植物组织蛋白提取方法
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植物蛋白质提取方法总汇
一、植物组织蛋白质提取方法
1、根据样品重量（ 1g 样品加入 3.5ml 提取液，可根据材料不同适当加入），准备提 取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（ 3-4 小时）。
3、 用离心机离心 8000rpm40min4 C或 11100rpm20min4 °C
4、 提取上清液，样品制备完成。
蛋白质提取液： 300ml
1 、 1Mtris-HCl （ PH8） 45ml
2、 甘油（ Glycerol ） 75ml
3、 聚乙烯吡咯烷酮（ Polyvinylpolypyrrordone ） 6g
这种方法针对 SDS-PAGE垂直板电泳！
二、植物组织蛋白质提取方法
氯醋酸—丙酮沉淀法
1 、在液氮中研磨叶片
2、 加入样品体积3倍的提取液在-20 C的条件下过夜，然后离心（4 C 8000rpm以上1 小时）弃上清。
3、 加入等体积的冰浴丙酮（含 0.07%的3 -巯基乙醇），摇匀后离心（4C 8000rpm 以上 1
小时），然后真空干燥沉淀，备用。
4、 上样前加入裂解液， 室温放置 30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中， 然后离心 （15C
8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在 4 C待用。
5、 用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入 -80 C备用。
药品：提取液：含10%TCA和0.07%的3 -巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS 溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为 5ml），使用前再加入 1M的DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只 是电泳的条带会减少！
三、组织：肠黏膜 目的：WESTERN BLO检测凋亡相关蛋白的表达
应用TRIPURE提取蛋白质步骤：
含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每ImITRIPURE用量）
倒转混匀，置室温 10min
离心： 12000 g，10min，4 度，弃上清
加入0.3M盐酸胍/95 %乙醇：（2ml每ImITRIPURE用量）
振荡，置室温 20min
离心： 7500g ，5 min ， 4 度，弃上清
重复 0.3M 盐酸胍 /95 %乙醇步 2 次
沉淀中加入 100%乙醇 2ml
充分振荡混匀，置室温 20 min
离心： 7500g ，5min，4 度，弃上清吹干沉淀
1 % SDS溶解沉淀
离心： 10000g，10min ， 4 度
取上清 -20 度保存（或可直接用于 WESTERN BLO）T
存在的问题：加入 1%SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块， 4度离心后又多了白色
沉定，SDS结晶？测浓度，含量才 1mg/ml左右。
解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加 2X BUFFER然后煮5- 10
分钟，效果很好的。
四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根
1 、 200 毫克样品置于冰上磨碎
2、加 lysis buffer ，离心， 10000rpm，4 度， 5min 取上清
3、重复离心 5min五、蛋白质样品制备
秧苗蛋白质样品的提取按 Davermal 等（ 1986）的方法进行。
100mg材料剪碎后加入1OmgPVP-4O（聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂，用液氮研磨成 粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即卩0.07% B -巯基乙醇），混匀，-20 C 沉淀1小时，4C, 15000 r/min 离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮（含10 mM3 - 巯基乙醇），再于-20 C沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80%丙酮（含10 mM3 - 巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20卩1（可调）UKS液[9.5 M 尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS 0.5%DTT（二
硫苏糖醇 ）， 2% Ampholine （Amersham Pharmacia Biotech Inc ， pH3.5-10） ， 6%
Triton X-100] , 37C温育30min，期间搅动几次，28度（温度低，高浓度的尿素会
让溶液结冰）16000 r/min 离心15 min，离心力越大时间长一点越好！ 上清即可上样电泳。
或者 -70 度保存。
六、植物根中蛋白质的抽取
（1） sample, 液氮研磨
（2） 装 1.5 ml centrifuge 用 tube
（3） 加 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul
（4） 12000 rpm, 4 度, 10-15minite
（5） 取上层液，蛋白质就在里面
三氯醋酸—丙酮沉淀法
1 、在液氮中研磨叶片
2、 加入样品体积3倍的提取液在-20 C的条件下过夜，然后离心（4 C 8000rpm以上1小时） 弃上清。
3、 加入等体积的冰浴丙酮（含 0.07%的3 -巯基乙醇），摇匀后离心（4 C 8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。
4、 上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中， 然后离心（15 C 8000rpm
以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在 4C待用。
5、 用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入 -80 C备用。
药品：
提取液：含10%TCA和0.07%的 3 -巯基乙醇的丙酮
裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml）,使用前再加入 1M 的
DTT65ul/ml 。
这种方法针对双向电泳， 杂质少， 离子浓度小的特点！ 当然单向电泳也同样适用， 只是电泳 的条带会减少！植物组织蛋白质提取方法 （一）
1、根据样品重量（ 1g 样品加入 3.5ml 提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放 在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（ 3-4 小时）。
3、用离心机离心 8000rpm40mi n4C或 11100rpm20mi n4C
蛋白质提取液： 300ml
4 、提取上清夜，样品制备完成。
1 、 1Mtris-HCl （ PH8） 45ml
2、 甘油（ Glycerol ） 75ml
3、 聚乙烯吡咯烷酮（ Polyvinylpolypyrrordone ） 6g 这种方法针对 SDS-PAG，E 垂直板电泳！
植物组织蛋白质提取方法（二）
三氯醋酸—丙酮沉淀法
1 、在液氮中研磨叶片
2、 加入样品体积3倍的提取液在-20C的条件下过夜，然后离心（4C 8000rpm 以上1小时） 弃上清。
3、 加入等体积的冰浴丙酮（含 0.07%的3 -巯基乙醇），摇匀后离心（4C 8000rpm 以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。
4、 上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中， 然后离心（15C8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在 4C待用。
5、 用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入 -80C备用。
药品：
提取液：含10%TCA和0.07%的 3 -巯基乙醇的丙酮
裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml）,使用前再加入 1M 的
DTT65ul/ml。
这种方法针对双向电泳， 杂质少， 离子浓度小的特点！ 当然单向电泳也同样适用， 只是电泳 的条带会减少！
TCA-丙酮沉淀法，有人做过落叶松的的花粉
步骤：
1 、液氮研磨充分
2、 加入含 10%TCA、 0.07%的巯基乙醇的丙酮溶液， -20 度沉淀过夜
3、 4 度， 1000rpm 离心 1 个小时，弃上清。
4、 加 100%丙酮，含 0.07%的巯基乙醇，沉淀一小时
5、 4 度， 1000rpm 离心 15分钟，弃上清
6、 重复第 4、 5 步
7、 80%丙酮，含 0.07%的巯基乙醇，沉淀一小时
8、 重复第 5 步
9、 沉淀干燥。
1 0.低温保存样品
TCA/丙酮法：
(1)取 4g 果肉，用液氮在研钵中将其研磨成粉。 (2) 加入12.5%冰冷的TCA/丙酮(含0.07% B -巯基乙醇)，匀浆液在 -20 oC下，放置3h, 纱布过滤。
(3) 滤液在20000g离心30min，收集沉淀。
(4) 用冷丙酮洗3次，沉淀在4oC下干燥，备用。
2. 匀浆法：
( 1 )称取 4g 果肉，用液氮在研钵中研磨成粉。
(2) 加入 4ml 的匀浆缓冲液 (匀浆液中含有 20 mMTris-HCl (pH 7.5), 250 mMsucrose, 10
mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 以及 1% Triton X-100) ，继续研磨。
(3) 匀浆液 20000g 离心 30min。
(4) 将上清转移到新的离心管中，加入终浓度为 10%TCA溶液，4oC下放置2 h。
(5) 20000g离心40min,收集沉淀。
(6) 用冷丙酮洗3次，沉淀在4oC下干燥，备用。
3. 酚提取法：
(1) 称取 4g 果肉,用液氮在研钵中研磨成粉。
(2) 加入 4ml 的匀浆缓冲液 (匀浆液中含有 20 mMTris-HCl (pH 7.5), 250 mMsucrose, 10
mM EGTA, 1 mM PMSF, 1 mM
DTT, 以及 1% Triton X-100) ,继续研磨。
(3) 匀浆液 20000g 离心 30min。
(4) 在上清液中加入等体积的 pH7.8 Tris-饱和酚，充分摇荡，混匀，10000g，4oC下离心
30min，上层为水相，中间白色物质为杂质， 下层为酚相。(注：当提高匀浆缓冲液中 sucrose 的浓度到1M时，酚相会出现在上层。)
(5) 回收酚相,加入 5倍体积含 0.1M
乙酸铵的预冷甲醇，充分混匀， -20oC下过夜，沉淀蛋白。
(6) 沉淀用含 0.1M 乙酸铵的预冷甲醇洗 2次。预冷丙酮洗 2次。
(7) 沉淀在4oC下干燥，备用
