原核诱导表达汇总

原核诱导表达的标准操作程序（SOP）一．目的：使本实验室工作人员了解诱导表达的操作过程，并能实际动手进行原核诱导表达一系列实验。

二．适用范围：本SOP适用于对新基因克隆的表达，并针对新基因产生的可溶性蛋白。

三．实验原理：E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。

I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。

在启动序列P上游还有一个代谢物基因激活蛋白（CAP）结合位点。

由P序列、O序列和CAP 结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。

在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。

此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P 序列结合，抑制转录起动。

当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导。

在这个操纵子体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。

乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。

后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。

异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

四、试剂准备:（一）实验器材的灭菌：枪头的灭菌：1mL，200µL，20µL的枪头放入枪头盒，用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。

80℃烘箱中烘干，常温放置。

螺口管及离心管的灭菌：将螺口管和离心管分别放入铝制饭盒中（盖子要拧松，离心管的管盖打开），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。

80℃烘箱中烘干，常温放置。

50mL离心管的灭菌：将50mL离心管用报纸包住（2层），放入高压灭菌锅中灭菌，121℃，20min。

80℃烘箱中烘干，常温放置。

（二）LB培养基的配制液体LB培养基（1L）：蛋白胨10g氯化钠10g酵母提取物5g 调PH值到7.5，高压灭菌，4℃保存。

固体LB培养基（1L）：蛋白胨10g氯化钠10g酵母提取物5g琼脂粉15g高压灭菌，不烫手的情况下加入抗性，抗性：培养基=1：1000（氨苄，卡那通常浓度），混匀。

马上在无菌操作台中倒平板，并开大风吹干。

用封口膜封住，倒置放于4℃保存。

（三）1M IPTG的配制：经过计算，10g IPTG可以配42ml的1M IPTG。

买来的粉末状的IPTG一般全部配成1M IPTG。

1、无菌操作台紫外线照射，后通风。

2、用少量去离子水将IPTG溶解完全，并定容。

3、在无菌操作台中，用0.22µm的滤器将配好的IPTG滤入灭菌后的1.5ml离心管中，过滤除菌，-20℃保存。

注意事项：在用滤器将IPTG滤入离心管时，先用针头吸IPTG，然后将枪头拔掉，排出气体，滤头加入IPTG液，在使针管与滤器相连，保证整个装置无气体进入。

滤的过程中，手不能碰滤头。

（四）3×SDS-PAGE loading buffer的配制：1．将除BPB以外的药品完全溶解。

SDS常温下很难溶解，可以在37℃水浴溶解。

完全溶解后，再加入BPB，进行溶解。

2．把溶好的buffer分装到1.5ml的离心管中，1ml/管，常温放置。

3．使用前，每管加入30µL巯基乙醇。

注意事项：巯基乙醇为危险品，加入的过程在通风橱中完成，并且带好手套。

（五）10×PBS的配制：用去离子水将以上药品进行溶解。

（溶解的非常慢，可能需要过夜）调PH值到7.2，用0.4µm的滤膜过滤。

常温保存。

工作时用的是1×PBS。

1．用200ml去离子水将Tris溶解。

2．用浓盐酸调PH值到8.8。

3．调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。

4．0.4µm的滤膜过滤，常温保存。

注意事项：Tris的缓冲能力很强，调PH值时，费些时间，但不要调过。

1．用200ml去离子水将Tris溶解。

2．用浓盐酸调PH值到6.83．调好PH的Tris-Hcl定容到250ml。

4．0.4µm的滤膜过滤，常温保存。

1．把药品用去离子水溶解后定容到250ml。

2．用滤纸过滤，放在棕色瓶子中，4℃保存。

注意事项：两种药品有毒性，配制过程要带手套和口罩。

（九）10%SDS的配制：1．1g SDS加入10ml去离子水进行溶解。

2．分装到1.5ml离心管中，-20℃保存。

（十）10%过硫酸铵的配制：1．1g 过硫酸铵加入10ml去离子水进行溶解。

2．分装到1.5ml离心管中，-20℃保存。

（十一）5×SDS-PAGE电泳缓冲液的配制：将以上药品用去离子水溶解后定容到1L，常温保存。

工作时用的是1×SDS-PAGE 电泳缓冲液。

（十二）考马斯亮蓝R-250染色液的配制：考马斯亮蓝R-250染色液1L1．往1g考马斯亮蓝R-250中加入250ml异丙醇，在磁力搅拌器上搅拌六小时以上。

2．加入650ml去离子水，磁力搅拌器搅拌过夜。

3．再加入100ml冰醋酸进行溶解，磁力搅拌器搅拌。

4．在通风橱内用滤纸进行过滤。

常温保存。

染色液只能反复用两次。

注意事项：在磁力搅拌器上搅拌时，要把容器封口。

（十三）脱色液的配制：常温保存。

四．实验步骤：（一）：质粒的转化1．使用无菌操作台之前先用75%的酒精擦拭，然后将灭菌的培养基以及所有要用到的器具放到超净台上，在开紫外照射30min左右。

操作之前，关掉紫外，打开通风橱，将手用酒精擦拭后开始操作。

2．从-80℃的冰箱中取出表达菌（BL21）的感受态细胞（每管100µL），在-80℃冰水中融化。

3．载体（PET32a等）与基因片段的连接后质粒1µL，缓慢的加入到100µL BL21感受态中，冰置15min。

（无菌操作）3．42℃下热激90s，随后在冰水中冰置5min。

4．涂板：先将涂布棒用酒精棉球擦，然后用酒精灯火焰烧，放置等它凉却。

把处理后的感受态点在含有抗性的固体培养基（氨苄或卡那等）上。

用冷却的涂布棒进行涂布，左手把该盖拿起，小指轻轻转动培养基，右手来涂，涂到培养基表面快干。

（无菌操作）5．放在37℃培养箱中，倒置培养过夜。

注意事项：1．质粒的转化时，质粒是冻在-20℃的冰箱中，等它完全化了在进行吸取，往感受态中加入质粒时，一定要缓慢，因为感受态非常脆弱，防止感受态受伤。

2．质粒的转化时，热激的时间90s，一定要控制好时间。

3．质粒的转化时，涂布棒在涂布前，一定要晾凉涂布棒。

防止感受态被烫死，或固体培养基的损坏。

（二）：挑菌与接菌：1．无菌操作台紫外线照射，后通风。

将转化后的平板取出。

2．在无菌操作台中，把消毒后的螺口管（一般一个基因取四个螺口管，进行平行实验）取出，在酒精灯的外焰上灼烧螺口管管口。

3．灭菌后的LB培养基从冰箱中取出，在酒精灯的外焰上烧一下培养基瓶口。

吸取LB 培养基（一般5.5mL）加入螺口管中，后加入抗性（氨苄霉素、卡那等）。

氨苄霉素（卡那）：LB培养基=1:1000（5.5µL），抗性由载体决定。

4．镊子用酒精棉球擦拭，并在酒精灯的外焰上灼烧，将镊子晾凉。

用晾凉的镊子，夹取20µL小枪头，在转化后的平板上挑取单菌落，扔到培养基中。

5．接好菌的螺口管，进行摇菌。

37℃，180rpm。

摇到菌的对数期（OD600值0.4-0.6），时间大概2-3h。

可以模糊看到手即可。

（注意不要摇过）6．用完的平板用封口膜封住，倒置放于4℃保存。

7．若直接用菌液进行接菌，接菌比例为，菌液：LB培养基=1：100。

注意事项：1．接菌吸培养基时，把放置培养基的三角瓶倾斜才吸取培养基，移液枪尽量不要插进三角瓶中。

2．接菌时一定要加入抗性，挑菌落时，要挑单个的菌落，且不要把培养基也扣起来。

3．摇菌不要过了它的对数期，2小时后随时注意其生长状态。

（三）小量保菌：1．无菌操作台紫外线照射，后通风。

2．将摇到标准OD值的菌液进行小量保菌，先在酒精灯的外焰上灼烧螺口管管口。

3．保菌：从灭菌的饭盒中取出4个1.5ml的灭菌的离心管，加入50µL的灭菌后的80%的甘油，并分别加入相应的350µL菌液。

一个基因的四个平行实验菌都要进行保菌。

（若不保菌，实验不能进行重复，只能从头做）4．标清保菌的类别，名称，时间，如“BL21 PET32a V A V 1号2010.7.14”,其中的1号是平行对照中它排几号。

5．混匀，-20℃保存。

注意事项：1．在小量保菌中，一个基因的四个平行对照都要保菌，否则得重新摸条件。

2．在小量保菌中，菌液与甘油一定要混匀在保存，否则菌会被冻死。

（四）蛋白诱导表达条件摸索1．无菌操作台紫外线照射，后通风。

2．小量保菌后的四个平行实验组，分别加入不同终浓度的IPTG，在不同的温度条件下进行诱导（如下图）：（五）小量收菌1．将诱导完成的四个平行实验组菌液，分别取出1mL，对应装于4个不同的1.5ml离心管中并做好标记。

剩余的平行实验组菌液放入4℃保存。

2．离心7000rpm，2min，使菌沉淀。

3．把上层培养基倒掉，用1ml 1×PBS把表达菌重悬，再次离心7000rpm，2min，使菌沉淀。

4．把上层1×PBS倒掉，再次离心同步骤3。

5．用80µL 1×PBS把表达菌体重悬。

6．在四个平行的重悬液中，分别加入80µL 3×SDS-PAGE loading buffer。

（把3×SDS-PAGE loading buffer当成2×SDS-PAGE loading buffer用）7．煮样8min。

（打开锅盖煮）8．离心13000rpm,10min。

吸上清。

9．进行SDS-PAGE电泳。

注意事项：在煮样时要打开锅盖煮，防止小样进水，若样进水，则不能再用。

（六）SDS-PAGE胶的配制1．分离胶的配制（1）找出配套的胶板，用擦镜纸擦干净，并固定在配胶器上。

随后用去离子水试漏。

（2）若胶板不漏水，就进行分离胶的配制。

依次将水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-Hcl（PH 8.8）、10%SDS、10%过硫酸铵加到干净的小烧杯中（如下图），混匀。

（1mm的胶板，一般配一块胶用5ml。

所配的胶浓度一般为12%，但浓度也要视情况而定。

蛋白越小，胶的浓度越大。

）（3）将胶板中的水倒掉，并用滤纸吸干水分（不要将滤纸塞到胶板底部）。

（4）小烧杯中再加入TEMED，混匀。

（TEMED可使胶凝固，所以最后加）（5）灌胶：混匀的分离胶沿着胶板边缘轻轻灌下，防止产生气泡。

（6）用水将分离胶压平。

（用水灌满，同时加水时要缓慢加入，防止把胶吹起）2．浓缩胶的配制（1）待分离胶与水中间形成明显的横线，即分离胶凝固。