纤维素降解菌绿色木霉C_08的筛选及酶学特性研究

耐酸耐盐青霉和木霉产纤维素酶的研究的开题报告一、研究背景纤维素是植物细胞壁的主要成分，是天然的、丰富的可再生资源，具有广泛的应用前景，如生物燃料、食品工业、纺织品、造纸等领域。

然而，纤维素的结构特殊，难以被生物酶降解，是目前环保工业中的一个难点。

因此，研究纤维素酶的产生和作用机制对纤维素降解技术的发展具有重要的意义。

目前已知有许多微生物能够产生纤维素酶，其中包括青霉和木霉。

与其他微生物相比，青霉和木霉具有耐酸、耐盐等特性，适用于广泛的环境条件。

因此，研究耐酸耐盐青霉和木霉产纤维素酶的具体情况，对于研发高效、低成本的纤维素降解技术具有极大的意义。

二、研究目的1. 探究耐酸耐盐青霉和木霉对纤维素的降解能力。

2. 研究耐酸耐盐青霉和木霉产纤维素酶的菌株特性、菌株筛选、酶活性测定等问题。

3. 探究耐酸耐盐青霉和木霉的纤维素降解机制。

三、研究内容1. 菌株的筛选及鉴定本研究将从环境样品中筛选出一系列耐酸耐盐青霉和木霉的菌株，通过形态学、生理生化特征等方法进行初步鉴定。

2. 酶活性测定通过发酵培养、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法纯化纤维素酶，并测定酶活，确定最适酶活条件，并进行酶动力学研究。

3. 纤维素降解的研究通过质谱、核磁共振等手段，研究纤维素降解的机制，进一步了解纤维素的结构以及纤维素分解产物的组成。

四、研究意义1. 为纤维素降解技术的发展提供理论基础和技术支持。

2. 为研发高效、低成本的生物燃料、食品工业等领域的新产品提供参考。

3. 为开展生物多样性研究提供新的视角和方向。

五、研究方法1. 样品的采集及处理本研究将采集自然界中的样品，经霉菌分离纯化、快速扩增等步骤进行预处理。

2. 菌株的鉴定及筛选通过革兰氏染色、生理生化特性等方法对菌株进行初步鉴定，然后通过陶瓷稀释法、平板媒体筛选、发酵培养等方法进行菌株筛选。

3. 酶活性测定通过离子交换层析、凝胶过滤层析等方法纯化纤维素酶，并测定酶活，确定最适酶活条件，并进行酶动力学研究。

纤维素降解菌的筛选及其产酶特性杨艳;姜立春;林寿露;杨熙;彭显清;彭正松;阮期平【摘要】The optimal CY10 producing strain of enzyme producing conditions are the experimental basis for the biodegradation of cellulose.A cellulose - degrading bacterial strain was isolated from the rottenwood and its some important culture conditions and enzymatic properties were studied. The optimal enzyme producing condi-tions for this degrading bacterial strain were acquired as follows:wheat bran(as carbonsource)concentration 20 g / L,yeast powder(as nitrogens ource)concentration 5. 0 g / L,culture temperature 30 ℃,initial pH 6. 5,cul-ture time 42 h. The optimum temperature and optimal pH value for the activities of CMC enzyme and filter - paper enzyme produced by this degrading bacterium were 45 ℃ and 6. 5,resp ectively. Under these conditions,the CM-Case and FPase activity of CY10 strain were 21. 26 U/ mL and 23. 57 U/ mL,respectively. Therefore,the CY10 strain has a good prospect in the biodegradation of cellulose.%优化纤维素降解菌株 CY10产酶条件，为该菌株在纤维素的生物降解方面提供实验依据.通过单因素试验对 CY10菌株产酶条件进行优化，依据纤维素酶（CMCase）和滤纸糖化酶（FPase）活力大小确定最适培养时间、初始 pH、碳源、氮源、温度、接种量及装液量等.结果表明：菌株 CY10产酶的最适初始 pH 为6.5，碳源为麦麸（2.0%），氮源为酵母粉（0.5%），在30益培养42 h；该菌株所产 CMC 酶和滤纸酶的酶活性最适温度为45益，最适 pH 为6.5.在此条件下，CY10菌株的 CMCase 和 FPase 活力分别达到21.26 U/ mL 和23.57 U/ mL.为此，菌株CY10在纤维素的生物降解方面具有较好的应用前景.【期刊名称】《绵阳师范学院学报》【年(卷),期】2016(035)005【总页数】7页(P65-71)【关键词】纤维素降解菌;纤维素酶;培养条件;优化;酶学性质【作者】杨艳;姜立春;林寿露;杨熙;彭显清;彭正松;阮期平【作者单位】西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川南充637009; 绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006;西华师范大学西南野生动植物资源保护教育部重点实验室，四川南充 637009;绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室，四川绵阳 621006【正文语种】中文【中图分类】Q939.9纤维素是地球上分布最广泛、含量最丰富的可再生有机资源，其不断通过光合作用得以补充[1].在自然环境中，纤维素类物质形态稳定且降解缓慢，目前对其利用很不充分，除小部分用于堆肥、畜禽饲料外，大部分作为燃料直接燃烧，不仅造成资源浪费，同时也会污染环境[2].因此，人类对于纤维素资源的利用程度比较有限，还处在一种低值化、无序化状态[3].对纤维素降解问题的研究能够为解决环境问题和纤维素资源的开发利用问题提供重要的理论依据.如能科学合理利用纤维素不仅可以减少废弃物对环境的污染，还可以提供一种可再生资源.采用合适的方法与技术对这些可再生的纤维素资源降解为可利用的生物有机质，对解决当今所面临的食物短缺、能源危机和环境污染问题具有重大的现实意义[4].目前，对于纤维素分解菌选育应用研究较多的是细菌、放线菌与真菌，尤以曲霉、木霉和青霉较为普遍[5-8].我国是农业大国，秸秆是我国丰富的可再生资源，但是每年大部分的秸秆被焚烧和废弃，尤其是在东北地区，不仅造成资源的浪费，同时也造成严重的环境污染.因此，开发高效利用纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，具有极其重要的意义和发展前景.本研究综合利用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水解圈测定法和胞外酶活测定法，针对纤维素降解问题，进行了纤维素降解菌的筛选，并对其产酶条件优化及酶学性质进行了初步研究.1.1 材料1.1.1 样品采集腐烂的枝条与朽木.1.1.2 主要试剂及仪器羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、刚果红、DNS溶液，醋酸钠缓冲溶液，新华滤纸；可见光分光度计、高速低温离心机、超净工作台、恒温培养摇床、超低温冰箱等.1.1.3 培养基牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0，琼脂20.0，pH 7.2-7.4.羧甲基纤维素钠培养基(g/L)[9-10]：CMC-Na 10.0，KH2PO4 1.5，NaH2P O4·7H2O 2.5，MgSO4·7H2O 0.3，FeSO4·7H2O 0.005，ZnCl2 0.0017，MnSO4 0.001 6，(NH4)2SO4 1.5，pH 7.0.产酶发酵培养基(g/l)[9]：NaCl 5.0 g、K2HPO4 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl2 0.3 g，FeSO4·7H2O 5.0 mg，MnSO4 1.6 mg，ZnCl2 1.7 mg，CoCl2 2.0 mg，pH 调至7.2.以上培养基均121 ℃灭菌20 min.1.2 实验方法1.2.1 菌株的筛选用无菌生理盐水浸泡采集腐烂的枝条、朽木样品，在摇床振荡3 h.取样品悬液，用无菌水梯度稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的浓度，吸取稀释浓度为10-3、10-4、10-5的稀释液，涂布于羧甲基纤维素钠培养基上，置于30 ℃培养箱中培养36-60 h.将分离得到的纤维素降解菌点样接种到CMC-Na平板培养基上，30 ℃倒置培养48 h 后，向培养皿中加入适量1.0 mg/mL的刚果红染液，染色30 min，倾去染液，加入适量1.0 mol/L的NaCl溶液，浸泡30 min，依据透明圈与菌体直径比选择高产酶菌株[2].挑取高产菌落进行平皿划线分离，获得一系列单菌落，连续挑选优势单菌落多次划线直至获得各菌株的纯培养，将分离纯化后的菌株斜面接种于牛肉膏蛋白胨培养基上培养2-3 d，观察菌落形态.最后将菌种于斜面上，4 ℃冰箱保存待用.1.2.2 酶活性测定(1)CMC酶活性测定[2, 11]：菌液在4 ℃、8 000 r/min的条件下离心10 min，取0.5 mL上清液(粗酶液)，加入0.5 mL 0.2 %羧甲基纤维素钠(CMC-Na)底物溶液，50 ℃恒温水浴锅中温育1h，然后加入2 mL DNS试剂，再100 ℃沸水浴10 min终止反应，室温冷却后在520 nm下测定光吸收值，酶液沸水浴处理10 min 后作为阴性对照，每个样品做3个平行.(2)滤纸糖化酶(FPase)的测定[12]：菌液在4℃、8 000 r/min的条件下离心10 min，取0.5 mL上清液(粗酶液).将新华滤纸剪成规格为1cm×6cm的长条，放入试管中，取粗酶液1 mL，加入醋酸缓冲液2 mL，50 ℃恒温水浴50 min后取出，加入2mL DNS试剂终止反应，摇匀后于沸水浴中煮沸显色5 min，取出室温冷却后，按DNS法在520 nm下测定光吸收值进行还原糖测定，酶液沸水浴处理10 min后作为阴性对照，每个样品做3个平行.1.2.3 酶活定义酶活力单位定义：每毫升酶液在1 min内催化底物生成1 μg葡萄糖所需要的酶量，即1 U/mL.酶活力计算公式：Y=(A×V×1 000)/(0.5×T)，式中A：从标准曲线查出净葡萄糖的浓度(g/L)；V：总体积；0.5：测定时吸取粗酶液的毫升数；T：反应时间.1.3 培养条件的优化1.3.1 培养时间从6 h开始测量酶活，间隔6 h取样1次，30 ℃、150 r/min 摇床培养60 h，分别测CMC酶活性及滤纸酶活性.1.3.2 碳源及其浓度对产酶活性的影响碳源条件优化，以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、麦芽糖、乳糖、麦麸、葡萄糖、蔗糖、微晶纤维素(Avicel)和玉米粉作为唯一碳源，30 ℃、150 r/min摇床培养36 h，分别测CMC 酶活性及滤纸酶活性.在碳源确定的基础上，试验分析碳源浓度为5、10、20、30、40、50 和60 g/L的条件下，30 ℃、150 r/min摇床培养36 h，分别测CMC 酶活性及滤纸酶活性.1.3.3 氮源及其浓度对酶活性的影响在碳源及其浓度确定的基础上，试验考察胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、NH4Cl、NaNO3、(NH4)2SO4、NH4NO3、KNO3和尿素作为唯一氮源，30 ℃、150r/min摇床培养36 h，分别测CMC酶活性及滤纸酶活性.在氮源源确定的基础上，试验分析氮源浓度为1、3、5、7、9和12 g/L的条件下，30 ℃、150 r/min摇床培养36 h，分别测CMC 酶活性及滤纸酶活性.1.3.4 初始pH对酶活性的影响在碳源及氮源确定的基础上，试验考查初始pH梯度为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，30 ℃、150 r/min摇床培养36 h，分别测CMC酶活性及滤纸酶活性.1.3.5 培养温度对酶活性的影响在碳源、氮源及初始pH确定的基础上，试验考察培养温度为15、20、25、30、35和40 ℃，150 r/min摇床培养36 h，分别测CMC酶活性及滤纸酶活性.1.3.6 接种量对酶活性的影响在碳源、氮源、初始pH及培养温度确定的基础上，试验考察分别接种不同的菌量(0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL)，经发酵36 h后，分别测CMC 酶活性及滤纸酶活性.1.3.7 装液量对酶活性的影响在碳源、氮源、初始pH、培养温度及接种量确定的基础上，试验考察分别接种不同的装液量(25、50、75、100、125 mL)，经发酵36 h 后，分别测CMC酶活性及滤纸酶活性.1.4 酶学性质研究1.4.1 最适温度最适发酵培养条件下得到的粗酶液，将反应体系的温度分别设定为30、35、40、45、50、55、60和70 ℃，测定粗酶液在不同反应温度下的CMC酶活性和滤纸酶活性.1.4.2 最适pH最适发酵培养条件下得到的粗酶液，将反应体系的pH值分别调到5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，在最适反应温度条件下反应30 min，分别测CMC酶活性和滤纸酶活性.2.1 纤维素降解菌的筛选经过初筛培养获得大量纯培养菌株，在刚果红纤维素培养基上经刚果红染色后，以培养72 h后透明圈直径与菌落直径之比大于2为筛选标准，共有3株菌株有水解圈步筛选得到3株纤维素降解菌，其中菌株CY10透明圈直径与菌落直径最大为5.36，再液体培养测CMC酶活性和滤纸酶活性3.35 U/mL和4.63 U/mL，最终确定酶活性最高的菌株CY10为研究菌株.2.2 发酵条件对纤维素降解菌产酶活性的影响2.2.1 培养时间按照方法1.3.1对产酶时间进行优化.酶活性测定结果如图1所示，该菌培养6 h 即可检测到酶的产生，随着培养时间的延长，发酵液中CMC酶活性和滤纸酶活性逐渐增强.当培养到42 h时，CMC酶和滤纸酶活性达到最高值，分别为2.70U/mL和4.02 U/mL；后随着培养时间的延长，发酵液中CMC酶和滤纸酶活性反而呈下降趋势.因此，CY10菌株最适培养时间为42 h.2.2.2 碳源按照方法1.3.2，分析碳源对产酶的影响，在发酵培养基中分别加入1.0 %不同的碳源，考察碳源对产酶的影响，其结果如图2所示.碳源是维持菌体细胞生长和代谢的重要能源物质[2].当碳源为麦麸时，CMC酶和FPA酶活性均达到了较高的酶活性，分别为4.61 U/mL和6.52 U/mL；当乳糖、葡萄糖、麦芽糖和微晶纤维素作为碳源时，CMC酶活性和滤纸酶活性都较弱，均低于3.0 U/mL.因此，选用麦麸作为该菌培养的最适碳源.为确定碳源不同浓度对酶活性的影响，分析了麦麸浓度不同梯度对产酶活性的影响.结果见图3所示，随着麦麸浓度的增加，该菌的CMC酶活性和滤纸酶活性逐渐升高，当其浓度为20 g/L时，滤纸酶活性和CMC酶活性达到最高值，分别为4.6U/mL和6.2 U/mL当麦麸浓度高于2.0 %时，CMC酶活性和滤纸酶活性均有所降低.因此，选用20 g/L作为该菌培养时的最适碳源浓度.2.2.3 氮源按照方法1.3.3，分析氮源对产酶的影响，在发酵培养基中分别加入0.3 %不同的氮源，考察氮源对产酶的影响，其结果如图4所示.微生物的生长代谢离不开氮源，氮源是组成蛋白质和核酸的主要物质.当氮源为无机氮如(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl和NaNO3时，CMC酶活性和滤纸酶活性均较弱，且低于2.0 U/mL；当氮源为有机氮时，该菌发酵液的CMC酶活性和滤纸酶活性相对于无机氮来说均有明显的增高，当酵母粉作为氮源时，CMC酶活性和滤纸酶活性都达到最高，分别为3.23 U/mL和3.86 U/mL.因此，选用酵母粉作为该菌的最适培养氮源.为确定氮源不同浓度对酶活性的影响，分析了酵母粉浓度不同梯度对产酶活性的影响.结果见图5所示，随着酵母粉浓度的增加，该菌的CMC酶活性和滤纸酶活性逐渐升高，当其浓度为5.0 g/L时，滤纸酶活性和CMC酶活性达到最高值，分别为9.65 U/mL和10.52 U/mL；当酵母粉浓度高于0.5 %时，CMC酶活性和滤纸酶活性均有所降低.因此，选用5.0 g/L作为该菌培养的最适氮源浓度.2.2.4 初始pH不同的微生物对pH条件的适应范围与能力都有所不同，为此按照方法1.3.4分析不同初始pH对菌株CY10产酶活性的影响.酶活性测定结果见图6所示，当初始培养pH低于5.5时，不利于酶的生产；当pH在5.5-7.5时，该菌生产的CMC酶活性和滤纸酶活性相对较高，当pH为6.5时，产酶活性达到最高分别为14.56 U/mL和18.23 U/mL；当pH大于6.5时，随着初始pH的升高，该菌生产的酶的CMC酶活性和滤纸酶活性都呈下降趋势；当pH高于8.5对酶活力造成很大影响.因此，选用pH6.5作为该菌初始培养的pH.2.2.5 培养温度按照方法1.3.5分别设计在不同培养温度条件下培养，见图7.结果表明，在15-30 ℃范围内，酶活性随着温度的升高而不断增大，当温度升至30 ℃时，菌株CY10达到最大的产酶能力，CMC酶活性和滤纸酶活性分别达到17.88 U/mL和19.35 U/mL，当温度升高到35 ℃以后酶活开始快速下降，这可能是由于随着温度的上升，酶结空间构受到影响，导致酶活降低.微生物都在一定的温度范围之间生长和繁殖会较快，在最适培养温度下，生长繁殖最快.因此，选择30 ℃作为产酶的最适温度.2.2.6 接种量按照方法1.3.6分别接种不同的菌量，经发酵培养后测其酶活，结果见图8.当接种量在0.2%-1.0%(0.1-0.5 mL/50mL)范围内，随着接种量增加，菌株产酶活性上升较快；在接种量为1.0%-8.0 %范围内，随着接种量增加，酶活性增加缓慢，当接种量为8.0 %时，CMC酶活性和滤纸酶活性最大，分别为20.28 U/mL和21.13 U/mL；当接种量高于8.0 %时，酶活呈下降趋势.因此，选择8.0 %作为产酶的最适接种量.2.2.7 装液量按照方法1.3.7分别在摇瓶内设置不同装液量，发酵培养后，见图9.结果表明，随着装液量增加其酶活逐渐升高，当装液量达到为50 mL/250 mL时，菌株CY10 CMC酶活性和滤纸酶活性达到最大值分别为18.39 U/mL和19.89 U/mL；当装液量高于50 mL时，其产酶活性逐渐降低，装液量增加到一定程度不利于CY10对酶的合成和分泌，其生长和代谢活动不能获得充足的氧气供应，因此酶活性降低.因此，选择50 mL/250 mL作为产酶最适装液量.2.3 酶学性质研究2.3.1 温度按照方法1.4.1，考察温度对酶反应的影响，见图10所示.该菌株CY10在30-45 ℃期间，随着温度的升高酶活性逐渐升高，在45 ℃生产的CMC酶和滤纸酶最适反应达到最大分别为19.56 U/mL和21.35 U/mL；当温度高于45 ℃，随着温度的升高，滤纸酶活性和CMC酶活性都急剧下降；到温度为70 ℃时，CMC酶活性和滤纸酶活性都为都降到最低为5.82 U/mL和6.86 U/mL.因此，CMC酶活性和滤纸酶反应最适温度为45 ℃.2.3.2 最适pH按照方法1.4.2，考察pH对酶反应的影响，见图11所示.随着反应液pH 的升高，该菌滤纸酶和CMC酶的逐渐升高，当pH为6.5时，滤纸酶活性和CMC酶活性最高分别为20.96 U/mL和22.58 U/mL；反应液pH继续升高后，滤纸酶活性和CMC酶活性明显下降.因此，该菌株CMC酶和滤纸酶反应的最适pH为6.5.采用微生物降解纤维素是纤维素再生资源利用的较好方式，本研究从腐朽木材或枝条中分离到1株活性较高纤维素降解菌，并对其培养条件和酶学性质进行了研究.研究结果表明，该菌株最适培养条件为：碳源麦麸(2.0 %)，氮源酵母粉(0.5 %)，培养温度30 ℃，培养pH6.5，培养时间42 h，接种量8.0 %，装液量50mL/250 mL；该菌株CY10所产滤纸酶和CMC酶，酶活性最适温度为45 ℃，最适pH为6.5.【相关文献】[1] Adsul MG,Bastawde KB,Varma AJ,et al.Strain improvement of Penicillium janthinellum NCIM 1171 for increased cellulase production[J].Bioresource Technology,2007,98(7):1467-1473.[2] 郝月,杨翔华,张晶,等.秸秆纤维素分解菌的分离筛选[J].中国农学通报,2005,21(7):58-60.[3] 钟国祥,姚健,张诚,等.纤维素降解菌的筛选及其酶学性质研究[J].江西农业学报,2015,27(6):85-89.[4] 徐昶，龙敏南，乌小兵，等.高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究[J].厦门大学学报:自然科学版,2005,44 (1):107-111.[5] 宋颖琦,刘睿倩,杨谦,等.纤维素降解菌的筛选及其降解特性的研究[J].哈尔滨工业大学学报,2002,34(2):197-200.[6] 郭建华,奚家勤,宋纪真,等.纤维素降解菌哈茨木霉TC10-13产酶条件优化[J].南方农业学报,2015,16(1):79-84.[7] 陈兴,王文元,汪显国,等.烟叶纤维素降解菌的筛选、鉴定及其产酶条件优化[J].云南大学学报(自然科学版),2015,37(2):323-328.[8] 刘韫滔,淑霞,龙传南,等.纤维素降解菌L-06的筛选、鉴定及其产酶条件的分析[J].生物工程学报,2008,24(6):1112-1116.[9] Yan-Ling Liang,Zheng Zhang,Min Wu,et al.Isolation,Screening,and 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一株纤维素降解细菌的筛选、鉴定及特性研究刘洁丽;王靖;李明【摘要】以羧甲基纤维素钠 (CMC-Na)为唯一碳源,首次从被微生物蚕食的柠檬叶样品上,筛选得到一株对木质纤维素具有明显降解效果的细菌,通过形态学和分子生物学研究,鉴定其为枯草芽孢杆菌,命名为L13;并研究了温度和pH值对菌株产酶的影响.结果表明,在pH值为5.0、50℃的最佳产酶条件下,CMCase 酶活最高达到5.21 U·mL-1.对扩大纤维素降解微生物的筛选和应用范围具有重要意义.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2010(027)004【总页数】3页(P54-56)【关键词】纤维素酶;降解;羧甲基纤维素钠;酶活;枯草芽孢杆菌【作者】刘洁丽;王靖;李明【作者单位】中国石油大学(北京)化学科学与工程学院,北京,102249;中国石油大学(北京)化学科学与工程学院,北京,102249;中国石油大学(北京)化学科学与工程学院,北京,102249【正文语种】中文【中图分类】Q939随着现代工业的发展、世界人口的增长，化石能源对环境造成巨大危害，人类越来越意识到寻找清洁可再生能源的迫切性。

来源于生物质原料的燃料乙醇以其可再生性、无污染性、不引起温室效应等特点而被公认为最有工业应用前景的可再生能源之一，因而得到了广泛的研究。

我国的纤维素资源非常丰富，仅农作物秸秆，每年就达6～10亿t[1]。

近年来，对秸秆类纤维素物质的利用主要采用生物法，即利用微生物将纤维素、半纤维素降解并转化为菌体蛋白[2]，所以分离和筛选高效产酶的菌种显得极其重要，但目前所筛选的高效纤维素降解菌多为真菌，生长较慢，且菌体产色，不适于工业应用。

作者在此筛选出一株可利用玉米种皮纤维作为底物、高效产纤维素酶的细菌，对扩大纤维素降解菌种的筛选和应用范围具有重要意义。

1 实验1.1 材料与试剂柠檬叶样品：自然界采集，用生理盐水清洗，风干后处理成小段，备用。

羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液：称取1 g CMC-Na，加入100 mL水，水浴加热使溶解，再加入pH值5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液20 mL、水40 mL混匀，即得CMC-Na溶液。