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酵母穿梭质粒pXZ200的构建

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母 中复制表达 、 又能在 大肠杆菌 中复制表达的穿梭质粒 ， 在研
究 中被广泛应用 。但是 ， ｐ Ｘ Ｚ １ ９ ８质粒只含有大肠杆 菌的复制
子 Ｃ ｏ ｌ ｉ Ｅ １ ， 而 不 能 在 其 他 原 核 细 胞 中复 制 表 达， 而 ｐ Ｂ Ｂ Ｒ１ ＭＣ Ｓ ５却是能够 在多种革兰 氏阴性菌 中稳定 复制表 达
１ ． １ ． １ 主要 仪器
标仪等 。
１ ． １ ． ２ 主要试剂
恒温培养 箱 、 Ｐ Ｃ Ｒ仪 、 摇床、 低温离心机 、
相 比， 具有很 多优 点 ： 省 去了多步 的酶切酶 连 ， 操作更 为简单 快捷 ； 不 依赖 于限制性 酶切位 点 的存 在 ， 不会 引入多余 的碱
基； 通过合成 特定 的同源序列 ， 目的基因可以精确地定位在靶
限于几个 ｋ ｂ ｐ大小 ， 很少超过 １ ０ ｋ ｂ ｐ ， 但同源重组的新方法克 服了这种限制。
基因的生化 途径 ， 含有这个生化 途径 的重 组菌能够利 用木糖
产 生 玉 米 黄质列 的质粒 ｐ Ｘ Ｚ １ ９ ８是 一个 既能在 酵
Ｐ Ｃ Ｒ引 物 ， 用Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 方 法得 到重 组 片段 的两 端 带 有 重 组 所 需 同源臂外源 的 Ｄ Ｎ Ａ片段 Ｊ ， 是 目前应用最 为广泛 的一种
菌及恶臭假单胞杆菌 Ｋ Ｔ ２ ４ ４ ０中稳定复制 。
１ 材料 与方 法
１ ． １ 材料
重组技术 ． ｓ ， 这种方法 与传统 酶切 酶连 的基 因克 隆方法
关键词 ： 酿酒 酵母 ； 同源重组 ； 穿梭质粒 ； Ｐ Ｃ Ｒ技术 ； ｐ Ｘ Ｚ ２ ０ ０
中图分类号 ： Ｑ ９ ３ ６ 文 献标 志 码 ： Ａ 文 章编 号 ： １ ０ ０ ２—１ ３ ０ ２ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ８— ０ ０ ３ １ — ０ ３
分子生物学中 ， 利用 Ｄ Ｎ Ａ重组技术使宿主细胞获得某 种 特殊能力是非常重要而且被 广泛利用 的方法 。然 而 ， 这 种方 法在体外 需要 经多步的酶切和酶 连 ， 很 大程度上依 赖于载 体 上限制性 核酸内切 酶的酶切位点 ， 步骤繁琐 ， 所连接片段一般
江苏农业科学
２ ０ １ ５年第 ４ ３卷第 ８期
一 ３ １一
王珊珊 ， 徐海洋 ， 王世 明．酵母穿梭质 粒 ｐ Ｘ Ｚ ２ ０ ０的构建［ Ｊ ］ ．江苏农业科学， ２ ０ １ ５ ， ４ ３ （ ８ ） ： ３ １ — ３ ４
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． １ ５ ８ ８ ９ ／ ｊ ． ｉ ａ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ２—１ ３ ０ ２ ． ２ ０ １ ５ ． ０ ８ ． ０ ０ ９
列重组成一新 的质粒 ｐ Ｘ Ｚ ２ ０ ０ ， 经验证 ， 该 质粒可 以在大肠 杆
列就可 以介导 同源重 组的发生 ， 获 得重组 克隆 ； 当两端 的
同源序列为 ３ ０ ｂ ｐ时 ， 有效同源重组 的频率 可接近 ８ ０ ％ 。 Ｐ Ｃ Ｒ介导重 组 技 术是 指通 过 人 工合 成 寡 核 苷 酸单 链 作 为
冰箱 、 制冰机 、 无 菌操作 台、 灭菌锅、 电转杯 、 电转仪 、 多功能酶
Ｄ ｒ ａ Ｉ限 制 性 内 切 酶 、 Ｄ Ｎ Ａ 回收试 剂盒 、
位点上 ； 解决了大 片段 的基 因克隆 问题
。体 外将合成 的
１ ｍｏ ｌ ／ Ｌ山梨醇 、 氨 苄抗 生 素 、 庆 大 霉 素、 卡那 霉 素 、 博 来霉 素等。 １ ． １ ． ３ 主要菌种和质粒 酿酒酵母 ￥ ２ ８ ８ Ｃ 、 大肠杆菌 Ｄ Ｈ Ｓ ａ、 恶臭假单胞 杆菌 Ｋ Ｔ ２ ４ ４ ０ 、 含有完整 ２ 序列及博来霉素抗性 基 因片段 ｐ Ｘ Ｚ的 ｐ Ｘ Ｚ １ ９ ８质粒 、 含有 Ｋ ａ ｎ 片段 的 ｐ Ｅ Ｔ ２ ９ ａ 质 粒、 含 有在 多种原 核 细胞 中能复 制的广 谱复 制子 ｐ Ｂ Ｂ Ｒ １的
ｐ Ｂ Ｂ Ｒ １ ＭＣ Ｓ ５质 粒 。
Ｄ Ｎ Ａ片段利用酿酒 酵母 的 重组 机制 ， 在 体 内完成 多个 Ｄ Ｎ Ａ
片段 的一步整合 已被广泛运 用。１ ９ ７ ０ －２ ０ ０ ８年 ， Ｄ Ｎ Ａ合成片 段 已经从 ７ ５ ｂ ｐ增加到 ５ ８ ３ ｋ ｂ ｐ 。１ ９ ７ ０年 ， Ｋ ｈ ｏ ｒ ａ ｎ ａ等成功 合成丙氨酸转运 Ｒ Ｎ Ａ的完整基 因， 这是第一次实现化学合成 可遗传序列” ； ２ ０ ０ ８年 ， Ｖ ｅ ｏｅ ｔ ｒ 研究 组合成 了由 １ ０ １ 个 Ｄ Ｎ Ａ
的质粒 。本试验利用 酿酒酵母 的体 内高效重组系统 ， 将 广
酿酒酵母细胞 内有着较其他生物更高效的同源重组修 复
双链 Ｄ Ｎ Ａ断裂机制 ， 是研究同源重组机制和应用 同源重组技
术的主要模式生物
。在酿酒酵母 系统中 ， １ ５ ｂ ｐ的 同源序
谱 复制子 ｐ Ｂ Ｂ Ｒ １ 、 卡那霉素抗性基因 Ｋ ａ ｎ 、 酵母 复制子 ２ 序
段、 酵母复制子 ２ 片段这 ３ 个两端含有 ３ ０ ｂ ｐ 同源臂的片段电转入酿酒酵母 ， 通过同源重组获得宿主更具广谱性的
革兰氏阴性细菌 一啤酒酵母穿梭质 粒 ｐ Ｘ Ｚ ２ ０ ０ 。经 检测 ， ｐ Ｘ Ｚ ２ ０ ０能 够在 恶臭假 单胞 杆菌 Ｋ Ｔ ２ ４ ４ ０和 大肠杆 菌 中稳 定 复制 。
酵母 穿梭质粒 ｐ Ｘ Ｚ ２ ０ ０的构建
王珊珊 ， 徐 海 洋 ，王世 明
（ 南京理工大学环境与生物工程学院 ， 江苏南京 ２ １ ０ ０ ９ ４）
摘要 ： 利 用酿酒酵母高效的 同源 重组能力 ， 通过 Ｐ Ｃ Ｒ扩 增技 术 ， 将 复 制子 ｐ Ｂ Ｂ Ｒ １片段 、 Ｋ ａ ｎ （ 卡纳 霉素抗 性 ） 片
片段构建 、 长度为 ５ ８ ３ ｋ ｂ ｐ的 Ｄ Ｎ Ａ ， 该Ｄ Ｎ Ａ通 过体外合成 ２ ５个具有 同源臂 的 Ｄ Ｎ Ａ片段 ， 然 后利用 酵母 重组机 制合 成

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酵母双杂交原理与实验具体流程

酵母双杂交原理与实验具体流程

Reporter genes under the control of GAL4-responsive elements
AH109 contains four reporters—ADE2, HIS3, MEL1, and lacZ—under the control of three distinct GAL4 upstream activating sequences (UASs) and TATA boxes . The ADE2 reporter alone provides strong nutritional selection. For higher stringency, and to reduce the incidence of false positives, select for ADE2 and HIS3 (James et al., 1996). You also have the option of assaying for MEL1, which encodes α-galactosidase. MEL1 is endogenous to both Y187 and AH109. Because α-galactosidase is a secreted enzyme, its activity can be detected by adding Xα-Gal to the selection plate: If MEL1 is active and X-α-Gal is present, the colony will turn blue. lacZ in Y187 exhibits a high level of induced β-galactosidase activity in a positive two-hybrid assay because it is under the control of the intact GAL1 UAS.
酵母双杂实验原理及技术

酵母双杂实验原理及技术

蛋白的酵母双杂交实验——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用第一部分 系统简介1. 实验原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。

很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。

这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。

目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。

在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。

在利用GAL4系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。

一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。

在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。

GAL4系统的原理如图所示：图一：酵母双杂交系统工作原理Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA2．系统特点同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。

630490 酵母双杂交文库构建实验流程(clontech)

630490 酵母双杂交文库构建实验流程(clontech)

第一链cDNA合成1.准备: 高质量的Poly A 或总RNA2. 在微量离心管中混匀以下试剂：1–2 μl RNA 样本(0.025–1.0 μg poly A+或0.10–2.0 μg 总RNA)1.0 μl CDS III 或CDSIII/6 引物1–2 μl 去离子水(补齐体系到4.0 μl)4.0 μl 总体积注意: 对照实验时，请使用1μl *1μg+ 的对照RNA。

CDSIII = Oligo-dT；引物CDSIII/6 =随机引物3. 72°C ，孵育2 min。

4. 冰上冷却2 min，然后14000rpm，10sec，瞬时离心。

5. 混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的RNA样本中，轻拍混匀。

2.0 μl 5X First-Strand 缓冲液1.0 μl DTT (100 mM)1.0 μl dNTP 混合物(10 mM )1.0 μl SMART MMLV 反转录酶6. 只有使用随机引物(CDSIII/6)实验才进行此步骤[如果采用Oligo-dT(CDSIII)请忽略此步骤，直接进行Step7]，25°C，室温孵育10 min。

7. 42°，孵育10 min。

注意: 孵育在热盖的PCR仪中进行。

若用非热盖的PCR仪或水浴，请在反应管中加入一滴矿物油来避免水分蒸发。

8. 加入1 μl SMART III-modified oligo，混匀，42°C，孵育1 hr。

9. 75°C ，10 min终止第一链合成反应。

10. 室温冷却，加入1 μl RNA酶H (2U)。

11. 37°，孵育20 min。

12. 继续进行LD-PCR 扩增(Section VII.B)。

注意: –20°C下可保存3个月。

第一链反应最终体积为15μl• 10 μl SMART III Oligo(10 μM; 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG CCATTATGGCCGGG-3’)• 10 μl CDS III 引物(10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-d(T)30VN-3’)*23个碱基• 10 μl CDS III/6 引物(10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-NNNNNN-3’)注意: N = A, G, C, or T; V = A, G, or C• 50 μl 5’ PCR 引物(10 μM; 5’-TTCCACCC AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’)25个碱基•50 μl 3’ PCR 引物(10 μM; 5’-GTATCGATGCCCACCC TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’)第二链cDNA合成（LD-PCR）尽量使用最小的循环数来得到3-6ug的ds cDNA。

重组质粒的构建经验~~~

重组质粒的构建经验~~~

重组质粒的构建经验~~~第一篇：重组质粒的构建经验~~~昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。

重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。

在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。

但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。

在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。

所涉及内容如下：1)克隆基因的酶切位点问题2)载体酶切的问题 3)连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。

一、克隆基因的酶切位点问题1、克隆位点选择的问题。

首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。

然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。

这是常识，不赘述。

2、保护碱基数目的问题。

在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。

但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。

这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。

一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。

如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。

NcoI4 NdeI6 NheI3 NotI8 PmeI6 SacI3 SalI3 SmaI3 HindIII 3 BstI8 SphI4 XhoI3 XbaI3 SmaI4 案例分析一：本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR 引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。