苯丙氨酸解氨酶_PAL_的研究进展_崔建东
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DO I :10.13386/j .issn1002 -0306.2008.07.088
食品工业科技
ScienceandTechnologyofFoodIndustry
综 述
苯丙氨酸解氨酶 (PAL)的研究进展
崔建东 , 李 艳 , 牟德华 (河北科技大学生物科学与工程学院 , 河北石家庄 050018)
苯丙氨酸解 氨酶 (Phenylalanineammonialyase, PAL, EC.4.3.1.5)广泛存在于各种植物和少数微生物 中 , 是植物体内次生代谢的关键酶和限速酶 , 在微生 物中可催化 L-苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸和氨 。 纯化 后的 PAL可以用于治疗某些肿瘤 [ 1] , 监控苯丙酮尿 患者血浆中的苯丙氨酸含量 , 治疗苯丙酮尿患者[ 2] , 但其主要用途是催化反式肉桂酸转化合成 L-苯丙氨 酸 (L-phenylalanine, L-phe)。 L-phe是合成阿斯巴 甜 (aspartame, APM)的主要原料 , 随着 APM的全球 热销和反式肉桂酸生产成本的降低 , 利用 PAL转化 反式肉桂酸合成 L-phe的方法成为当前生物化工领 域研究的热点 。本文就 PAL的基本特点及近几年的 研究进展作简要介绍 , 重点介绍微生物 PAL的研究 进展 。
3 微生物 PAL研究
1966年 , Ogata等 [ 9] 在研究芳香族氨基酸的微生 物代谢时发现 , 红酵母属中的某些种能以 L-苯丙氨 酸为唯一碳 、氮源生长 , 并在培养基中积累肉桂酸 。 随后 , 该酶相继在其它微生物中被发现 , 主要有霉菌 与酵母菌 。包括[ 10] :链霉菌属 (Streptomyces)、枝孢霉 属 (Cladosporium)、粘 滑 菇 属 (Hebeloma)、鳞 伞 属 (Pholiola)、 鬼 伞 属 (Coprinus)、 共 头 霉 (Symcephalasilrum)、烟熏离褶伞属 (Lyophyllum)、内 孢霉 属 (Endomuces)、曲 霉属 (Asperhilllus)、地霉 属 (Geotricum)、 从 梗 孢 属 (Monilella)、 小 丛 壳 属 (Glomerella)、卵 孢酵母 属 (Oosporidium)、类酵 母属 (Saccharomycodes)、掷酵母属 (Sporidiobolus)。 目前 , 对微生物 PAL的研究主要集中在菌种选育以及提高 PAL活性和稳定性方面 。
摘 要 :对苯丙氨酸解氨酶的分布 、特点进行了概括 , 并分别对植物 、微生物苯 丙氨酸解氨 酶的研究 情况进行了 综述 。 重点介绍了生产苯丙氨酸解氨酶的微生物选育方法以及提高酶活性 、酶稳定性的研究进展 , 旨在为该 酶的进一步研究 提供参考依据 。 关键词 :苯丙氨酸解氨酶 ,特点 ,菌种选育 , 活性 , 稳定性
3.2 PAL活性和稳定性研究
为了提高 PAL酶在反式肉桂酸转化过程中的稳 定性和重复使用 率 , 有学者利用固定化 技术对此进 行了研究 。 王 晓华等 [ 16] 利用不 同的方 法固 定 PAL 酶 , 研究了固定化 PAL的偶联率 、包被率以及固定化 对 PAL活性的影响 。 结果表明 , 当采用聚丙烯酰胺 凝胶 (PAG)包埋 PAL时 , 酶活 性保 护较 好 。 邓 旭 等[ 17] 研究了固定化 PAL酶合成 L-苯丙氨酸过程中 酶活与稳定性的情况 , 考察了不同氨基供体 、肉桂酸 浓度 、pH以及酶的不同固定化量等因素对酶反应过 程的影响 , 确定了维持酶活的最佳保存 条件以及最 适反应条件 。 我们研 究了不同效应物 、还原剂 和金 属离子对重组 PAL的稳定性影响 , 结果发现 , 10%的 甘油可以显著提高重组 PAL的稳定性 , 巯基乙醇 、蔗 糖和镁离子可以提高酶活 , 但重金属离子却使 PAL 失活 [ 19] 。 为了提高 PAL活力 , Nakamichi等[ 19] 研究发 现除 了 L-苯 丙氨酸 外 , L-异亮 氨酸 、L-亮 氨 酸 、 L-甲硫氨酸 、L-色氨酸 、L-酪氨酸也可 以诱导并提 高 PAL的活力 。 此外 , 为了减少细胞膜对底物的通 透性障碍 , 一些学者通过利用表面活性 剂或有机试 剂, 来 改善红酵 母细胞通透 性, 从而 提高酶 活。 Godwin等 [ 20]用葡糖醛酸酶和曲通 100联合处理红酵 母细胞 , 酶活提高了 9倍 。
3.1 生产 PAL的微生物选育
在菌种选育方面 , 主要有直接筛选法 、天然源富 集分离筛选 、诱变选育 、原生质体融合法和苯丙氨酸 解氨酶菌种的基因工程育种 。 直接筛选法主要是根 据文献报道的符合筛选条件的种属 , 通过 PAL活性 检测分析 , 筛选出符合要求的菌株 。 虽然这种方法 直接 而 方 便 , 但 所 获 得 的 菌 株 往 往 活 性 低 。 Kupletskaya等[ 11] 对 417株产色素酵母和 112株丝状 真菌直接筛选发现 , 产色素酵母中所选取的 Phaffia 属 11株 、Bullera、Cyatofilobasidium、Tilleliopsis三属 45 株不具有 PAL活性 。 富集筛选技术是通过改变环境 中某些因素 , 使某种微生物 在这种环境中比其它微 生物具有更强 的生长优势 , 达到富集的目 的 。 富集 筛选的关键步骤是选择合适的培养基 , 可以通过特 殊化合物作为唯一碳源 , 筛 选具有利用或降解这种 化合物的微生物 , 或利用抑 制剂来阻断特异的代谢 途径 。中国科学院成都生物研究所利用此 技术 , 从 滇西某芒果园的土壤中分离出 PAL的高产菌株 -粘 红酵母 (Rhodotorula.glutinis)CIBASA1401, 利用该 菌株在国内率先成功中试生产 L-苯丙氨酸 , 产率达 到 30g/L。 通过对苯丙氨酸解氨酶活性诱导产生 、反 应机理及理化性质的研究 , 利用底物 、产物结构类似 物对高产苯丙氨酸解氨酶菌株进行 有意识的选育 , 取得了很大的成绩 。 Evans等 [ 12] 用紫外诱变粘红酵 母 , 以 L-酪氨酸 、对氟 -DL-苯丙氨酸 (PEP)和 β -2
综 述
食品工业科技 Vol.29 , No.07 , 2008
Hale Waihona Puke 素 、黄酮 、异黄酮 、生物碱 、苯甲酸酯糖苷等次生代谢 产物 。这些产物在植物的生长发育过程中起着重要 的作用 , 而这些物质的含量总是与 PAL的活性密切 相关 , 所以 PAL对植物有着非常重 要的生理意义 。 由此 , PAL在植物中主要有参与 植物抗病 、抗虫害 、 抗逆境的作用 。
2 植物 PAL的研究
对植物 PAL的特性及其作用研究报道较多 , 自 1961年 , Koukol等[ 8] 首先从绿色植物中发现并提取 分离了苯丙氨酸解氨酶 。随后对 PAL的研究迅速展 开 , 植物 PAL是连接初级代谢和苯丙烷类代谢 、催化 苯丙烷类代谢第 一步反应的酶 , 是苯丙 烷类代谢途 径中研究最多的酶 。苯丙烷类途径可生成反式肉桂 酸 、香豆酸 、阿魏酸 、芥子酸等中间产物 , 这些中间产 物可进一步转化为香豆素 、绿原酸 , 也可形成反式香 豆酰辅酶 A酯 , 再通过多条途径进一步转化为木质
收稿日期 :2007-11-23 作者简介 :崔建东 (1974-), 男 , 博士 , 研究方向 :生物反应工程 。
30 6 2008年第 07期
结构进行研究显示 , PAL分散在细胞的基质 , 存在于 高尔基体囊泡和次生壁加厚层中 。
1.2 PAL的基本特性
PAL是一种寡聚酶 , 分子量一般在 220～ 330kDa, 是一种酸性蛋白 。酶 蛋白是由四个亚基组成 , 多数 PAL有均一的亚基 , 分子量在 55～ 88kDa。 PAL亚基 间的结合是非常 牢固的 , 要把其亚基分 开需要高浓 度的尿素 、氯化胍或 SDS-巯基乙醇 。 PAL的亚基被 破坏后 , 进行复性 是非常困难的 。 不同生物体 内的 PAL最适 pH不同 , 一般介于 8.0～ 9.5 之间 。 除红酵 母的 PAL在底物为 NH4+ 时的酶促反应符合经典的 米氏方程外 , 大多数生物的 PAL动力学曲线不遵循 米氏方程 。 各种来源的 PAL的米氏常数 (Km)不同 , 为 10-4～10-2 mmol/L之间 。 PAL具有别构酶的特点 , 是一种典型的胞内诱导酶 。 研究表明 , 在培养 细胞 中加入 诱 导 物 时 , PAL基 因 的 转 录 活 性 增 高 [ 6] 。 L-苯丙氨酸 (L-phe)和 L-酪氨酸 (L-tyr)或某些结 构类似物可诱导其从头合成[ 7] 。
Abstract:Thedistributionand charactersofphenylalanineammonialyasewerereviewed.Moreover, research progressonphenylalanineammonialyaseofmicroorganism andplantwassummarizedrespectively.Inparticular, breedingmethodforproducingphenylalanineammonialyaseandimprovementofenzymeactivitiesandstability werealsogeneralized. Keywords:phenylalanineammonialyase;characters;breeding;activities;stability 中图分类号 :TS201.2+ 5 文献标识码 :A 文 章 编 号 :1002-0306(2008)07-0306-03
Researchprogressofphenylalanineammonialyase
CUIJian-dong, LIYan, MOUDe-hua
(BioengineerringCollege, HebeiUniversityofScienceandTechnology, Shijiazhuang050018, China)
食品工业科技
ScienceandTechnologyofFoodIndustry
综 述
苯丙氨酸解氨酶 (PAL)的研究进展
崔建东 , 李 艳 , 牟德华 (河北科技大学生物科学与工程学院 , 河北石家庄 050018)
苯丙氨酸解 氨酶 (Phenylalanineammonialyase, PAL, EC.4.3.1.5)广泛存在于各种植物和少数微生物 中 , 是植物体内次生代谢的关键酶和限速酶 , 在微生 物中可催化 L-苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸和氨 。 纯化 后的 PAL可以用于治疗某些肿瘤 [ 1] , 监控苯丙酮尿 患者血浆中的苯丙氨酸含量 , 治疗苯丙酮尿患者[ 2] , 但其主要用途是催化反式肉桂酸转化合成 L-苯丙氨 酸 (L-phenylalanine, L-phe)。 L-phe是合成阿斯巴 甜 (aspartame, APM)的主要原料 , 随着 APM的全球 热销和反式肉桂酸生产成本的降低 , 利用 PAL转化 反式肉桂酸合成 L-phe的方法成为当前生物化工领 域研究的热点 。本文就 PAL的基本特点及近几年的 研究进展作简要介绍 , 重点介绍微生物 PAL的研究 进展 。
3 微生物 PAL研究
1966年 , Ogata等 [ 9] 在研究芳香族氨基酸的微生 物代谢时发现 , 红酵母属中的某些种能以 L-苯丙氨 酸为唯一碳 、氮源生长 , 并在培养基中积累肉桂酸 。 随后 , 该酶相继在其它微生物中被发现 , 主要有霉菌 与酵母菌 。包括[ 10] :链霉菌属 (Streptomyces)、枝孢霉 属 (Cladosporium)、粘 滑 菇 属 (Hebeloma)、鳞 伞 属 (Pholiola)、 鬼 伞 属 (Coprinus)、 共 头 霉 (Symcephalasilrum)、烟熏离褶伞属 (Lyophyllum)、内 孢霉 属 (Endomuces)、曲 霉属 (Asperhilllus)、地霉 属 (Geotricum)、 从 梗 孢 属 (Monilella)、 小 丛 壳 属 (Glomerella)、卵 孢酵母 属 (Oosporidium)、类酵 母属 (Saccharomycodes)、掷酵母属 (Sporidiobolus)。 目前 , 对微生物 PAL的研究主要集中在菌种选育以及提高 PAL活性和稳定性方面 。
摘 要 :对苯丙氨酸解氨酶的分布 、特点进行了概括 , 并分别对植物 、微生物苯 丙氨酸解氨 酶的研究 情况进行了 综述 。 重点介绍了生产苯丙氨酸解氨酶的微生物选育方法以及提高酶活性 、酶稳定性的研究进展 , 旨在为该 酶的进一步研究 提供参考依据 。 关键词 :苯丙氨酸解氨酶 ,特点 ,菌种选育 , 活性 , 稳定性
3.2 PAL活性和稳定性研究
为了提高 PAL酶在反式肉桂酸转化过程中的稳 定性和重复使用 率 , 有学者利用固定化 技术对此进 行了研究 。 王 晓华等 [ 16] 利用不 同的方 法固 定 PAL 酶 , 研究了固定化 PAL的偶联率 、包被率以及固定化 对 PAL活性的影响 。 结果表明 , 当采用聚丙烯酰胺 凝胶 (PAG)包埋 PAL时 , 酶活 性保 护较 好 。 邓 旭 等[ 17] 研究了固定化 PAL酶合成 L-苯丙氨酸过程中 酶活与稳定性的情况 , 考察了不同氨基供体 、肉桂酸 浓度 、pH以及酶的不同固定化量等因素对酶反应过 程的影响 , 确定了维持酶活的最佳保存 条件以及最 适反应条件 。 我们研 究了不同效应物 、还原剂 和金 属离子对重组 PAL的稳定性影响 , 结果发现 , 10%的 甘油可以显著提高重组 PAL的稳定性 , 巯基乙醇 、蔗 糖和镁离子可以提高酶活 , 但重金属离子却使 PAL 失活 [ 19] 。 为了提高 PAL活力 , Nakamichi等[ 19] 研究发 现除 了 L-苯 丙氨酸 外 , L-异亮 氨酸 、L-亮 氨 酸 、 L-甲硫氨酸 、L-色氨酸 、L-酪氨酸也可 以诱导并提 高 PAL的活力 。 此外 , 为了减少细胞膜对底物的通 透性障碍 , 一些学者通过利用表面活性 剂或有机试 剂, 来 改善红酵 母细胞通透 性, 从而 提高酶 活。 Godwin等 [ 20]用葡糖醛酸酶和曲通 100联合处理红酵 母细胞 , 酶活提高了 9倍 。
3.1 生产 PAL的微生物选育
在菌种选育方面 , 主要有直接筛选法 、天然源富 集分离筛选 、诱变选育 、原生质体融合法和苯丙氨酸 解氨酶菌种的基因工程育种 。 直接筛选法主要是根 据文献报道的符合筛选条件的种属 , 通过 PAL活性 检测分析 , 筛选出符合要求的菌株 。 虽然这种方法 直接 而 方 便 , 但 所 获 得 的 菌 株 往 往 活 性 低 。 Kupletskaya等[ 11] 对 417株产色素酵母和 112株丝状 真菌直接筛选发现 , 产色素酵母中所选取的 Phaffia 属 11株 、Bullera、Cyatofilobasidium、Tilleliopsis三属 45 株不具有 PAL活性 。 富集筛选技术是通过改变环境 中某些因素 , 使某种微生物 在这种环境中比其它微 生物具有更强 的生长优势 , 达到富集的目 的 。 富集 筛选的关键步骤是选择合适的培养基 , 可以通过特 殊化合物作为唯一碳源 , 筛 选具有利用或降解这种 化合物的微生物 , 或利用抑 制剂来阻断特异的代谢 途径 。中国科学院成都生物研究所利用此 技术 , 从 滇西某芒果园的土壤中分离出 PAL的高产菌株 -粘 红酵母 (Rhodotorula.glutinis)CIBASA1401, 利用该 菌株在国内率先成功中试生产 L-苯丙氨酸 , 产率达 到 30g/L。 通过对苯丙氨酸解氨酶活性诱导产生 、反 应机理及理化性质的研究 , 利用底物 、产物结构类似 物对高产苯丙氨酸解氨酶菌株进行 有意识的选育 , 取得了很大的成绩 。 Evans等 [ 12] 用紫外诱变粘红酵 母 , 以 L-酪氨酸 、对氟 -DL-苯丙氨酸 (PEP)和 β -2
综 述
食品工业科技 Vol.29 , No.07 , 2008
Hale Waihona Puke 素 、黄酮 、异黄酮 、生物碱 、苯甲酸酯糖苷等次生代谢 产物 。这些产物在植物的生长发育过程中起着重要 的作用 , 而这些物质的含量总是与 PAL的活性密切 相关 , 所以 PAL对植物有着非常重 要的生理意义 。 由此 , PAL在植物中主要有参与 植物抗病 、抗虫害 、 抗逆境的作用 。
2 植物 PAL的研究
对植物 PAL的特性及其作用研究报道较多 , 自 1961年 , Koukol等[ 8] 首先从绿色植物中发现并提取 分离了苯丙氨酸解氨酶 。随后对 PAL的研究迅速展 开 , 植物 PAL是连接初级代谢和苯丙烷类代谢 、催化 苯丙烷类代谢第 一步反应的酶 , 是苯丙 烷类代谢途 径中研究最多的酶 。苯丙烷类途径可生成反式肉桂 酸 、香豆酸 、阿魏酸 、芥子酸等中间产物 , 这些中间产 物可进一步转化为香豆素 、绿原酸 , 也可形成反式香 豆酰辅酶 A酯 , 再通过多条途径进一步转化为木质
收稿日期 :2007-11-23 作者简介 :崔建东 (1974-), 男 , 博士 , 研究方向 :生物反应工程 。
30 6 2008年第 07期
结构进行研究显示 , PAL分散在细胞的基质 , 存在于 高尔基体囊泡和次生壁加厚层中 。
1.2 PAL的基本特性
PAL是一种寡聚酶 , 分子量一般在 220～ 330kDa, 是一种酸性蛋白 。酶 蛋白是由四个亚基组成 , 多数 PAL有均一的亚基 , 分子量在 55～ 88kDa。 PAL亚基 间的结合是非常 牢固的 , 要把其亚基分 开需要高浓 度的尿素 、氯化胍或 SDS-巯基乙醇 。 PAL的亚基被 破坏后 , 进行复性 是非常困难的 。 不同生物体 内的 PAL最适 pH不同 , 一般介于 8.0～ 9.5 之间 。 除红酵 母的 PAL在底物为 NH4+ 时的酶促反应符合经典的 米氏方程外 , 大多数生物的 PAL动力学曲线不遵循 米氏方程 。 各种来源的 PAL的米氏常数 (Km)不同 , 为 10-4～10-2 mmol/L之间 。 PAL具有别构酶的特点 , 是一种典型的胞内诱导酶 。 研究表明 , 在培养 细胞 中加入 诱 导 物 时 , PAL基 因 的 转 录 活 性 增 高 [ 6] 。 L-苯丙氨酸 (L-phe)和 L-酪氨酸 (L-tyr)或某些结 构类似物可诱导其从头合成[ 7] 。
Abstract:Thedistributionand charactersofphenylalanineammonialyasewerereviewed.Moreover, research progressonphenylalanineammonialyaseofmicroorganism andplantwassummarizedrespectively.Inparticular, breedingmethodforproducingphenylalanineammonialyaseandimprovementofenzymeactivitiesandstability werealsogeneralized. Keywords:phenylalanineammonialyase;characters;breeding;activities;stability 中图分类号 :TS201.2+ 5 文献标识码 :A 文 章 编 号 :1002-0306(2008)07-0306-03
Researchprogressofphenylalanineammonialyase
CUIJian-dong, LIYan, MOUDe-hua
(BioengineerringCollege, HebeiUniversityofScienceandTechnology, Shijiazhuang050018, China)
