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乳酸菌素基因PlnE和PlnF在大肠杆菌中的异源表达

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乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达的开题报告

乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达的开题报告

乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶基因的克隆及在大肠
杆菌中的表达的开题报告
本文介绍了乳酸乳球菌α-乙酰乳酸合成酶（Lactobacillus α-acetolactate synthase，ALS）基因的克隆及在大肠杆菌中的表达。

首先通过PCR扩增获得了该基因的完整序列，并将其克隆到表达载体pET28a 中。

随后将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，通过SDS-PAGE和Western blotting验证了目标蛋白的表达。

最后对重组表达蛋白进行纯化，并进行酶活测定。

该研究的目的是为了进一步探究乳酸乳球菌中该基因的功能以及在工业上的应用价值。

ALS是乳酸菌合成乳酸的关键酶，其在发酵过程中发挥重要作用。

目前已有许多关于ALS基因的研究，但大多数集中于乳酸菌中，鲜有在大肠杆菌中表达的报道。

因此本研究的结果可以为ALS基因在其他细菌中的表达和应用提供一定的参考价值。

未来的研究可以结合结构及遗传学信息进一步探究ALS的生物学功能，同时还可以将该基因应用于其他乳酸发酵产物的合成中，如乳酸、丙酮酸等。

乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

乳酸菌胞外蛋白水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达
蛋白水解酶基因扩增与序列测定 以提取的 L.helveticus NL05 DNA 为模板，PCR 扩
增胞外蛋白水解酶基因。0.8% 琼脂糖凝胶电泳如图 1 所 示，在 1350bp 附近有一条单一的扩增带，与预期大小 相符。PCR 产物经纯化试剂盒纯化后与载体 pMD18-Tsimple 连接、转化，最后进行质粒小量提取。经电泳 选取其中滞后的质粒进行 Sac Ⅰ、Kpn Ⅰ酶切鉴定，琼 脂糖凝胶电泳结果见图 2。
1.4.4 SDS-PAGE分析 将各个时间诱导收获的菌液菌培养至 OD600nm 为 0.7。
取菌液 1.5mL，4℃离心收集菌体，用生理盐水洗涤两 次，在沉淀菌体中加入 100μL 0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)， 重悬细菌沉淀。加入 100μL 2 × SDS 上样缓冲液，100℃ 煮沸 10min，4℃冷却。取上清 15μL 进行 15% SDS-PAGE 电泳[ 1 6 ] 。
理特征、作用机理、提取及合成方法等进行了广泛的 研究。研究表明，除从天然物质中分离提取以外，还 可以利用蛋白酶水解食品蛋白获得。Oshima 等[3]首次通 过蛋白酶水解食品蛋白中获得 ACEIP。随后在几乎所有 的食品蛋白的单一蛋白酶或多种蛋白酶联合水解物中获 得多种 ACE 抑制肽[4-8]，但该方法具有条件苛刻、设备 要求精良、产量低以及副反应多等缺点，因此难以推 广生产。目前除了蛋白酶水解法以外，微生物发酵法 (特别是乳酸菌发酵法)成为获得 ACEIP 的常用方法，并 显示出良好的开发潜力及应用前景。
Cloning of Extracellular Protease Gene from Lactobacillus and Expression in Escherichia coli

乳酸菌素Gassericin T基因的合成及其在大肠杆菌中的融合表达

乳酸菌素Gassericin T基因的合成及其在大肠杆菌中的融合表达
叠 Ｐ Ｃ Ｒ法扩增得到 ｇ ａ ｔ Ａ片段（ 倒 基 因） ； 将合 成的 基 因插 入 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ 一 ４ Ｔ 一 １ ， 构建 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ 一 ４ Ｔ 一 １ 一 ｇ ａ ｔ 融合表达载体 ， 转化 大
肠 杆菌 Ｄ Ｈ ５ ａ株 ， Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ诱 导表 达 ， 经 超 声 裂 解 后 获 得 包 涵体 蛋 白， 经 溶解、 变 性、 复 性处 理 后 获 得 Ｇ Ｓ Ｔ － Ｇ ａ ｓ ｓ ｅ ｒ ｉ ｃ ｉ ｎ Ｔ 融合 蛋 白； 用琼脂扩散法测定其对金黄色葡萄球菌 、 大肠杆菌、 李 斯特 菌 、 枯 草 杆 菌 等 的抗 菌 活性 。结 果 与 结 论 ： 采用ｐ Ｇ Ｅ ｘ 一 ４ Ｔ 一 １ 融 合表 达 系统 在 大 肠 杆 菌 中表 达 了有 活 性 的 Ｇ ａ ｓ ｓ ｅ ｒ ｉ ｃ ｉ ｎ Ｔ ， 融 合 蛋 白以包 涵 体 形 式存 在 。 复 性 的 融合 蛋 白对 金 黄 色 葡 萄 球 菌
ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ｍｏ ｄ ｉ ｉ ｆ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｏ ｉ ｒ ｇ ｉ ｎ ａ ｌ ｓ ｅ ｑ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｏ ｐ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｃ ｏ ｄ ｏ ｎ ｕ ｓ ａ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｎ ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ｐ ＧＥ Ｘ Ｔ 一１ ．Ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ｓ ｃ ａ ｒ ｒ ｙ ｉ ｎ ｇ ｐ ＧＥ Ｘ一 ４ Ｔ 一１ 一 ｇ ａ ｔ ｗａ ｓ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｉ Ｐ ＴＧ． Ｔ ｈ ｅ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｉ ｒ ａ ｗｅ ｒ ｅ ｂ ｍｋ ｅ ｎ ｄ ｏ ｗｎ ｂ ｙ ｕ ｌ ｔ ｒ ａ ｓ ｏ ｎ ｉ ｃ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｉ ｎ ｃ ｌ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ｂ ｏ ｄ ｉ ｅ ｓ

实验七 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

实验七 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
1 细菌的裂解： 常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法； ④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方 法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究 中应用较为广泛。 下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。
1、酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳 多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。 主要步骤为： ① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。弃 上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。 ② 每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，搅拌20 min ；边搅拌边每克菌加4 mg 脱 氧胆酸（在冷室中进行）。 ③ 37 ℃ ，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20μL DNase I。室温放置至溶液不 再粘稠。 2、超声破碎法。声频为15-20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎， 在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA 进行剪切 ，大大降低液体的粘稠度。 ① 收集1 L 诱导表达的工程菌，40 ℃ ，5000r pm 离心，15 min ；弃上清，约每 克湿菌加3 mLTE 缓冲液。 ② 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10 000g 离心，15min ，分别收集 上清液和沉淀。 ③ 分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2× 凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS PAGE 。 注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关， 应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。
实验七 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

乳酸乳球菌表达系统的研究进展_王永刚

乳酸乳球菌表达系统的研究进展_王永刚
在医药卫生领域乳酸乳球菌主要作为疫苗递呈的 活载体表达目的蛋白 。 李鹏成等人 以 ［15］ 乳酸乳球菌肽 聚 糖 锚 钩 蛋 白 （Protein anchor， PA） 为 研 究 对 象 ， 构 建 原 核 表 达 载 体 并 进 行 表 达 ， 获 得 PA 融 合 蛋 白 ， 为 该蛋白多克隆抗体制备及与目的抗原的融合表达等相 关研究奠定了基础。 龚芳红等人 成 ［16］ 功构建了表达 H. pylori HspA 的 重 组 乳 酸 乳 球 菌 MG1363， 为 进 一 步 口 服疫苗的相关研究奠定了基础 。 李轶 杰等人 对 ［17］ 基因 修饰乳酸乳球菌作为药物发送载体系统治疗黑色素 瘤进行了初步探索， 发现静脉发送携带治疗性分子 的乳酸乳球菌能靶向实体肿瘤组织定殖并抑制肿瘤 的生长。
图 1 NICE 系统蛋白表达示意图
2 乳酸乳球菌表达系统的应用
乳酸乳球菌是肠道内的常见菌种， 其作为一种食 品级的安全微生物已越来越受到科研工作者的青睐。 目前对乳酸乳球菌应用最多的是食品工业和医药行 业。 2.1 L. lactis 表达系统应用于食品工业
目前， 构建乳酸菌乳球菌食品级载体-受体系统， 寻找一些在乳酸乳球菌中的克隆和表达中有价值的基 因已成为乳酸菌分子遗传学研究的趋势并在食品研究 和生产领域具有重大意义。 乳酸菌食品级高效表达系 统 （NICE） 是 现 阶 段 应 用 最 广 的 高 效 诱 导 表 达 系 统 ， 由 于 NICE 系 统 的 诱 导 剂 、 宿 主 菌 和 载 体 都 是 安 全 的 食品级的， 其应用前景相当广阔。 如若在该系统中加 入诱导物乳链菌肽后诱导率可达 1 000 倍以上 。 ［12-13］ 因 此， 在可控蛋白的生产中该系统是首选表达系统， 同 时在生产表达时该系统具有良好的安全性， 所以可用

细菌漆酶LacA在大肠杆菌中的异源表达.

细菌漆酶LacA在大肠杆菌中的异源表达.
组员（按学号排序如下）：
刘艳红、王瑞、姚伟静、张明珠、康兴、程飞、 孙元元、刘燕红、程旭、査倩、潘伟民、傅声祥 汇报人：程飞
实验简介
实验过程
实验原理
实验材料
实验目的
一、实验简介
漆酶（Laccase）是一种含酮的多酚氧化酶，能够催化多种酚类和 非酚类化合物发生氧化，同时伴随由分子氧还原成水。
漆酶一般由500-600个氨基酸组成，不同来源的漆酶氨基酸序列的 相似程度较低，但是其催化位点序列相当保守。对漆酶的晶体结 构进行研究，发现其分子具有3个铜离子结合位点，共结合四个铜 离子。 野生漆酶的产量低，重组表达是提高漆酶产量的一种常用方法。 本实施主要通过由保守区设计简并引物扩增部分漆酶LacA片段， 以及反向PCR扩增已知序列临近的未知序列，并且通过序列拼接获 得完整的LacA基因序列，并转化大肠杆菌，进行异源高效表达。
二、实验目的
1. 获得细菌LacA基因 。 2. LacA在大肠杆菌中异源表达。
三、实验原理
1. 2. 3. 4. DNA重组。 简并引物。 酶。 TA克隆：将3´端具有单个“A”突出末端的PCR产物克隆到3´端具有单个“T”突出末端 的载体的克隆法。 5. 反向PCR: 反向PCR是一种新型的基因扩增方法，它能扩增一段已知序列旁侧的DNA。 6. 载体选择。 7. 蓝白筛选： 质粒载体含有大肠杆菌β -半乳糖苷酶基因（lacz）的启动子（受IPTG诱导）及其 编码α 肽链（β -半乳糖苷酶的氨基末端短片段）的DNA序列（特称为lacz基因）。受体大 肠杆菌细胞的β -半乳糖苷酶发生了突变，失去的氨基末端。当lacz基因编码的α 肽链同 失去了正常氨基末端的β -半乳糖苷酶突变体互补时，便会产生出有活性的β -半乳糖苷酶 分子，在IPTG诱导下，会启动表达，分解X-gal产生蓝色背景。当MCS中插入外源基因后， 会阻断α 肽链合成，不能形成互补，不能产生功能活性的β -半乳糖苷酶，也就不会产生 蓝色背景。所以含有重组质粒载体的克隆是白色的。

乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达


表 1 合成的引物序列及限制性酶切位点
Primer PA1 P2 PV1 PV2 PO1 PO2 PO3 PO4
Table 1 Primer sequence and size
Sequence (5′→3′)
Enzyme site
GCCTCTAGAATTAAATTCTGAAGTTTGTTAGATACAAT
47 卷 4 期 2007 年 8 月 4 日
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica
47 (4) : 604～609 4 August 2007
乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达
徐 波1 ,曹郁生1 3 ,陈 燕1 ,郭兴华1 ,2
(1食品科学教育部重点实验室 南昌大学中德联合研究院 南昌 330047) (2中国科学院微生物研究所 北京 100080)
Xba Ⅰ
TAATCTAGAGCTAGCTTGATTGTTCTATCGAAAGCGAAATCA Nhe Ⅰ
AGCCATGGAACCGAACTTAATGGGAGG
Nco Ⅰ
GAAGCTAGCCGCAAAAAGGCCATCCGTCAGGA
Nhe Ⅰ
ATCGCCATGGGTTGTCATCGGCTCGCTGGTTGC
当aaga基因克隆到其他不能发表达原理以载体praf800pnz8048和pve5524prna48和细胞壁锚定诱导表达载体prnv48用于prnv48均为e型复制的翻译融合型载体分别含有的工作中构建了铜绿假单胞菌oprfoprh的融合外合基因克隆入prna48和prnv48中对诱导方法当l1actisnz9000prna48oprfh和l1actisnz9000prnv48oprfh培养至对数期时分别加入10ngml和1ngml诱导剂nisin使细菌的生长与的代谢负荷位于nisa启动子下游的oprfh基因被激活转录表达出所需的oprfh融合蛋白

干酪乳杆菌胞外多糖基因簇的调控基因在大肠杆菌中异源表达

１ （ 上 海 理 工 大 学 医疗 器 械 与食 品 学 院 ， 上 海 食 品微 生 物 工 程 研 究 中心 ， 上海 ， ２ ０ ０ ０ ９ ３ ） ２ （ 扬州市扬大康源乳业 有限公司 ， 江苏 扬 州 ， ２ ２ ５ ０ ０ ４ ）
摘 要 为 研 究 干 酪 乳 杆 菌 胞 外 多糖 的 生 物 合 成 和 转 录 调 控 ， 对 其 生 物 合 成 基 因 簇 中假 定 的 转 录 调 控 因 子
ＬＣ２Ｗ 并在 大肠 杆 菌 （ Ｅ ｓ ｃ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｉ ） 中异 源 表 达 。 首先 ， 利用 Ｐ Ｃ Ｒ技 术 从 于 酪 乳 杆 菌 Ｌ Ｃ ２ Ｗ 中
扩 增 出 目的 基 因 Ｌ Ｃ ２ Ｗ ＿ ２ １ ７ ０ ， 将 其 插 入 到 大肠 杆 菌 表 达 载 体 ｐ Ｅ Ｔ ２ ４ ａ和 ｐ Ｅ Ｔ ３ ０ ａ中 ， 构建 出 Ｌ Ｃ ２ Ｗ＿ ２ ｊ ７ ０ Ｎ端或 ｃ 端 和 Ｎ端均含有 Ｈ ｉ ｓ 蛋 白标 签 的重 组 质 粒 。含 上 述 质 粒 的 Ｅ ｃ ｏ ｌ ｉ 经 异 丙 基 硫 代 半 乳糖 苷 （ Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ） 诱导后 ， 通 过 聚 丙 烯酰 胺 凝 胶 电泳 （ Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ） 分析并 未发 现 Ｌ Ｃ ２ Ｗ一 ２ １ ７ ０蛋 白可 溶 性 表 达 。 对 Ｌ Ｃ ２ Ｗ一 ２ １ ７ ０氨 基 酸 序 列 利 用 Ｐ ｈ ｏ ｂ ｉ ｕ ｓ 服 务器 分 析 ， 发 现该 蛋 白 Ｎ端 存 在 跨 膜 区（ 前２ ７个 氨基 酸 为 跨膜 序 列 ） 。 切 除此 跨 膜 区域 重 新 构建 重 组 表达质 粒后， 在 层ｃ ｏ ｌ ｉ 中成 功 实现 Ｌ Ｃ ２ Ｗ＿ ２ １ ７ ０蛋 白可 溶 性 表 达 。 研 究为 进 一 步纯 化 该 转 录 调 控 因子 ， 并 研 究 其 功 能和 对胞 外 多糖 生 物 合 成 基 因簇 的 转 录调 控 机 制 奠 定 了基 础 。 关 键 词 干 酪 乳 杆 菌 ； 胞 外多糖 ； 转 录调 控 因 子 ； 异源表达 ； 大 肠 杆 菌

乳酸杆菌基因表达系统的研究进展

乳酸杆菌基因表达系统的研究进展徐义刚1,2,崔丽春1(1.东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040; 2.东北农业大学动物医学院,黑龙江哈尔滨150030)摘要乳酸杆菌是人及动物肠道中重要的益生菌,被公认为安全级(generall y recognized as safe,GRA S)微生物。

乳酸杆菌表达系统是近几年发展起来的一种表达系统,随着乳酸杆菌分子生物学的发展、各类表达调控元件的分离,相继发展了乳酸杆菌的克隆载体、表达载体和整合载体。

乳酸杆菌具有免疫佐剂、吸附黏膜、抗胆汁酸能力,以乳酸杆菌为载体,作为外源基因的传递和表达系统,研制口服疫苗,刺激黏膜免疫系统产生有效的免疫应答,具有重要开发前景。

关键词乳酸杆菌;外源基因;表达系统中图分类号Q939.11+7文献标识码A文章编号1005-7021(2007)03-0087-05Progress on G ene E xpressi on Syste m of Lact obacill usXU Y-i gang1,2,C U I L-i chun1(1.N ort h e a stF orest ry Univ.H arbin150040;2.C oll.of Veteri nary M e d.N ort h e a st Agric.Un i v.H arbi n150030)A bstrac t Lactobacill us is a k i nd o f i m portant prob i o ti c i n gastro-i ntesti nal tracts o f hu m an and most an i m a l s,and t hey are conside red to be safe bacter i a w it h a GRA S(generall y regarded as safe)status.T he express i on syste m s o f Lactobacillus is a k i nd of expression sy stem tha t have been deve l oped i n recent yea rs,and as t he deve l op m en t of mo-lecu l ar b i o l ogy o f Lactobacillus,and the sepa ration o f var i ous expressi on regu l a t o ry ele m ents,t he c l on i ng vector,the expressi on vector,and the i ntegrati on v ector have been deve loped one a fter ano t ctobacillus possesses many properties such as i m mune ad j uvant,adsorpti on mucosa,ant-i b ile ac i d capab ili ty;take Lactobacillus as a vector trans-fero r and expressi on syste m s o f exogenous gene to study ora l vacc i ne,sti m u l ate mucosa i m m une syste m to produce e-f fecti ve i m mune responses,a ll o f these possess i m portant deve l op m ent prospect.K eywords Lact obacillus;exogenous gene;expressi on syste m乳酸菌(Lactic ac i d bacteria,LAB)是人及动物肠道中极为重要的益生菌群之一,该菌为兼性厌氧的革兰氏阳性菌,是乳品工业发酵的重要菌类,是在食品、医药工程领域具有重要应用前景的食品级微生物,包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属。

乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达

乳酸乳球菌食品级诱导表达系统的构建及异源蛋白的表达徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2007(47)4【摘要】以α-aga基因为食品级选择标记构建了乳酸乳球菌食品级高效诱导细胞内和细胞壁锚定表达系统,并用这一表达系统表达了铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因OprF/H.首先以pRAF800和pNZ8048构建了含有α-aga、PnisA-MCS-pepN和θ复制子的乳酸乳球菌食品级细胞内诱导表达载体pRNA48,再以pRNA48和pVE5524为出发载体构建了含有α-aga、PnisA-SPUsp45-nucA-CWAM6-t1t2和θ复制子的乳酸乳球菌细胞壁锚定诱导表达载体pRNV48.然后以食品级载体pRNA48和pRNV48为基础,构建了不含抗生素抗性选择标记的铜绿假单胞菌融合外膜蛋白基因的表达质粒pRNA48-OprF/H和pRNV48-OprF/H.利用nisin进行重组乳酸乳球菌菌株的诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot 分析,检测到表达蛋白分别占细胞内可溶蛋白的9.6%和细胞壁锚定蛋白的9.8%,表达产物具有免疫原性,可与含OprF/H的乳球菌以及铜绿假单胞菌发生特异性的凝集反应.【总页数】6页(P604-609)【作者】徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华【作者单位】食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;食品科学教育部重点实验室,南昌大学中德联合研究院,南昌,330047;中国科学院微生物研究所,北京,100080【正文语种】中文【中图分类】Q786;Q93【相关文献】1.乳酸乳球菌NICE系统食品级分泌表达载体pRNV48的构建及铜绿假单胞菌融合外膜蛋白的表达 [J], 徐波;曹郁生;陈燕;郭兴华2.多角体包埋异源蛋白杆状病毒表达系统的构建 [J], 郭建军;袁林;曾静;魏国汶;杨一兵3.乳酸乳球菌食品级分泌性表达载体pSQZ的构建及报告蛋白的表达 [J], 孙强正;熊衍文;叶长芸;徐建国4.食品级分泌表达载体的构建及报告蛋白在乳酸乳球菌中的表达 [J], 孙强正;熊衍文;叶长芸;徐建国5.重组植物甜蛋白马宾灵的食品级乳酸乳球菌诱导表达系统的构建 [J], 顾文亮;夏启玉;姚晶;胡新文;符少萍;郭建春因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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乳酸菌素基因PlnE和PlnF在大肠杆菌中的异源表达杨芳,余占桥,张日俊(中国农业大学饲料生物技术实验室,动物营养学国家重点实验室,北京 100193)摘要:为获得高产量纯品植物乳杆菌素PlnE和PlnF,研究其开发生物兽药的可能,试验通过人工合成植物乳杆菌素基因PlnE和P lnF,构建表达载体pG EX 4T E和pGEX 4T F,经IPT G诱导表达条件优化后,进行亲和层析纯化融合表达蛋白,并使用SDS PA GE进行鉴定。

试验结果表明,pGEX 4T E和pGEX 4T F构建成功,纯化后获得2种产量高达30%的纯品融合蛋白,SDS PA G E鉴定两融合蛋白表达正确。

说明PlnE和P lnF基因片段编码的多肽能在原核细胞中正确表达,为进一步研究该细菌素的生物活性奠定了基础。

关键词:植物乳酸杆菌;细菌素;原核表达;融合蛋白中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:1671 7236(2010)12 0055 05细菌素是由某些细菌通过基因编码、核糖体途径合成的一类具有抗菌活性的多肽、蛋白质及其衍生物,产生菌对其细菌素具有自身免疫性(Ander s son等,1998;Riley等,2002;T orkar等,2003;Car o lissen M ackay等,1997)。

由于细菌素与抗生素相比无抗药性和残留性,目前国内外对细菌素的研究多数集中在开发替代抗生素治疗使用的生物保健剂和兽药上。

NCBI数据库中确定基因和蛋白质序列的细菌素有数百种,然而仅有一种羊毛硫细菌素Nisin用于食品防腐,绝大多数处于试验阶段,究其原因主要是产细菌素的野生菌株产量低,分离纯化困难,距离产业化生产还有很长距离。

研究结果发现,细菌素异源表达对象多为 a类单肽链非修饰细菌素,最终获得的产物活性产量差异较大(余占桥等,2009)。

低水平异源表达的主要原因是直接表达的细菌素肽链对宿主细胞具有毒害作用,抑制其生长。

若使用 b类双肽链非修饰细菌素(即双肽链共同存在才有抑菌效果的细菌素)进行异源表达,则不存在此问题。

作为自然界中来源广泛、国外使用最多的益生菌乳酸菌,其产生的 b类双肽链非修饰细菌素研究相对较少。

目前发现多数植物乳酸杆收稿日期:2010 04 29作者简介:杨芳(1985-),女,湖北人,硕士生,研究方向:微生物基因工程。

通信作者:张日俊,男,博士生导师,研究方向:饲料生物技术。

基金项目:国家自然科学基金高产广谱细菌素工程菌的构建表达和特性研究!(30972124);国家高技术研究发展计划(863计划)重大项目生物兽药新产品研究与创制!(2006AA10A208)。

菌都产生多种双肽链细菌素,如L.p lantarum J23、L.p lantar um N C8、L.p lantarum J51、L.p lanta r um WCF S1、L.p lantarum C11,这5株植物乳酸杆菌表达的细菌素中,PlnE和PlnF是活性最强、序列最保守的1对,其他几种细菌素均有序列差异。

PlnE和PlnF分别有33和34个氨基酸,当各自以相等数量互补时在纳摩尔浓度即表现出最佳抑菌活性,比各自单独时高1000倍以上,互补肽链的相互作用非常特异,与其他种细菌素互补均不能达到此效果(Erlend等,1998)。

本试验对异源表达 b类双肽链非修饰乳酸杆菌细菌素PlnE和PlnF进行了分离,并构建了原核表达载体,为进一步研究该细菌素的生物活性及探索生产绿色生物兽药奠定了基础。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株和载体 宿主菌E.coli DH5 和表达菌株BL21(DE3)购自T IAN GEN公司;表达载体pGEX 4T 1质粒由中国农业大学饲料生物技术实验室保存。

1.1.2 试剂 质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自T IA NGEN公司;DNA聚合酶、T4DNA连接酶及限制性核酸内切酶Bam H∀、Sal∀均购自TaKa Ra公司;Glutathione Sepharose4B纯化介质购自GE H ealthcare公司。

引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2 方法1.2.1 基因片段设计与合成 根据NCBI中报道的PlnE和P lnF基因片段,使用软件优化,选择Bam H∀、Sal∀作为基因片段的5∃端和3∃端内切酶位点,在质粒本身携带的GST(谷胱甘肽 S 转移酶)纯化标签后加入一组6个组氨酸的H is tag,增加一种纯化方法;由于pGEX 4T 1质粒携带的凝血酶蛋白位点在切割GST融合蛋白后保留有多余的Gly和Ser,可能会影响细菌素的抗菌作用,故在细菌素结构基因前加入肠激酶位点,蛋白表达后完全切除融合蛋白,得到纯的细菌素PlnE、PlnF。

PlnE (33个氨基酸):FNRGGYNFGKSVRH VVDAIGS VA GIRGILKSIR;PlnF(34个氨基酸):V FH AY SARGVRNNYKSAV GPADWVISAVRGFIH G。

合成基因的碱基序列为:PlnE(160bp):CGC(保护碱基)GGATCC(B am H∀酶切位点)CAT CA T CAT CATCAT CAT(H is tag)GGT ACCGAT GA T GAT GA TAAA(EK位点)TT TAA CCGTGGCG GCTA TAACT TT GGCAAAAGCGT GCGTCAT G TGGTGGA TGCGAT TGGCA GCGTGGCGGGCA TT CGT GGCAT TCT GAAAAGCATT CGTT AAG TCT AC(Sal∀酶切位点)GTCG(保护碱基);PlnF (163bp):CGC(保护碱基)GGATCC(B am H∀酶切位点)CAT CA TCAT CAT CATCAT(H is tag) GGTA CCGAT GAT GA TGATAAA(EK位点)GT GTT TCATGCGTATAGCGCGCGTGGCGTGCGTAA CAACTATAAAAGCGCGGTGGGCCCGGCGGATTG GGTGATTAGCGCGGTGCGTGGCT TTATTCATGG CT AAGTCGAC(Sal∀酶切位点)GT CG(保护碱基)。

1.2.2 引物设计及PCR扩增 PlnE引物:P15∃ CGCGGA TCCC ATC ATC 3∃,P25∃ CGACGTCGACTTA ACGAA TGCTTTTCAGAA TG 3∃;PlnF引物:P35∃ CGCGGA TCCC ATC ATCA TCA TCA TCA TGG 3∃,P45∃ CGACGTCGACTTAGCC ATGAATAAAGCCACGC ACC GC 3∃。

扩增模板为含有合成基因序列的PCR2.1 TO PO E、PCR2.1 T OPO F质粒(上海英骏生物技术有限公司提供)。

扩增程序为:95%预变性5m in; 95%变性1min,58%退火30s,72%延伸30s,30个循环;72%延伸10m in。

PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳,检测纯度和大小。

1.2.3 原核表达载体的构建 PCR扩增获得的PlnE和PlnF片段与pGEX 4T 1质粒分别进行Bam H∀、Sal∀双酶切,产物纯化回收在T4DNA 连接酶的作用下16%连接10h,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,涂布于氨苄抗性琼脂平板上,37%培养过夜,选择阳性克隆进行菌落PCR鉴定,抽提质粒后进一步用B am H∀、S al∀双酶切鉴定,阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.4 融合蛋白表达条件的优化 将2个正确的阳性BL21(DE3)表达菌株和含空白质粒pGEX 4T 1的BL21(DE3)菌株分别接种于3mL含50 g/mL氨苄青霉素的LB培养基中,37%,150r/ m in振荡过夜培养。

将活化菌液以0.5%比例接种至培养基,在不同培养温度(25、30、37%)、不同IPT G诱导浓度(0.1、0.3、0.5、0.7mm ol/L)及不同表达时间(1~8h)条件下诱导表达,4%离心收集菌体,超声波破碎后进行SDS PAGE电泳。

1.2.5 融合蛋白的亲和纯化 将含有正确重组质粒的表达菌进行诱导表达后,离心收集菌体。

用PBS缓冲液按1&20的比例重悬菌体后超声波处理,300W,超声4s,间歇6s,60个循环。

4%条件下,10000r/min离心20min,取上清液重复离心1次,上清液经0.45 m过滤器滤过备用。

将10mL Glutathio ne Sepharose4B纯化介质装柱,使用10倍柱体积的PBS流洗,3倍柱体积PBS平衡柱体,样品上清液用PBS稀释一定倍数后过柱,使用10倍柱体积PBS洗柱,最后用5倍柱体积的10m mol/L谷胱甘肽(50mm ol/L T ris H Cl溶解)洗脱目标融合蛋白。

洗脱出的溶液进行SDS PAGE电泳分析。

2 结果与分析2.1 原核表达质粒的鉴定 PCR产物和质粒的酶切产物进行连接并转化E.coli BL21(DE3)细菌后,获得阳性克隆并提取质粒。

重组的质粒经Bam H∀、S al∀酶切后得到大小约为4.9kb和160bp电泳条带,均与pGEX 4T 1和目的基因片段预期值相符,表明PlnE和PlnF基因均已正确插入到表达质粒中。

测序结果表明基因合成正确(图1、2)。

2.2 目的融合蛋白表达条件的优化2.2.1 目的融合蛋白在不同IPTG浓度和温度条件下的表达 将含阳性表达载体的E.coli BL21 (DE3)进行IPT G诱导表达,菌液破裂后取全细胞蛋白质样品进行SDS PAGE电泳,可见目标融合蛋白为30ku,在其条带下方有GST蛋白26ku。

pGEX 4T E、pGEX 4T F表达菌株最佳表达温度均为30%,最佳IPTG浓度为0.5mmo l/L。

两者受不同IPT G浓度和温度影响变化趋势相同,同一温度下,随IPT G浓度增高,目的融合蛋白会有所增高,但非线性变化(图3、4)。

2.2.2 目的融合蛋白不同诱导时长的表达 在30%、IPTG浓度为0.5mm ol/L条件下,pGEX 4T E、pGEX 4T F表达菌株分别在6、7h后达到平稳,在此之前目的融合蛋白的表达与时长呈正相关(图5、6)。

通过Tanon2500软件评估SDS PAGE 电泳每条蛋白带的密度,确定目的融合蛋白最高可占全细胞蛋白的30%。

2.3 目的融合蛋白的纯化 经超声波破碎后的可溶性蛋白质样品液经谷胱甘肽亲和层析纯化后进行SDS PAGE电泳,蛋白凝胶染料显色(灵敏度20ng),得到呈2条带的蛋白质,较大蛋白质为30ku的目的融合蛋白,较小的蛋白质为26ku的GST蛋白,说明目的蛋白得到较好纯化(图7)。