生物分离工程实验

实验一絮凝技术预处理发酵液及其滤饼的质量比阻测定（见教材）实验三PEG/（NH4）2SO4 两水相系统的相图（见教材）实验二利用盐析和等电点沉淀法从牛奶中制备酪蛋白1 实验目的掌握盐析和等电点沉淀法的原理和基本操作。

2 实验原理乳蛋白广泛存在于乳制品中，牛奶中主要含有酪蛋白，酪蛋白在pH 4.8是沉淀，乳蛋白素则在pH=3左右才会沉淀。

利用这一性质可以先将降至4.8，或者是在加热至40℃的牛奶中加人硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。

酪蛋白不溶于乙醇，利用乙醇可以除去杂质。

将除掉酪蛋白的溶液pH调至3左右，使乳蛋白素沉淀析出。

可以得到乳蛋白素。

3实验器材烧杯；玻璃试管；离心管；磁力搅拌器；pH计；离心机等。

4试剂和材料⑴试剂与材料脱脂牛乳；无水硫酸钠；HCL；氢氧化钠；滤纸；pH试纸；浓盐酸；乙醇；0.2mol/L pH 4.8醋酸-醋酸钠缓冲液。

⑵缓冲溶液的配制0.2mol/L pH 4.8醋酸-醋酸钠缓冲液（先配A液与B液）：A液：0.2mol/L醋酸钠溶液称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000mL。

B液：0.2mol/L醋酸溶液，取醋酸（含量大于99.8%）12 mL定容至1000mL。

取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.8的醋酸—醋酸钠缓冲液3000mL。

5操作步骤1）盐析法制备酪蛋白①将50mL牛乳倒至烧杯中，40℃搅拌；②方法一：在烧杯中缓缓加入10g无水硫酸钠，之后再继续搅拌10min；方法二：在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH 4.8的醋酸缓冲液100mL.用精密pH试纸或酸度计调pH至4.8。

③用细布过滤分别收集沉淀和滤液。

将沉淀放于30mL乙醇中倾倒于布氏漏斗中过滤除去乙醇溶液，抽干。

将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿中展开除去乙醇，干燥后得到酪蛋白。

准确称量。

2）等电点沉淀法制备乳蛋白素将操作1）所得到的滤液置于烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计测量酸度，并用盐酸调整pH至3。

生物物质分离工程实验实验须知：1、认真预习理解每个实验的目的、原理、操作关键步骤和注意事项。

2、按时上课，迟到20分钟以上者建议重做实验；上实验课时须带实验指导、记录本和笔等。

3、分组后应固定，不能随意更换，不大声喧闹，遵守实验室规则。

4、实验前由教师讲解实验原理、实验具体操作方法以及如何写实验报告。

5、每次实验结束，每组的实验用具要清洗，并却待老师检查实验结果后，方能离开实验室6、学生每次实验要写出规范实验报告，报告数据必须如实记录。

7、教师根据实验操作情况、打扫卫生情况、实验报告及最后考核给出成绩（总分100份）。

（说明：生物工程专业本课程实验总学时为32个，因此安排11个实验生物技术专业本课程实验总学时为16个，因此安排6个实验，做前6个实验）2012年2月实验一有机溶剂萃取法中pH对表观分配系数的影响（第一次实验）一、实验目的和要求1.通过实验，加深对表观分配系数的理解并掌握其测定方法。

22.以红霉素为实验对象，了解pH在萃取工艺中的重要性。

二、实验原理1•红霉素为大环内酯类抗生素，呈弱碱性，在不同pH条件下，在水溶液和有机溶液中溶解度不同，故能达到不同程度的分配。

表观分配系数是指在一定温度和压力下，当分配达到平衡时溶质在萃取相和萃余相中总浓度之比，可通过实验方法测定。

对于弱电解质，溶液的pH对表观分配系数影响很大。

一元弱碱性物质溶液pH对表观分配系数K的关系式见式（1-6-4）1+10pK-pH式中：K0――热力学分配系数，在一定的温度和压力下是常数pk——化合物电离平衡常数的负对数由上式可知，随溶液pH升高，K值增大，有利于红霉素萃取到有机溶剂中。

反之，K 值减小，可将红霉素从有机相反萃取到水相。

2.利用红霉素在冰醋酸中被浓盐酸水解后，与对二甲氨基苯甲醛形成有色物质，并在486nm波长处有最大吸收值的特性，可测定其化学效价，从而计算出表现分配系数。

三、实验器材与试剂（一）器材精密电子天平，60ml分液漏斗，分光光度计，恒温水浴锅，pH酸度计，移液管，烧杯，量筒，试管，50ml容量瓶，称量瓶和温度计等。

生物分离工程实验强调一下：下周一、二下午（3月31日、4月1日）一点半在生物楼411上实验，预习实验一、带讲义、不许迟到。

共5次课，缺席一次就没有成绩。

生物分离工程实验吴国峰郑春英二零一四年三月实验一凝胶色谱法分离蛋白质一、实验目的1. 掌握凝胶色谱的基本原理；2. 掌握凝胶色谱的基本操作；3. 了解物质在色谱柱中的洗脱行为与分配系数的关系。

二、实验原理本实验将蓝葡聚糖2000（分子质量2000kD ）、细胞色素c （分子质量17kD ）和DNFP-甘氨酸（分子质量0.5kD ）的混合物通过交联葡聚糖凝胶G-50（Sephadex G-50）的色谱柱，以蒸馏水为洗脱溶剂进行洗脱。

蓝葡聚糖2000分子量最大，全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，而未进入凝胶颗粒内部，因而洗脱速度最快，最先流出柱，其V e =V o 即K d =0。

DNFP-甘氨酸分子量最小，不被排阻而可完全进入凝胶颗粒内部，洗脱速度最慢，最后流出柱，其V e =V i +V o 即K d =1。

细胞色素c 分子量在上述二者之间，其洗脱速度居中。

可以从蓝、红、黄三种不同颜色直接观察到三种物质分离的情况，并通过洗脱体积计算V i 、V o 和各自的K d 。

d K 与e V 、0V 和i V 的关系见下式：d K 0e iV V V -= 式中 K d ——分配系数，表示其被排阻的程度，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关；V t ——柱体积，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积，在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床；V 0——外水体积，色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积；V i ——内水体积，因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，即分间隙的总和为内水体积，又称定相体积（不包括固体支持物的体积g V ）；V e ——峰洗脱体积，指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积。

通常情况下，0＜K d ＜1，当K d ＞1时，说明凝胶对组分有吸附作用。

《生物分离工程实验》课程教学大纲总学时：24 学 分：1.5理论学时：0 实验学时：24面向专业：生物工程 课程代码：B4100112先开课程：物理化学、化工原理等 课程性质：必修课执笔人：谭海刚 审定人：宫春波 孙庆杰第一部分：实验教学部分一、说明1、本门课程实验的性质任务、目的与要求本实验课程是对理论教学课程的验证，训练学生掌握生物分离工程最基本的操作技能， 了解生物分离的基本知识，加深理解课堂讲授的某些生物分离理论，同时，通过实验培养学 生观察思考、分析问题和解决问题的能力，培养学生实事求是、严肃认真的科学态度以及勤 俭节约、爱护公物的良好作风，为今后的学习和工作打下坚实的基础。

2、本门课程实验项目设置情况实验类型序号 实验名称学时必开选开验证基本操作综合性、设计性内容提要1 微生物细胞的破碎及分离4 √ √啤酒酵母的培养；超声波破壁（高压匀浆破壁或酶法破壁）；计算细胞破碎率。

2 牛奶中酪蛋白的制备及其等电点的测定4 √ √牛奶中酪蛋白的制备——离心去脂法和加热法；酪蛋白等电点的测定。

3 用 PEG/ （NH4） 2SO4双水相体系萃取糖化酶6 √ √不同比例双水相体系提取糖化酶；次碘酸盐法测定糖化酶活力。

4 糖化酶的分离纯化——分子筛层析脱盐6 √ √糖化酶的浸出； 硫酸铵盐析；分子筛层析脱盐；测定糖化酶活力。

5 离子交换树脂总交换容量的测定6 √ √用静态法和动态法测定阴、阳离子交换树脂的总交换容量。

6 氨基酸的分离鉴定——纸层析法4 √ √配制扩展剂和显色剂； 点样；展开；显色；计算 R f 值。

7 酵母 RNA的提取及 4 √ √ 浓盐法、稀碱法提取酵母定性和定量鉴定 ——浓盐法和稀碱 法 RNA；紫外分光光度计测定 酵母 RNA的含量。

8 薄层层析法分离鉴定糖分4 √ √配制扩展剂和显色剂； 制板；点样；展开；显色；计算 Rf值9用超滤技术分离和浓缩碱性蛋白酶 （糖化酶）8 √ √以碱性蛋白酶（糖化酶）粗品为料液超滤，同时进行超滤性能各项指标的研究，包括膜的水通量、截留率、超滤速度随透出液体积而变化的规律。

生物分离工程试验实验一、重组木聚糖酶的亲和层析纯化1、实验目的掌握His-tag亲和层析柱纯化蛋白的方法2、实验原理由xynB基因编码的木聚糖酶有很高的热稳定性，在90℃下保温2h，仍然有90%的活性，基于这一点，我们可以先用加热的方法除去酶液中的大部分不耐热的杂蛋白。

蛋白质表面的某些氨基酸残基如：组氨酸的咪唑基团，半胱氨酸的巯基，色氨酸的吲哚基团（后两种与金属离子的作用要小得多），可与金属离子亲和结合。

用螯合剂可以将金属离子（Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+）螯合到母体。

洗脱时，可以通过改变盐的浓度等降低金属离子与蛋白质的亲和力将其洗脱。

经典的如组氨酸标签-镍离子亲和柱子（His-tag）：组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。

洗脱的时候用高浓度的咪唑将蛋白洗下。

组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段。

在xynB 基因编码的C端，我们引物的编码六个组氨酸的CAC 密码子，使得重组酶带上组氨酸标签。

3、实验材料和设备A. 试剂Ni-NTA亲和层析介质5ml1X Charge buffer：50 mmol/L NiSO41X Binding buffer：5mmol/L 咪唑，0.5 mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl，最终pH调到7.91X Wash buffer：60mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl ，最终pH 调到7.91X Elute buffer：1 mol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl ，最终pH调到7.91X Strip buffer：100 mmol/L EDTA，0.5mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl ，最终pH调到7.9以上各成分的浓度为终浓度。

生物物质分离工程生物物质分离工程实验李菊娣编辽宁石油化工大学环境工程系二○○七年三月生物物质的分离、提取实验是以实验操作为主的技能课程，是生物工程专业学生的必修课，是在学习《分析化学》、《生物化学》《微生物学》、《发酵工程》、《生物分离工程》等专业基础课及专业实验课的基础上开设的课程。

目的在于通过本课程的实验训练，使学生对整个生物工程下游生产过程有一个全面的认识和理解，既可培养他们实际操作的技能，又可达到提高他们理论联系实际能力的目的。

通过学习，使学生能够掌握物质分离常用的纯化方法和常见的分离设备，为以后的学习和科研工作打下良好的基础。

实验一、微生物细胞的破碎及分离实验二、青霉素的萃取及萃取率的计算实验三、醋酸丁酯萃取红霉素实验四、牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备实验五、胰凝乳蛋白酶的制备实验六、薄层色谱法鉴定果汁中的糖实验七、离子交换法提取L-精氨酸备注：实验二、三选作其一；实验五、六选作其一。

实验一微生物细胞的破碎及分离一、实验目的与要求实验目的：1、掌握超声波细胞破碎的原理和技术，学习细胞破碎率的评价方法。

2、通过本试验使学生复习以前所学的分离知识及掌握微生物学实验、发酵工程实验技能，同时通过本试验使学生掌握超声波破碎仪的使用。

3、通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题的能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究打好基础。

实验要求：1、复习生物物质分离课程所学到的微生物细胞的分离方法，了解影响微生物细胞的破碎因素。

2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。

3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分析实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。

4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。

生物分离工程实验第二版课程设计一、引言生物分离工程是工程学中的一个重要研究方向，它旨在利用生物化学手段实现对某些生物大分子的分离和纯化。

其应用范围涵盖生物制药、生物材料、环境保护等众多领域。

生物分离工程实验是生物工程专业本科生的一门重要实验课程，该课程旨在培养学生的实验操作与计算分析能力，同时也要求学生具有科学研究异常与团队合作精神。

为进一步提升生物分离工程实验编写的教学质量，我们进行了第二版课程设计，有效地提高了生物分离工程实验课程的实践性并优化实验内容和实验报告撰写方法。

二、课程目标本课程旨在使学生掌握生物分离工程部分操作的基本原理、基本技能和相关设备的使用方法，了解有效的分离纯化媒介，掌握生物分离工程实验设计方法和接收产品的基本方法，进一步培养学生的主动性和团队协作精神。

三、课程内容生物分离工程实验分为基础篇和应用篇两部分。

1. 基础篇基础篇主要包含以下内容：•操作环境和安全措施•细胞的操作与保存•蛋白质的分离与纯化•谷氨酸的分离与纯化•脱水乳糖的分离与纯化•糊精的分离与纯化2. 应用篇应用篇主要包含以下内容：•生物质的制备与纯化•抗体的制备和鉴定•多糖的制备与分离•生物活性物质的制备四、教学方法为了保证本课程的实验效果，我们采用的教学方法是课程设计方法，并结合教学实践。

学生将按顺序进行各个实验项目，分析结果并完成实验报告。

在老师的指导下进行学会讨论。

五、实验结果与分析进行基础篇的实验后，学生需要进行基本符号、实验结果的计算和分析。

以分离纯化为例，在常State pH 7.0下通过离子交换将猪肝提取素分离纯化。

通过干燥后的薄膜的具体质量测定，通过计算获得猪肝制备物的回收率、总分离系数和精度。

在应用篇的实验后，学生完成了生物活性物质制备实验。

等离子体胰岛素后分离和纯化并通过电泳分析，克服了.2的电动势和纯化液中的污染物干扰下的情况，以获得高纯度，活性稳定的目标物质。

六、实验报告撰写要求学生需要完全自行完成实验报告的撰写过程，包括实验设计部分和实验操作部分。

大蒜细胞SOD酶的提取分离与活性测定一、实验目的1.掌握SOD酶的提取分离检测一般步骤2.了解酶在提取分离过程中的两个参数：回收率和纯化倍数二、实验原理超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。

它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。

离子(02-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。

作为药用酶、由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2∙-)而起到保护细胞的作用，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。

SOD的活力测定方法很多，常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。

其中化学法应用最普遍，化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2∙-，利用SOD分解而间接推算酶活力。

在化学方法中，最常用的有黄嘌呤氧化酶法，邻苯三酚法，化学发光法，肾上腺素法，NBT-还原法，光化学扩增法，Cyte还原法等。

其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。

在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。

本实验采用邻苯三酚自氧化方法。

邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。

当有SOD存在时，由于它能催化O2-与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出SOD的酶活性。

酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。

三、试剂和器材大蒜、冷丙酮、磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)、氯仿-乙醇混合液（3；5v/v)、邻苯三酚、浓盐酸、天平、石英砂、研钵、冷冻离心机、50mL离心管 8个、紫外-可见分光光度计、250mL三角瓶8个、玻璃棒8根、试剂瓶250mL 3个、500mL 3个、250mL烧杯16个、试管带胶塞80根、移液管各5根。