实验六 石蜡切片法1

⽯蜡切⽚步骤⽯蜡切⽚基本步骤（⼀）取材和固定根据实验⽬的选择材料。

将整个⾍体或⾍体的内部器官（如肠道、马⽒管、唾液腺等）取出后，⽴即投⼊固定液。

取材⼤⼩：0.5cm×0.5 cm×0.2或者1.0 cm×1.0 cm×0.2，厚度不宜超过3mm。

固定液：2.5%的戊⼆醛固定液，Bouin⽒液，10%甲醛等。

固定时间：4oC固定24⼩时。

注意事项：取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所⽤⼑、剪要锋利，切割时不可来回切割。

夹取组织时，镊⼦要轻，切勿挤压，以免损伤组织。

取材时，组织块可稍⼤⼀点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。

2.选好组织块的切⾯应熟悉器官组织的组成，并根据观察⽬的来确定纵切或横切。

3．保持材料的清洁组织块上如有⾎液、污物、粘液、⾷物等，先⽤⽣理盐⽔冲洗⼲净，再⼊固定液。

4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。

固定：1．材料新鲜取出组织后须⽴即固定。

否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发⽣⾃溶现象。

2．抽⽓⽣物组织常有⽓体的存在，使材料不能沉⼊固定液中，抽⽓使得固定液有效渗⼊。

真空泵抽⽓或者⽤空针管抽⽓。

昆⾍整体固定，固定前⽤解剖针刺数个⼩孔，以利⽤固定液渗透。

3．固定剂⽤量⼀般为组织体积的10~20倍。

勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗⼊。

4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作⽤。

5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗⼊，对长期固定的标本可经常更换固定液。

（⼆）洗涤2.5%戊⼆醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2磷酸缓冲液漂洗三次，每次10minBouin⽒固定液固定的组织：直接⼊70%酒精更换数次即可脱⽔，注意苦味酸。

甲醛固定的组织：直接投⼊50%或70%酒精脱⽔，不经⽔洗。

但如果在甲醛中时间过长，则仍应当⽤流⽔冲洗。

陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱⽔、切⽚和染⾊。

包埋过程中易出现的问题及解决办法
问题：包埋后的石蜡块应为均匀半透明状，有时出现白色浑浊 结晶（像雪花一样）部分，这样在切片时就有妨碍，不易切出 薄的切片。 原因：①组织内部或石蜡中混有透明剂；②脱水不干净；③石 蜡本身品质不良；④组织块移入纸盒时动作太慢，周围的石蜡 已成凝固状态；⑤冷却用水温度不够低，石蜡凝固太慢。 解决办法：属于前三个原因者应在包埋之前就须注意；属于后 二个原因者，可将包埋块再投入Ⅲ蜡中熔化后重新包埋，但必 须注意熔化包埋过的石蜡块的时间不宜过久。
脱水（常用脱水剂：乙醇；脱水原则：低浓度到高浓度）（目的？） 脱水时间：视材料的性质、大小而定 小鼠肝脏：在各级AL中停留0.5-1h； 植物叶片：在各级AL中停留2-4h； 注意：脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水；如需过夜， 则停留在70%酒精中。
二、实验步骤（2）
透明（置换） 常用透明剂：二甲苯； 透明原则：低浓度到高浓度 （½ 二甲苯+ ½ 100%酒精 二甲苯 二甲苯） 透明时间：小鼠肝脏每级停留0.5-1h；植物叶片每级停留1-3h。
染色原理－－化学作用
化学作用的主要理论根据是染色剂的性质可分为酸性、碱性和 中性染色剂，而动、植物的细胞内—般也可区分为酸性(阴离子) 和碱性(阳离子)部分。当碱性染色剂溶液中的有色部分成为阳 离子时，就能与细胞的阴离子(酸件部分)较牢固地结合，当酸 性染色剂溶液中的有色部分成为阴离子时，就能与细胞内的阳 离子(碱性部分)较牢固地结合。 例如，细胞核，尤其是核内的染色质，主要由核酸组成，是酸 性的组成成分．故和碱性染色剂(苏木精)的亲和力很强，易于 着色。细胞质含碱性物质，故和酸性染色剂(伊红、曙红)的亲 和力很大，易于着色。
甲醛－醋酸－酒精液(FAA) 50%或70％酒精 90ml 冰醋酸 5ml 甲醛 5ml 特点：过去称”标准固定液“或”万能固定液“；是 组织形态中常用的固定液；同时兼作保存液。是植物 制片技术中较为良好的固定液和保存液。除单细胞和 丝状藻类外，均可用此液固定．也通用于昆虫和甲壳 类的固定。

实验时间石蜡切片及染色过程
石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。

苏木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。

这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。

经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。

实验步骤及注意事项
一、石蜡切片
1. 取材: 刀片要求锋利而薄,组织厚度约2—3mm, 大小1.5×1.5×0.2～0.3cm 为宜. 取材时间越快越好.
2. 固定: 组织取下后应立即放入 10%福尔马林(相当于 4%甲醛)固定.
注意：
(1) 固定液量应为组织块体积的 40 倍.
(2) 固定时间固定时间与使用的固定液种类和组织块大小, 温度等
有关. 一般为 3—24h.
(3) 固定温度大多可在室温固定, 在低温(4℃)时间应延长.
(4) 固定容器应大些.
3. 漂洗: 流水冲洗 2—10h.。

实验时间石蜡切片免疫组化实验（含详细步骤）
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。

根据标记物的不同分为：免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。

其中前三种最常用。

实验原理
根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔 IgG 分子结合在多聚酶上形成多聚物分子，其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。

实验步骤
1. 石蜡切片置于67 ℃ 烘箱中，烘片 2 小时，脱蜡至水，用 pH 7.4 的 PBS 冲洗三次，每次 3 分钟（3 × 3'）。

2. 取一定量 pH = 6.0 柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理 10 分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用 PBS 冲洗2 × 3'（注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定）。