦（局麻剂） 38.625g

苯甲醇（抑菌剂） 7.5ml

注射用水 加至1000ml

【制备】将维生素 B2 先用少量注射用水调匀待用，再将烟酰胺、乌拉坦溶于适量注射用水中，加入活性炭 0.1g，搅拌均匀后放置15min，粗滤脱碳，加注射用水至约900ml，水浴上加热至80-90℃，慢慢加入已用注射用水调好的维生素B2，保温20-30min，完全溶解后冷却至室温。加入苯甲醇，用 0.1N 的HCl 调节pH 至5.5-6.0，调整体积至1000ml，然后在10℃以下放置8h，过滤至澄明、灌封，100℃流通蒸汽灭菌15min 即可。

【处方与制备工艺分析】

① 维生素 B2 在水中溶解度小，0.5%的浓度已为过饱和溶液，所以必须加入大量的烟酰胺作为助溶剂。此外还可用水杨酸钠、苯甲酸钠、硼酸等作为助溶剂。还有 10%的 PEG600 以及 10%的甘露醇也能增加维生素 B2 的溶解度。

② 维生素 B2 水溶液对光极不稳定，在酸性或碱性溶液中都易变成酸性或碱性感光黄素。所以在制造本品时，应严格避光操作，产品也需避光保存。酰脲和水杨酸钠能防止维生素B2 的水解和光解作用。 本品还可制成长效混悬注射剂，如加 2%的单硬脂酸铝制成的维生素 B2 混悬注射剂，一次注射 150mg，能维持疗效45 天，而注射同剂量的水性注射剂只能维持药效 4-5 天。

2. 柴胡注射液（bupleuri injection） 本品为柴胡挥发油的灭菌溶液，用于流行性感冒的解热止痛。

两种门冬酰胺酶效价检测方法的比较

两种门冬酰胺酶效价检测方法的比较

龙源期刊网

两种门冬酰胺酶效价检测方法的比较

作者：郭睿

来源：《中国化工贸易·中旬刊》2018年第10期

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摘 要：L-门冬酰胺酶（Asparaginase）是一种被收录进《中国药典》2015年版用于治疗小儿急性白血病的药物。在《中国药典》2015年版中用于检测其效价的是比色法。但出现用反相高效液相色谱法检测效价的方法，通过试验发现反相高效液相色谱法不能用于门冬酰胺酶效价检测。 龙源期刊网

关键词：L-门冬酰胺酶;效价检测

L-门冬酰胺酶（Asparaginase）是一种被收录进《中国药典》2015年版[1]用于治疗临床主要用于急性淋巴细胞性白血病，也用于急性粒细胞性白血病，急性单核细胞性白血病和恶性淋巴瘤的药物。因淋巴肿瘤细胞不能自身合成对生长必要的氨基酸门冬酰胺，必须依赖宿主供给，而门冬酰胺酶能使门冬酰胺水解，使细胞缺乏门冬酰胺，从而抑制其生长的作用。正常细胞由于能够自主合成门冬酰胺，故受影响较少。

在《中国药典》2015年版中，对于L-门冬酰胺酶的活性测定方法为终点法，即是考察一定量的蛋白酶在一定时间内水解酰胺基产生的游离铵离子的量，再将碘化汞钾与氨反应生成黄色溶液用比色法测定，根据氨量计算酶的效价。并规定每1 mg蛋白含门冬酰胺酶的活力不得低于250单位。我公司的一家印度客户则提供另一种利用反相高效液相色谱法来测定门冬酰胺酶的效价。本文主要对这两种方法进行分析研究，探索L-门冬酰胺酶效价更高效、更准确的测定方法。

1 《中国药典》2015年版中门冬酰胺酶效价检测方法

1.1 试验材料与方法

1.1.1 试验仪器

紫外-可见分光光度计、恒温水浴锅、105℃鼓风干燥箱、电子天平（感量为0.1mg）、秒表、容量瓶、吸量管、进样器。

1.1.2 试剂与药品