原核表达系统
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一．表达系统：
基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。
据受体细胞的不同可分为：
1．原核表达载体系统：
将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达合
成基因产物的体系。 2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达。
二．原核生物基因结构和表达特点
1． 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续
进行。
2． 原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。（图）
多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）：即可作为两个或多个肽链翻译模板的
mRNA。
3． 一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统。
4． 原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。 操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗
传单位。
1） 原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。共同协调作用，
完成某一多肽的表达调控。
2） 包括 调控区：调节基因，启动基因，操作基因。 结构基因：
5． 原核生物中参与转录的基因结构：
1） 启动子：是DNA上的一段序列，是RNA聚合酶识别并结合部位。
。各种不同的原核细胞其启动子各有不同，但均含有下列两个高度保守区（富
含AT：易变性解离为单链，为RNA合成提供模板） （1） TATA box（-10区，pribnow box）：转录启始点上游10bp处一
段富含AT的碱基 TATATTA
（2） -35区：长度和顺序个体间差别很大，富含AT是RNA聚合酶
识别位点。
转录的启始：RNA聚合酶首先识别启动子的-35区并结合至启动子上，然后开始滑向转录起始点，到-10区时，RNA聚合酶与启动子结合更牢
固，并继续向前滑行，大约6-7bp后开始转录（转录起始位点）。
。即RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不转录（图）
。各种启动子启动转录能力不同。
。启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列。 （3） 终止子（teminator）:基因/操纵子3‘-末端的特殊序列参与终
止转录的功能。
。组成 GC富含区：2个互为回文对称。
AT富含区：
。转录终止机制：终止子转录后的m RNA形成茎环结构，RNA聚合酶在此停止移动，释放mRNA，并脱离DNA。 6． 与转译有关的原核结构：——核糖体结合位点
（1） 转译起始密码子AUG。
（2） SD顺序（shine-dalgarno）(图) 。AUG上游3-11 bp
.。长约3-9bp。
。 mRNA上与30s核糖体亚基间的识别与结合序列（与30s核糖体上16sr
RNA的3‘末端互补）
三．外源基因在原核表达系统中表达的必要条件： 1． 删除内含子和5’-非编码区
2． 外源基因置于强启动子和SD顺序控制下
3． 维持正确开放阅读框架（ORF）
4． mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解
四．影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素： 1． 启动子：建立表达载体时，选择强启动子。
常用强启动子有：
（1） Lac（1961）：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG（异丙基-β -D-
硫代半乳糖苷）的诱导，以此启动子，受体菌必须带Lac I
基因，将其直接插入载体。 （2） Trp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。受两种调控：色氨酸
的负调控：色氨酸可活化阻遏蛋白—封闭基因
衰减子：操纵子操纵基因与结构基因间的一段碱基，色氨
酸丰富时，多数RNA聚合酶分子在此停止链的延伸。反之，
可继续延伸。 （3） Tac 启动子：Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。
（4） PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体
CI基因负调控。CI基因编码温敏蛋白。此蛋白在28-32℃
时，有活性，可结合操纵基因，抑制转录进行。温度升至
42℃时，蛋白失活，转录开始。以带CI基因的E。coli 为受体菌。
。强启动子易使质粒不稳定，可在其下游安装一终止子。
2． 基因剂量：
3． 核糖体结合位点：
（1） SD顺序与16srRNA3‘末端互补程度。 （2） AUG—SD间距离。
（3） AUG后的核苷酸。
四．原核表达载体：
要成功表达外源蛋白，关键是基因的克隆和表达载体的构建。
（一）原核表达载体： 1． 表达载体：适用于在受体细胞中表达外源基因的载体。
2． 主要元件：强启动子
SD顺序
筛选标志
其它调控基因 3． 类型： （1） 融合型表达载体：----融合蛋白
（2） 非融合型 ：---天然完整蛋白
（3） 分泌型 ：----产物可跨膜分泌至胞周间隙 （二）融合型表达载体：
1． 技术关键：克隆基因插入原核序列近3’端而维持正确阅
读框架。
（1） 选择合适酶切位点：
（2） 加人工合成的DNA接头 （3） 构建位相载体
2． 优点：表达效率高
产物稳定
易鉴定，纯化
鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定 纯化：利用融合原核多肽的特性
制备多抗
3． 举例
（三）非融合型表达载体：
1． 主要元件：强启动子 SD：若克隆基因本身具备，则可省去。
ATG：第一个密码子
2． 举例：
（四）分泌型表达载体：
1． 主要元件： 信号肽序列 SD下游
编码信号肽，可引导蛋白跨膜
2． 优点：分泌表达，避免降解。
五．外源基因的表达：
原核表达系统中只要成功构建含外源基因的表达载体，然后以转导/转化方式将载体导入原核细胞，外源基因就会在调控元件控制下转录表达。
提高表达水平的手段
1． 载体 强启动子----提高转录水平
核糖体结合位点（ATG---SD）
避免降解 分泌/融合表达 细菌蛋白酶抑制剂
3． 宿主 Lac 启动子----LacI菌 PL/PR -------- CI857 溶源菌
特殊菌株：L on 缺陷型（缺乏合成蛋白酶所必需的次黄嘌
呤核苷（Lon） 4． 表达方式：
诱导方式 PL/PR的温度诱导
IPTG的化学诱导
六．表达产物的检测：
破碎细胞后（经初提）检测： （一） 特异性鉴定： 1． 荧光抗体法
2． 免疫沉淀法
3． 免疫印迹法 4． ELISA
（二）生物学活性鉴定
