γ-聚谷氨酸的合成、性质和应用

γ-聚谷氨酸的合成、性质和应用

彭英云;张涛;缪铭;沐万孟;江波

【摘 要】γ-聚谷氨酸是一种生物可降解的高分子聚合物,可由微生物发酵得到。γ-聚谷氨酸具有良好的水溶性和吸附性,能彻底被生物降解,对环境和人体无害,这使得γ-聚谷氨酸在食品、化妆品、医药和农业等领域具有广阔的应用前景。综述了γ-聚谷氨酸的化学结构、性质、生产方法及其应用。

【期刊名称】《食品与发酵工业》

【年(卷),期】2012(038)006

【总页数】6页(P133-138)

【关键词】γ-聚谷氨酸;生物合成;生物可降解;应用

【作 者】彭英云;张涛;缪铭;沐万孟;江波

【作者单位】江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122 盐城工学院化学与生物工程学院,江苏盐城224003;江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122;江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122;江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122;江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122

【正文语种】中 文

【中图分类】TQ929

γ-聚谷氨酸(Poly γ-Glutamate，γ-PGA)是一种多聚氨基酸类的环保型多功能生物可降解高分子材料。作为一种高分子聚合物，γ-PGA具有一些独特的物理、化学和生物学特性，如良好的水溶性，超强的吸附性，能彻底被生物降解，无毒无害，可食用等，可作为诸如保水剂、增稠剂、絮凝剂、重金属吸附剂、药物/肥料缓释剂及药物载体等的原料，在农业、食品、医药、化妆品、环保、合成纤维和涂膜等领域具有广泛的应用前景。近十几年以来，日本、韩国、德国、美国、加拿大、台湾等多个国家和地区的学者在γ-PGA合成与应用方面进行了很多的研究并取得一定的成果，国内一些高校和研究所对γ-PGA的研究正处于兴起阶段。随着人们环保意识的增强，γ-PGA的研究和应用越来越受到世界各国学术界的关注，已成为生物降解高分子材料的研究热点之一。

聚谷氨酸(PGA)主要由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过酰胺键聚合而成，由于聚合方式不同，聚谷氨酸主要有两种构型:α-聚谷氨酸(通过α-酰胺键聚合，α-PGA)和 γ-聚谷氨酸(通过 γ-酰胺键聚合，γ-PGA)(结构式见图1和图2)［1］。从结构式可以看出，α-PGA是由γ-酰胺键连接而成的直链分子，链之间存在大量的氢键，使得它具有良好的水溶性。γ-PGA中大量的游离羧基提供了阳离子结合的基团，使其对金属离子有良好的吸附性。羧基也是容易发生酯化、交联等反应的活性基团，利用这一性质可以使γ-PGA与交联剂发生交联反应生成性能优良的吸水树脂;如果使羟基与某些药物成分的基团发生反应，γ-PGA可成为药物载体或缓释剂。

α-PGA主要由化学合成法得到，工艺复杂，副产物多，且得率低［1］;γ-PGA多由微生物发酵法得到，主要菌种为地衣芽孢杆菌属和枯草芽孢杆菌属，也有报道从其他菌种如古生菌［2］、细菌［3］和真核生物［4］发酵得到。微生物发酵法生产成本较低且生产过程对环境污染小，所以目前研究的重点多集中于γ-PGA。

γ-PGA最初由炭疽芽孢杆菌中发现，在高CO2浓度的诱导下，炭疽芽孢杆菌可产生γ-D-聚谷氨酸，产生的γ-D-聚谷氨酸附着在细胞壁上并在微生物细胞外面形成荚膜，炭疽芽孢菌株的毒性限制了其在工业上的应用［5］。巨大芽孢杆菌也可产生此类荚膜形式的γ-PGA［6］。微生物产生的此种γ-PGA可称为结合型γ-PGA。 由于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的易培育性和安全性，现在γ-PGA的生产大多报道由此类菌株产生，表1中列出了一些产γ-PGA菌株的生产特性。γ-PGA一般以游离形式直接分泌到培养基中，可静态发酵也可动态发酵，可称为游离型γ-PGA。γ-PGA可作为细胞外营养物存储，可促进细胞膜的形成，在非常时期为微生物提供生存所需，可防止噬菌体的侵袭，并在高盐环境下对金属离子进行包裹从而对细胞具有保护作用。

根据细胞生长的营养要求是否需要谷氨酸，可以把γ-PGA产生菌分为两大类:一种为谷氨酸依赖型［7］，如 Bacillus licheniformis ATCC9945［8］，B．subtilis

IFO3335［9］，B．subtilis F-2-01［10］等，另一种为非谷氨酸依赖型，如

B．subtilis TAM-4［11］，B．licheniformis A35［12］。Jung 等人［13］对1 株 Bacillus sp．RKY3 的研究表明，培养基如不添加谷氨酸则没有γ-PGA的生成，在0～90 g/L的范围内，L-谷氨酸含量越高，γ-PGA产量越高，可达到83.2g/L，说明此菌株是1株谷氨酸依赖型菌株，且谷氨酸的利用率达到92.4%。Yao等［14］利用13C标记葡萄糖对菌株B．subtilis NX-2产γ-PGA代谢途径进行分析，结果表明，对于谷氨酸依赖型菌株，培养基中葡萄糖的加入主要用于能量代谢和菌体合成，只有少量(6% ～9%左右)参与 γ-PGA的合成，而加入的谷氨酸是合成的主要底物。

由γ-PGA的结构可知，合成γ-PGA需要有底物L-谷氨酸或D-谷氨酸。γ-PGA合成所需的底物谷氨酸的来源可分为两部分，内源底物和外源底物。内源底物是指由微生物通过自身合成谷氨酸底物，最广泛的途径是通过葡萄糖经过糖酵解，生成丙酮酸，然后进入TCA循环，然后通过α-酮戊二酸转化成谷氨酸(图 3)［1］。而外源底物是直接添加的 L-或 D-谷氨酸，一般直接在培养基中添加L-谷氨酸，从图3中可以看出，L-谷氨酸在消旋酶的作用下先转变为D-谷氨酸，D-谷氨酸和L-谷氨酸再在聚谷氨酸合成酶基因(PgsBCA)的作用下合成γ-PGA，γ-PGA在培养过程中可能通过内切酶(解聚酶)的作用发生分解生成低分子量的γ-PGA。

除菌种因素外，培养基的组成、发酵条件如温度、pH、通气量、补料模式等因素对γ-PGA的产量、分子量等方面有很大的影响。

4.1 碳氮源

从表1中可以看出，对于谷氨酸依赖型菌株，L-谷氨酸是培养基中不可缺少的成分，柠檬酸、甘油也是多数培养基中的必需成分。从上面的合成机制可知柠檬酸的重要性在于其参与TCA循环，Cmmwick和Gross［23］用同位素标记法证明柠檬酸确实是 γ-PGA合成的前体;但甘油能使γ-PGA增产的作用机理还不清楚。根据代谢途径推测，葡萄糖也应该可以作为γ-PGA合成的碳源，Ko等人［24］的研究证实了这个推测，他们用葡萄糖作为主要碳源(100 g/L)，并加入少量的柠檬酸和谷氨酸(0.5 g/L)也得到了较高的产量。但这种结果也不是绝对的，Jung等人［25］的研究表明，碳源中如果分别使用果糖、麦芽糖和蔗糖作为碳源也可得到较高产量的γ-PGA。有机氮源的使用除了L-谷氨酸外还可使用蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、酪蛋白水解物等，无机氮源可采用 NH4Cl，(NH4)2SO4等(见表1)。

4.2 无机盐

Mn2+，Mg2+，Fe3+，Ca2+等金属盐离子是 γ-PGA发酵常用的无机盐，它们对菌株活力、γ-PGA的产量、产物分子中D-谷氨酸和L-谷氨酸的构成比例(D/L)以及γ-PGA的分子量有不同程度的影响。Crowwick和Gross［23］曾从不同方面研究了Mn2+对地衣芽胞杆菌9945A产γ-PGA的影响，他们发现，在一定发酵时间内，Mn2+对菌体细胞的生长起促进作用，当超过一定时间菌体细胞活力减小，开始死亡;Mn2+还可促进菌体对碳源的利用:培养基中615μmol/L的Mn2+可使谷氨酸、甘油和柠檬酸的利用率从19%、10%、17%分别提高到37%、54%和93%;γ-PGA的产率在Mn2+浓度为33.8μmol/L时可从5g/L提高到17g/L;当培养基中Mn2+浓度从0提高到615μmol/L时，产物γ-PGA中L-谷氨酸的含量从59%下降到10%;Mn2+的存在还使得在一定发酵时间内，随着产量的增加γ-PGA的分子量却迅速下降。但是金属离子的这种影响因菌株而异。Jung等人［13］对1株Bacillus sp．RKY3的研究表明，Mg2+对γ-PGA的产量在一定浓度范围内有促进作用，而Mn2+则对γ-PGA的产出起负面作用。

4.3 发酵条件的影响

pH、温度、通气和搅拌是影响发酵培养产物生成的重要因素。Crowwick等［25］控制恒定pH值发酵地衣芽胞杆菌9945A，检测了pH分别恒定为5.5，6.5，7.4，8.25几个发酵批次96 h的γ-PGA产量，结果显示pH6.5得到最高产量，柠檬酸的消耗量增加，推测可能与在这个pH下柠檬酸代谢得到加强有关。最适发酵温度因菌株而异，从表1中可以看出大多菌株发酵温度在37℃左右。

搅拌转数和通气量也是影响好气性发酵过程的重要参数。在发酵液固液气三相之间的传质速率影响底物的利用速率和产物的生成速率，而氧的传递速率是最关键的因素。γ-PGA是高分子聚合物，在发酵过程中发酵液的黏度很快升高，从而影响到氧的传递速率。搅拌和通气量是氧传递速率的主要影响因素，所以对搅拌和通气量的控制十分关键。Bajaj等人［20］研究了通气和搅拌对Bacillus licheniformis

NCIM 2324产γ-PGA的影响，结果表明高的通氧量和搅拌速率可促进菌体的生长，但不一定会使γ-PGA产量增加，过高的搅拌速率会导致产量下降，另外，γ-PGA的分子量在搅拌作用下随着搅拌速率的提高而下降，可能是因为搅拌加剧了

γ-PGA大分子的降解。Crowwick和Gross对地衣芽胞杆菌9945A的研究表明溶解氧的提高对菌体生物量和γ-PGA产量均有提高作用，生物量比采用低溶氧发酵提高了2倍，产量提高了3倍多［25］。通入纯氧或高含氧的空气也是改善氧传递效率的方法。

从发酵产生的黏度发酵液中提取γ-PGA的方法有有机溶剂沉淀法、硫酸铜沉淀法和膜分离法，一般采用有机溶剂沉淀法，在离心去菌体后的上清液中加入低浓度的低级醇类(如甲醇、乙醇)，也可以是丙酮，体积为上清液的2～5倍，沉淀得较粗的γ-PGA。然后经过透析、脱盐和冷冻干燥制得纯γ-PGA。

γ-PGA是一种生物可降解的无毒无害的大分子物质，故其在各领域的应用一直受到高度的关注，并取得一定的成果。

6.1 食品和化妆品方面

γ-PGA安全可以食用，可广泛使用在食品和化妆品领域。利用γ-PGA可以增加溶液黏度的性质，可以作为食品增稠剂和稳定剂。在果汁和饮料中，低浓度的γ-PGA可以改善口感。利用γ-PGA的保湿性，在含有面粉的食品如蛋糕、面包、意大利面等中添加γ-PGA可延长老化时间、改善组织结构和保持形状［26］。某些γ-聚谷氨酸盐具有抗冷冻能力，这种抗冷冻能力随着分子量的下降而增加，这个性质可以在食品、菌种以及酶的保存中得到应用。由于聚谷氨酸盐几乎是无味的，因此作为抗冻剂使用它比以往的抗冻剂如蔗糖具有更好的应用性，如可以添加更高的浓度。γ-聚谷氨酸盐的抗冷冻能力因结合的阳离子而异，一般 Mg2+＞Ca2+ ～Na+ ＞K+［27］。γ-聚谷氨酸的钙盐可以添加到防止骨质疏松的保健食品中以增加Ca2+的吸收［28］。

γ-PGA能促进皮肤对水溶性、非水溶性维生素的吸收，并且由于其高吸水性和持水力。对皮肤无刺激性，可作为化妆品用的保湿剂、表皮因子缓释剂、天然美容面膜等。其高效的保湿和润滑性已被日本和韩国用到高档化妆品中。

6.2 医药领域的应用

γ-PGA在自然界或人体内能被生物降解成内源性物质谷氨酸，不易产生积蓄和毒副作用。它的分子链上具有活性较高的侧链羧基，易于和一些药物结合生成稳定的复合物，是一类理想的体内可生物降解医药用高分子材料，γ-PGA可以用来制作外科手术用的粘胶剂、止血剂及密封剂和免拆手术缝合线等。如Otani等［29］将相对分子质量为10 000的明胶和PGA的混合物用WSC交联，形成的所谓的