片仔癀对局灶性脑梗死大鼠BDNF和IL-6蛋白表达的影响

高,因而黄芪甲苷对调节缺血再灌注损伤诱导的细胞自噬具有调节作用㊂综上所述,本研究以大鼠心肌缺血再灌注模型,证明黄芪甲苷可以减少缺血损伤的心肌面积,其机制与调节自噬相关基因Beclin1的表达有关㊂参考文献:[1]Ohsumi Y.Historical landmarks of autophagy research[J].CellRes,2014,24(1):923.[2]Marino G,Niso Santano M,Baehrecke EH,et al.Self con-sumption:The interplay of autophagy and apoptosis[J].Nat RevMol Cell Biol,2014,15(2):8194.[3]McIlwain DR,Berger T,Mak TW.Caspase functions in celldeath and disease[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2013,5(4):a008656.[4]Murrow L,Debnath J.Autophagy as a stress response andquality control mechanism:Implications for cell injury and hu-man disease[J].Annu Rev Pathol,2013,8(8):105137.[5]Deretic V,Saitoh T,Akira S.Autophagy in infection,inflammationand immunity[J].Nat Rev Immunol,2013(13):722737. [6]Cheng J,Fujita A,Yamamoto H,et al.Yeast and mammalianautophagosomes exhibit distinct phosphatidylinositol3phos-phate asymmetries[J].Nat Commun,2014,5:3207. [7]Russell RC,Yuan HX,Guan KL.Autophagy regulation by nutri-ent signaling[J].Cell Res,2014,24(1):4257.[8]Sun K,Xie X,Liu Y,et al.Autophagy lessens ischemic liver in-jury by reducing oxidative damage[J].Cell Biosci,2013,3(1):26.[9]Xu HD,Wu D,Gu JH,et al.The pro survival role of autophagydepends on Bcl2under nutrition stress conditions[J].PLoSOne,2013,8(5):e63232.[10]Han Z,Cao J,Song D,et al.Autophagy is involved in the car-dioprotection effect of remote limb ischemic postconditioning onmyocardial ischemia/reperfusion injury in normal mice,but notdiabetic mice[J].PLoS One,2014,9(1):e86838.(收稿日期:20150109)(本文编辑郭怀印)片仔癀对局灶性脑梗死大鼠BDNF和IL6蛋白表达的影响孟佳1,2,黄希艳2,李倩2,朱陵群2摘要:目的观察片仔癀对局灶性脑梗死大鼠模型脑源性神经营养因子(BDNF)和白细胞介素6(IL6)蛋白表达的影响㊂方法采用改良的Longa法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,SD大鼠随机分为7组:假手术组㊁模型组㊁脑得生组㊁尼莫地平组及片仔癀大㊁中㊁小剂量组㊂通过免疫组化方法检测脑组织BDNF和IL6的蛋白表达,HE染色观察脑组织的病理损伤情况㊂结果在梗死中心区,模型组的BDNF和IL6蛋白表达显著低于假手术组(P<0.01),片仔癀各剂量组的BDNF和IL6蛋白表达均高于模型组(P<0.05或P<0.01);在梗死周围区,模型组BDNF和IL6蛋白表达均较假手术组显著升高,片仔癀各剂量组BDNF的蛋白表达均高于模型组(P<0.01),而IL6蛋白表达均低于模型组(P<0.05)㊂片仔癀大㊁中剂量组的脑组织病理形态较模型组有明显改善㊂结论片仔癀可以上调局灶性脑梗死后大鼠BDNF的蛋白表达水平和下调IL6蛋白表达,减轻脑缺血导致的神经功能损伤㊂关键词:脑梗死;片仔癀;大脑中动脉栓塞;脑源性神经营养因子中图分类号:R743R285.5文献标识码:A d o i:10.3969/j.issn.16721349.2015.06.017文章编号:16721349(2015)06075404Effects of Pien Tze Huang on the Expression of BDNF and IL6Protein in Rats with Focal Cerebral InfarctionMeng Jia,Huang Xiyan,Li Qian,Zhu LingqunThe First Clinical Medical College,Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing100700,ChinaCorresponding Author:Zhu LingqunAbstract:Objective To observe the effect of Pien Tze Huang(PTH)on expression of brain derived neurotrophic factor(BDNF) and interleukin6(IL6)protein in rats with focal cerebral infarction model.Methods The middle cerebral artery occlusion(MCAO) was established by the modified Longa method.Sprague Dawley(SD)rats were randomly divided into sham operation group,model group,high,medium and low dose PTH group,Naodesheng(NDS)group and nimodipine group.Pathological damage were observed by HE staining.Results In the central area of infarction,the expression of BDNF and IL6protein in model group were significantly lower than that in sham operation group.The expression of BDNF and IL6protein in Pien Tze Huang group were higher than those in the model group.In the area around the infarction,expression of BDNF and IL6protein in model group were significantly higher than those in the sham operation group,BDNF protein expression in PTH group were higher than those in the model group while the expression of IL6protein was lower than that in model pared with model group,high and medium dose PTH groups had significant improvement on pathologial changes in brain tissue.Conclusion PTH can up regulated expression of BDNF protein and down regulation expression of IL6protein after focal cerebral infarction,alleviate nerve function injury caused by cerebral ischemia. Key words:cerebral infarction;Pien Tze Huang;middle cerebral artery occlusion;brain derived neurotrophic factor基金项目:国家 重大新药创制 科技重大专项课题(No.2008ZX09202)作者单位:1.北京中医药大学第一临床医学院(北京100700);2.北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室和北京市重点实验室通讯作者:朱陵群,E mail:lingqunzh@脑血管病是目前发病率㊁致残率和病死率均较高的严重疾病之一,缺血性脑血管病在脑血管病的发病中占60%~80%[13]㊂因此很有必要探讨其发病机制及药物保护问题㊂片仔癀由三七㊁天然麝香㊁天然牛黄㊁蛇胆等天然药材组成,具有清热解毒㊁凉血化瘀㊁消肿止痛的显著功效[3,4]㊂我们前期的研究表明,片仔癀对脑梗死的缺血性神经损伤具有保护作用[1,2],但在脑梗死后对脑源性神经营养因子(BDNF)和白细胞介素6(IL6)作用的相关研究较少㊂本研究为了进一步研究片仔癀对脑梗死后的脑保护作用,探讨其恢复机制,建立大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlu-sion,MCAO)大鼠模型,并给予片仔癀进行干预,观察BDNF和IL6变化,为临床治疗提供理论及实践基础㊂1材料与方法1.1实验动物与药物SPF级SD雄性大鼠,体重260gʃ20g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证编号:SCXK(京)20060009㊂片仔癀胶囊(漳州片仔癀药业股份有限公司提供,批号: 0711050);脑得生购自广东国医堂制药股份有限公司(批号:110101);尼莫地平片购自拜耳医药保健有限公司(批号:113275);兔抗大鼠BDNF和IL6抗体购自武汉博士德生物有限公司和北京博奥森生物技术有限公司(批号:BA0565㊁bs0782R);尼龙栓线购自北京沙东生物技术有限公司(型号2636),线身直径0.26 mm,栓头直径0.36mmʃ0.02mm,线身长40mm㊂1.2MCAO模型制备按照已报道的改良Longa方法[3,4]制备模型:SD大鼠随机分为手术组和非手术组(假手术组),术前禁食12h,腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉(1mL/100g),颈正中切开皮肤,钝性分离肌群后暴露右侧颈总动脉㊁颈内动脉及颈外动脉,结扎颈外动脉及颈总动脉的近心端,在颈总动脉远心端剪一小口,将尼龙线栓从此小口插入颈内动脉,感觉阻力时立即停止进线,插入18mm~22mm,固定栓线和缝合皮肤㊂假手术组只行颈部正中切开和缝合㊂大鼠清醒后参照Longa方法对其神经功能进行评分[3,4]㊂1.3动物分组及给药方法给药剂量按大鼠与人的体表面积等效剂量折算,手术组根据术后Longa评分将纳入大鼠随机分为模型组,片仔癀大㊁中㊁小剂量组(486mg/kg㊁162mg/kg㊁54mg/kg),脑得生组(486 mg/kg),尼莫地平组(10.8mg/kg)㊂造模前3d开始给药,造模后第7天取材㊂假手术组和模型组分别灌胃给予等体积的生理盐水,各组均每日给药1次,药物现用现配㊂1.4取材及样品制备神经功能评分后,各组大鼠3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉,迅速断头取脑,冰上视交叉后2mm处取大鼠脑组织置于10%的甲醛溶液中固定24h,常规梯度酒精脱水㊁浸蜡包埋,冠状连续切片㊂部分切片常规HE染色,部分切片用于免疫组化染色㊂1.5免疫组织化学染色石蜡切片常规脱蜡至水, PBS(0.01mol/L,pH7.4)冲洗5min;0.01mol/L枸橼酸缓冲液(pH6.0)中微波热修复20min;冷却至室温后PBS冲洗3minˑ3次;3%过氧化氢避光室温放置15min;磷酸缓冲液(PBS)冲洗3minˑ6次;滴加一抗BDNF或IL6(1ʒ100),4ħ冰箱过夜;恢复室温后PBS冲洗3minˑ3次;滴加HRP标记的羊抗兔二抗后37ħ孵育30min;PBS冲洗3minˑ3次;加DAB 避光显色,冲水终止;常规梯度乙醇和二甲苯脱水㊁透明,中性树胶封片㊂用PBS替代一抗为阴性对照㊂1.6图像分析将已免疫染色的切片置于OLYM-PUS BX60型显微镜下观察,免疫阳性反应为棕黄色颗粒㊂分别于脑梗死的中心区㊁周边区㊁对侧正常区随机选取5个视野,SPOTⅡ系统采集图像,Meta Mor-ph图像分析软件分析BDNF和IL6阳性信号的光密度值㊂1.7统计学处理采用SPSS16.0统计软件包分析㊂所得数据经正态分布及方差齐性检验后用均数ʃ标准差(xʃs)表示,组间两两比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1病理学改变模型组可见较大范围伴大小不等空泡的坏死区,软化灶明显,部分残存神经元出现核固缩深染,核溶解或核仁消失,细胞界限模糊,水肿明显,坏死灶的周围区可见较多的嗜中性粒细胞;假手术组的脑组织形态结构和神经元结构均正常㊂与模型组相比,片仔癀大㊁中剂量组的坏死区明显减小,周围的神经元的胞核和核仁清楚可见,水肿明显减轻,部分大鼠的神经元结构接近正常;脑得生组和尼莫地平组的坏死区范围㊁水肿较模型组明显减小或减轻,坏死区周围的部分神经元结构接近正常㊂2.2片仔癀对BDNF蛋白表达的影响梗死中心区:模型组的BDNF蛋白表达显著低于假手术组(P< 0.01),片仔癀大剂量组㊁脑得生组和尼莫地平组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)㊂梗死周围区:模型组的BDNF蛋白表达明显高于较假手术组(P<0.05),片仔癀大剂量组㊁片仔癀中剂量组㊁尼莫地平组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01);片仔癀大剂量组的BDNF蛋白表达明显高于小剂量组(P<0.05)㊂梗死对侧正常区:模型组的BDNF蛋白表达高于假手术组,各药物组的BDNF 蛋白表达高于模型组,但差异无统计学意义㊂详见表1㊂表1片仔癀对BDNF蛋白表达的影响(xʃs)OD值组别n梗死中心区梗死周围区梗死对侧正常区假手术组80.113ʃ0.0060.113ʃ0.0060.113ʃ0.006模型组80.053ʃ0.0072)0.138ʃ0.0051)0.131ʃ0.007片仔癀小剂量组80.059ʃ0.0080.162ʃ0.0120.134ʃ0.010片仔癀中剂量组80.065ʃ0.0090.173ʃ0.0104)0.128ʃ0.011片仔癀大剂量组80.091ʃ0.0104)0.188ʃ0.0174)5)0.147ʃ0.011尼莫地平组80.101ʃ0.0084)0.201ʃ0.0174)0.154ʃ0.014脑得生组80.074ʃ0.0113)0.162ʃ0.0130.139ʃ0.008与假手术组比较,1)P<0.05,2)P<0.01;与模型组比较,3)P<0.05,4)P<0.01;与片仔癀小剂量组比较,5)P<0.05㊂2.3片仔癀对IL6蛋白表达的影响梗死中心区:模型组IL6蛋白表达显著低于假手术组(P<0.01),尼莫地平组㊁脑得生组及片仔癀大剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)㊂梗死周边区:模型组较假手术组显著升高(P<0.01),片仔癀大剂量组㊁脑得生组㊁尼莫地平组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)㊂梗死对侧正常区:模型组IL6蛋白表达较正常组升高,各用药组均低于模型组,尼莫地平组表达最低,其次为脑得生组及片仔癀大㊁中㊁小剂量组,但差异无统计学意义(P<0.05)㊂详见表2㊂表2片仔癀对IL6蛋白表达的影响(xʃs)OD值组别n梗死中心区梗死周围区梗死对侧正常区假手术组80.126ʃ0.0110.126ʃ0.0110.126ʃ0.011模型组80.043ʃ0.0152)0.233ʃ0.0162)0.144ʃ0.017片仔癀小剂量组80.059ʃ0.0080.201ʃ0.0190.142ʃ0.010片仔癀中剂量组80.062ʃ0.0130.208ʃ0.0110.140ʃ0.011片仔癀大剂量组80.083ʃ0.0164)0.181ʃ0.0133)0.138ʃ0.008尼莫地平组80.114ʃ0.0104)0.178ʃ0.0153)0.125ʃ0.011脑得生组80.081ʃ0.0114)0.183ʃ0.0153)0.131ʃ0.012与假手术组比较,1)P<0.05,2)P<0.01;与模型组比较,3)P<0.05,4)P<0.01㊂3讨论BDNF属于神经营养素家族,主要分布在中枢神经系统的各个部位[5]㊂国内外的大量研究表明,脑缺血性损伤后,其神经元的损伤程度与BDNF的表达水平密切相关,BDNF的高表达能够明显增强神经元抗缺血性损伤的能力,BDNF在维持神经元功能㊁缺血性损伤后的再生修复和防止神经元退行性改变等方面发挥着至关重要的作用[5,6]㊂IL6主要表达于神经元和小胶质细胞,IL6在脑组织损伤过程中发挥着双重作用[7,8],BDNF和炎症因子间存在相互作用[9],一些研究发现,BDNF对IL6的表达具有调节作用,BDNF 等神经营养因子可减轻受损脊髓的炎症反应,并减少神经组织IL6的分泌,保护损伤的神经细胞[10,11]㊂本实验研究发现,片仔癀大㊁中剂量能够明显减少坏死区的范围,使脑组织水肿明显减轻,神经功能障碍有不同程度的改善,神经功能评分显著好于模型组,提示片仔癀大㊁中剂量对脑梗死所致的神经元等脑组织缺血性损伤有很好的保护作用㊂研究还发现,在脑梗死中心区模型组的BDNF和IL6的蛋白表达均较假手术组显著降低,片仔癀各剂量组BDNF和IL6的蛋白表达均高于模型组,但均低于假手术组,这可能是脑梗死中心区的脑组织缺血水肿㊁变性坏死严重,神经元大量缺血坏死㊁神经纤维溶解等病理损伤,导致各种蛋白质和神经递质合成减少所致,而片仔癀能够不同程度地上调脑梗死中心区BDNF和IL6的蛋白表达水平,促进神经元等脑组织缺血性损伤的修复或再生㊂在梗死周边区,模型组BDNF和IL6蛋白表达均较假手术组显著升高,片仔癀可显著上调BDNF蛋白的表达和下调IL6蛋白的表达,提示BDNF蛋白的高表达和IL6蛋白的低表达可能有利于缺血性损伤的神经元对缺血性损伤的耐受,片仔癀对缺血性神经元的功能保护及恢复有重要作用,片仔癀可以促进神经元的功能恢复及再生㊂而在梗死对侧正常区,模型组BDNF和IL6蛋白表达均较假手术组高,各药物组的BDNF蛋白表达高于模型组,而IL6蛋白表达低于模型组,但差异无统计学意义,提示该区域的神经元等脑组织可能参与了脑梗死后缺血性损伤的神经元功能的恢复与再生,其可能的机制有待进一步观察和研究㊂参考文献:[1]Liu L,Zhu L,Zou Y,et al.Panax notoginseng saponins pro-motes stroke recovery by influencing expression of Nogo A, NgR and p75NGF,in vitro and in vivo[J].Biol Pharm Bull,2014, 37(4):560568.[2]Kim G,Kim E.The effects of antecedent exercise on motor func-tion recovery and brain derived neurotrophic factor expressionafter focal cerebral ischemia in rats[J].J Phys Ther Sci,2013,25(5):553556.[3]黄希艳,李倩,朱陵群.片仔癀对脑梗死大鼠ZO1㊁MMP9蛋白及mRNA表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2013, 11(3):342343.[4]李倩,黄希艳,朱陵群.片仔癀对局灶性脑梗死大鼠水通道蛋白4(AQP4)表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2013,11(1):5961.[5]Berretta A,Tzeng YC,Clarkson AN.Post stroke recovery:Therole of activity dependent release of brain derived neurotro-phic factor[J].Expert Rev Neurother,2014,14(11):13351344.[6]Takeshima Y,Nakamura M,Miyake H,et al.Neuroprotectionwith intraventricular brain derived neurotrophic factor in rat ve-nous occlusion model[J].Neurosurgery,2011,68(5):13341341.[7]穆艳云,沈梅红,程洁,等.电针对脑缺血再灌注模型大鼠海IL6表达影响的观察[J].辽宁中医杂志,2013,40(4):797799. [8]Suzuki S,Tanaka K,Suzuki N.Ambivalent aspects of interleukin6in cerebral ischemia:Inflammatory versus neurotrophic aspects[J].J Cereb Blood Flow Metab,2009,29(3):464479. [9]杨芸,荣荣,但齐琴,等.BDNF抗体封闭对大鼠脑缺血损伤肺组织IL6表达的影响[J].四川大学学报(医学版),2012,43(6): 922925.[10]Lu P,Jones LL,Tuszynski MH.BDNF expressing marrow stro-mal cells support extensive axonal growth at sites of spinal cordinjury[J].Exp Neurol,2005,191(2):344360.[11]邓凤君,杨迎暴,徐江平,等.表没食子儿茶素没食子酸酯对脊髓损伤大鼠炎症因子释放及神经营养因子表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(5):195198.(收稿日期:20150210)(本文编辑郭怀印)蛋白酶体抑制剂诱导的PD细胞模型中p47表达及磷酸化水平研究王秋艳1,牛小媛1,胡林森2,房亚兰1摘要:目的探讨蛋白酶体抑制剂(PSI)作用于PC12细胞后细胞总蛋白及其磷酸化水平的变化㊂方法收集实验组(PSI,10μmol/L)和对照组[二甲基亚砜(DMSO)]细胞总蛋白,进行双向电泳,应用Pro Q Diamond磷酸化蛋白凝胶染色技术获得蛋白点磷酸化水平的差异信息,运用MALDI TOF质谱鉴定出差异蛋白质㊂结果差异蛋白点2㊁3均为p47,为2个同功体,蛋白酶体抑制剂干预后二者磷酸化水平均增加㊂结论p47表达上调及磷酸化水平增高与蛋白酶体抑制剂诱导的异常蛋白聚集及空泡形成有关,p47可能参与帕金森病的发病机制㊂关键词:蛋白酶体抑制;PC12细胞;p47;磷酸化中图分类号:R743R259文献标识码:A d o i:10.3969/j.issn.16721349.2015.06.018文章编号:16721349(2015)06075703帕金森病(Parkinson disease,PD)是最常见的神经变性疾病之一,迄今为止PD的病因和发病机制还不完全清楚㊂近年来研究表明家族性和散发PD都与泛素蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system,UPS)功能障碍有关[1]㊂经典的PD模型[包括6羟基多巴胺(6OHDA)㊁1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)/1甲基4苯基吡啶离子(MPP+)㊁百草枯㊁鱼藤酮模型]中也存在UPS功能障碍㊂应用作者单位:1.山西医科大学第一医院(太原030001);2.吉林大学第一医院通讯作者:房亚兰,E mail:fangyalan.2008@ 蛋白酶体抑制剂已成功地建立了新的PD细胞和动物模型[24]㊂蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰中最常见的一种共价修饰方式,在许多生物效应中起着开/关的作用㊂据估计,真核细胞的蛋白质分子中约有1/3发生磷酸化修饰㊂新近推出的Pro Q Diamond磷酸化蛋白染色技术适用于包括磷酸丝氨酸㊁磷酸苏氨酸以及磷酸酪氨酸的蛋白分子的定量荧光检测,且可直接在凝胶上进行,与MALDI TOF MS兼容,使大规模和系统性进行磷酸化蛋白质研究成为可能[5,6]㊂目前关于泛素蛋白酶体功能障碍与PD的关系还不完全清楚,本研究应用蛋白酶体抑制剂作用于。