中国畜牧兽医 2024,51(4):1706-1716C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 大口黑鲈源豚鼠气单胞菌的分离鉴定及全基因组分析王迎平1,赵静贤1,尚佳富1,郝成森1,左妤祺1,朱桓奕1,冯旭东1,徐婷婷2,倪兴维2,刘 霞2,杨晓伟1,3,曹蓝云1,张立武3,谭昌藩4,曹礼静5,赵光伟1,3(1.西南大学动物医学院,重庆402460;2.贵州省动物疫病预防控制中心,贵阳550008;3.重庆三杰众鑫生物工程有限公司,重庆402460;4.重庆市巫山县职业教育中心,重庆404799;5.重庆市荣昌区职业教育中心,重庆402460)摘 要:ʌ目的ɔ探究患病大口黑鲈的致病菌及其主要生物学特性,为临床疾病防控提供技术支撑㊂ʌ方法ɔ首先对发病大口黑鲈进行病理组织学观察,进而利用平板划线法分离细菌,通过革兰染色㊁生化试验和16Sr D N A 序列测定对分离菌进行鉴定,通过致病性试验观察分离菌对小鼠主要脏器造成的病理损伤;而后分别利用P C R 方法和K i r b y -B a u e r (K -B )纸片法对分离菌的常见毒力基因和耐药特征进行检测分析;最后利用二代测序技术绘制其全基因组草图,并通过生物信息学方法对其分子特征进行解析㊂ʌ结果ɔ自然感染大口黑鲈肝细胞肿大,空泡变性,肠黏膜下层出血,肠壁坏死;于患病黑鲈体内分离到1株优势菌,在血平板上呈乳白色,半透明,直径约1m m 的小菌落,呈β溶血,革兰染色为阴性短杆菌,两端钝圆,经生化试验和16Sr D N A 测序证实分离菌为豚鼠气单胞菌(A e r o m o n a s c a v i a e ),将其命名为S C M S ㊂试验小鼠接种后24h 内死亡率为100%,病理特征与自然感染大口黑鲈相似;S C M S 株中共检测到9种毒力基因,分别为A h a ㊁A h p ㊁A e r ㊁A l t ㊁g c a T ㊁A c t ㊁E x u ㊁E l a 和e p r C A I ;药敏试验结果显示,分离菌对大多数四环素类㊁大环内酯类药物表现耐药或中度敏感;全基因组测序显示,分离菌全长4329602b p ,G C 含量为61.5%,基因组信息在G e n B a n k 中的登录号为J A R F U Q 000000000,相似性分析显示分离菌与人源㊁食品源豚鼠气单胞菌具有高度相似性;病原毒力因子数据库(V F D B )比对显示,分离菌携带多种与黏附㊁侵入及分泌系统相关的毒力基因;耐药基因数据库(C G E )分析显示,菌株中携带7种耐药基因,部分基因与耐药表型存在不一致的现象㊂ʌ结论ɔ本试验通过全基因组测序技术解析了1株大口黑鲈源豚鼠气单胞菌的毒力基因和耐药基因,其结果可为大口黑鲈临床疾病防控提供技术支撑㊂关键词:大口黑鲈;豚鼠气单胞菌;全基因组测序;毒力基因;耐药基因中图分类号:S 852.61文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2024.04.038 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-09-18基金项目:贵州省科技支撑项目(黔科合支撑[2023]一般022)联系方式:王迎平,E -m a i l :292914061@q q .c o m ㊂通信作者曹礼静,E -m a i l :517296566@q q .c o m ;赵光伟,E -m a i l :z h a o g u a n gw e i @s w u .e d u .c n I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o na n d W h o l eG e n o m eA n a l ys i s o f A e r o m o n a s c a v i a e f r o m M i c r o pt e r u s s a l m o i d e s WA N G Y i n g p i n g 1,Z H A OJ i n g x i a n 1,S H A N GJ i a f u 1,H A OC h e n g s e n 1,Z U O Y u qi 1,Z HU H u a n y i 1,F E N G X u d o n g 1,X U T i n g t i n g 2,N IX i n g w e i 2,L I U X i a 2,Y A N G X i a o w e i 1,3,C A OL a n y u n 1,Z H A N GL i w u 3,T A N C h a n g f a n 4,C A OL i j i n g 5,Z H A O G u a n gw e i 1,3(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,S o u t h w e s t U n i v e r s i t y ,C h o n g q i n g 402460,C h i n a ;2.G u i z h o uP r o v i n c i a lC e n t e r f o rA n i m a lD i s e a s eC o n t r o l a n dP r e v e n t i o n ,G u i y a n g550008,C h i n a ;3.C h o n g q i n g S a n j i e z h o n g x i nB i o e n g i n e e r i n g C o .,L t d .,C h o n g q i n g402460,C h i n a ;4.C h o n g q i n g W u s h a nV o c a t i o n a lE d u c a t i o nC e n t e r ,C h o n g q i n g 404799,C h i n a ;5.C h o n g q i n g R o n g c h a n g V o c a t i o n a lE d u c a t i o nC e n t e r ,C h o n g q i n g 402460,C h i n a )4期王迎平等:大口黑鲈源豚鼠气单胞菌的分离鉴定及全基因组分析A b s t r a c t:ʌO b j e c t i v eɔT h e p u r p o s e o f t h e p r e s e n t s t u d y w a s t o o b t a i n t h e p a t h o g e n i c b a c t e r i a a n d t h e i r m a i n b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fd i s e a s e d M i c r o p t e r u ss a l m o i d e s,a n d p r o v i d et e c h n i c a l s u p p o r t f o r c l i n i c a l d i s e a s e p r e v e n t i o n a n d c o n t r o l.ʌM e t h o dɔP a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f t h e n a t u r a l l y d i s e a s e d M i c r o p t e r u ss a l m o i d e s w e r eo b s e r v e df i r s t l y.A f t e rt h a t,b a c t e r i a w e r ei s o l a t e d a n d i d e n t i f i e dt h r o u g h G r a m s t a i n i n g,b i o c h e m i c a lt e s t i n g a n d16S r D N A s e q u e n c i n g a n a l y s i s. P a t h o g e n i c i t y o f t h e i s o l a t e w a s p e r f o r m e d o n m i c e t o e x p l o r e t h e p a t h o l o g i c a ll e s i o n s.F u r t h e r m o r e,P C R a n d K i r b y-B a u e r(K-B)d i s k m e t h o d s w e r e u s e dt o d e t e c tt h ec o m m o n v i r u l e n c e g e n e s a n d a n a l y z e t h e d r u g r e s i s t a n c e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e i s o l a t e d b a c t e r i a, r e s p e c t i v e l y.T h e d r a f t g e n o m ew a s o b t a i n e db y s e c o n d-g e n e r a t i o ns e q u e n c i n g t e c h n o l o g y,a n d i t s m o l e c u l a r c h a r a c t e r i s t i c s w e r e a n a l y z e d u s i n g b i o i n f o r m a t i c s m e t h o d s.ʌR e s u l tɔS w o l l e n h e p a t o c y t e s,v a c u o l a r d e g e n e r a t i o n a n d h e m o r r h a g i c n e c r o t i c l e s i o n s w e r e o b s e r v e d i n t h e n a t u r a l l y i n f e c t e d M i c r o p t e r u ss a l m o i d e s.A d o m i n a n tb a c t e r i a ls t r a i n w a si s o l a t e df r o m t h e d i s e a s e d M i c r o p t e r u ss a l m o i d e s,w h i c h e x h i b i t e d m i l k y w h i t e,s e m i t r a n s p a r e n t,a n d w i t h a d i a m e t e ro f a p p r o x i m a t e l y1m mc o l o n y a n dβh e m o l y s i s o n t h e b l o o d p l a t e.G r a ms t a i n i n g s h o w e d n e g a t i v es h o r tb a c i l l i,w i t h b l u n ta n dr o u n de n d s.T h r o u g h b i o c h e m i c a lt e s t sa n d16Sr D N A s e q u e n c i n g,i tw a sc o n f i r m e dt h a t t h e i s o l a t e ds t r a i n w a s A e r o m o n a s c a v i a e,w h i c h w a sn a m e d S C M S.T h e m o r t a l i t y r a t eo fe x p e r i m e n t a lm i c e w a s100%w i t h i n24ha f t e ri n o c u l a t i o n w i t h S C M S.A n d t h e p a t h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c sw e r e s i m i l a r t o t h o s e o f n a t u r a l l y i n f e c t e d M i c r o p t e r u s s a l m o i d e s.N i n ev i r u l e n c e g e n e sw e r ed e t e c t e di nt h eS C M Ss t r a i n,i n c l u d i n g A h a,A h p,A e r, A l t,g c a T,A c t,E x u,E l a a n d e p r C A I g e n e s.D r u g s e n s i t i v i t y t e s tr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e i s o l a t e db a c t e r i as h o w e dr e s i s t a n c eo r m o d e r a t es e n s i t i v i t y t o m o s tt e t r a c y c l i n ea n d m a c r o l i d e d r u g s.T h e w h o l e g e n o m es e q u e n c i n g s h o w e dt h a tt h ei s o l a t e d s t r a i n h a d at o t a ll e n g t h o f 4329602b p a n d a G C c o n t e n t o f61.5%.T h e g e n o m e i n f o r m a t i o n w a s r e g i s t e r e d a s J A R F U Q000000000i n G e n B a n k.S i m i l a r i t y a n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ei s o l a t e ds t r a i n h a d h i g h s i m i l a r i t y w i t hh u m a n a n d f o o d s o u r c e s o f A e r o m o n a s c a v i a e.T h e c o m p a r i s o n o fV i r u l e n c eF a c t o r D a t a b a s e(V F D B)s h o w e dt h a tt h ei s o l a t es t r a i nc a r r i e d m u l t i p l ev i r u l e n c e g e n e sr e l a t e dt o a d h e s i o n,i n v a s i o n,a n d s e c r e t i o ns y s t e m s e t c.A l s o,7d r u g r e s i s t a n c e g e n e sw e r eh a r b o r e d i nt h e i s o l a t e d s t r a i n w h e n a n n o t e d b y t h e d r u g r e s i s t a n c e g e n e d a t a b a s e(C G E).I n c o n s i s t e n c y p h e n o m e n o nw a s f o u n db e t w e e n p a r t i a l g e n e s a n d i t s d r u g r e s i s t a n c e p h e n o t y p e s.ʌC o n c l u s i o nɔI n t h i s e x p e r i m e n t,v i r u l e n c e a n dd r u g r e s i s t a n c e g e n e so f a n A e r o m o n a s c a v i a e s t r a i n i s o l a t e d f r o m d i s e a s e d M i c r o p t e r u s s a l m o i d e s w e r e a n a l y z e d t h r o u g hw h o l e g e n o m e s e q u e n c i n g t e c h n o l o g y,a n d a l l t h e s ef i n d i n g sc o u l d p r o v i d et e c h n i c a l s u p p o r t f o rc l i n i c a ld i s e a s e p r e v e n t i o na n dc o n t r o lo f M i c r o p t e r u s s a l m o i d e s.K e y w o r d s:M i c r o p t e r u s s a l m o i d e s;A e r o m o n a s c a v i a e;w h o l e g e n o m e s e q u e n c i n g;v i r u l e n c e g e n e;d r u g re s i s t a n c e g e n e大口黑鲈(M i c r o p t e r u s s a l m o i d e s)又名加州鲈鱼㊁黑鲈,属鲈形目太阳鱼科,是原产于北美洲密西西比河水系的一种优质淡水肉食性鱼类[1]㊂因其生长快㊁肉质鲜美㊁经济效益高等特点,世界各国纷纷引种养殖㊂中国也在大力发展大口黑鲈养殖业, 2020年其总产量约61.952万t,主要分布在广东㊁浙江㊁江苏㊁四川等地[2]㊂然而,由于饲养密度过高及养殖环境污染等综合原因,病害侵扰已成为当前危害大口黑鲈健康养殖的重要问题之一[3],且随着细菌耐药性问题的出现,细菌性疾病防控的难度逐渐加大,其中危害较为严重的病原为气单胞菌属的某些成员[4]㊂豚鼠气单胞菌(A e r o m o n a s c a v i a e)属于气单胞菌科(A e r o m o n a d a c e a e)气单胞菌属(A e r o m o n a s)成员,革兰阴性杆菌,广泛分布于多种生态系统中,但更常见于各种水生环境[1],属于人-兽-鱼共患病原7071中国畜牧兽医51卷菌,增殖过程中可产生气溶素㊁肠毒素㊁黏附因子等多种毒力因子,可引起人的胃肠炎㊁败血症等;在水产养殖中,可导致多种鱼类体表溃疡㊁出血㊁败血症等疾病,且由于水体流动的特点,极易引起暴发性流行,造成巨大经济损失㊂本试验对患病大口黑鲈源豚鼠气单胞菌进行分离鉴定及全基因组测定分析,以期为该病原菌所致疾病的防控提供理论支持㊂1材料与方法1.1材料1.1.1发病情况及病料四川眉山某大口黑鲈繁育基地发生鱼苗大量死亡现象,患病大口黑鲈体长5.5~7.5c m,主要表现为游动缓慢,采食量下降,胸鳍和肛门处红肿,部分大口黑鲈腹部膨胀,病程2~3d,死亡率约40%,投喂氟苯尼考进行治疗效果不佳;濒死大口黑鲈16尾低温送至西南大学动物医学院动物疾病快速诊断及防治中心㊂1.1.2主要试剂 L B培养基和药敏纸片均购自杭州微生物试剂有限公司;D N A提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司;2ˑR a p i d T a q M a s t e rM i x和D L2000D N A M a r k e r均购自南京诺唯赞生物科技有限公司㊂1.1.3试验动物S P F级雄性健康昆明小鼠12只,体重20gʃ2g,购自重庆医科大学实验动物中心,正常饲喂于西南大学动物医学院S P F级动物房㊂1.2方法1.2.1病理组织学观察剖检自然感染大口黑鲈,取其肝脏和肠道组织用10%中性福尔马林固定,石蜡包埋后进行组织切片,厚度5μm,H E染色后观察其组织病变㊂1.2.2细菌分离纯化无菌采集患病大口黑鲈肝脏组织,接种于5%兔血的L B平板,于37ħ恒温培养24h,挑取单菌落进行革兰染色,油镜观察其形态,将纯化菌种加10%甘油后于-80ħ保存备用;接种环钩取菌液至生化管,于37ħ恒温箱培养24h,观察其生化特征㊂1.2.3细菌鉴定利用D N A提取试剂盒提取菌株纯培养物的基因组作为模板,利用细菌16S r D N A 基因通用引物进行P C R扩增,16Sr D N A引物序列:F:5'-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G-3';R: 5'-A C G G C T A C C T T G T T A C G A C T T-3'㊂P C R反应体系50μL:2ˑR a p i d T a q M a s t e r M i x25μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各4μL,模板4μL, d d H2O13μL㊂P C R扩增程序:95ħ预变性5m i n; 95ħ变性30s,55ħ退火30s,72ħ延伸45s,共35个循环;72ħ延伸7m i n㊂P C R产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定,阳性产物送北京六合华大基因科技有限公司测序,测序结果与N C B I数据库进行比对以确定分离菌的种类㊂1.2.4致病性试验将分离菌培养至D600n m值约为0.8,腹腔注射健康小鼠(n=6)0.5m L/只,另有6只小鼠仅注射等量无菌生理盐水作为对照;接种后每天观察小鼠的精神状态和发病情况,及时剖检死亡小鼠,观察其病变,并取其心脏㊁肝脏㊁肾脏㊁肠道等组织进行病理组织学观察,H E染色后观察其病理变化㊂1.2.5毒力基因检测根据细菌鉴定结果,参考文献[4-6]合成其常见毒力基因的检测引物,包括气溶素(A e r)㊁细胞毒性肠毒素(A c t)㊁热不稳定性肠毒素(A l t)㊁黏附素(A h a)㊁脂肪酶(L i p)㊁核酸酶(E x u)㊁弹性蛋白酶(E l a)㊁溶血素(H l y)㊁热稳定性肠毒素(A s t)㊁外膜蛋白(O m p A)㊁鞭毛蛋白(F l a)㊁热敏蛋白酶(e p r C A I)㊁胆固醇酰基转移酶(g c a T)和蛋白酶(A h p),引物信息见表1,引物均由北京六合华大基因科技有限公司合成㊂以细菌基因组D N A 为模板进行毒力基因P C R检测㊂表1引物信息T a b l e1P r i m e r i n f o r m a t i o n毒力基因V i r u l e n c e g e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')退火温度A n n e a l i n g t e m p e r a t u r e/ħ片段大小F r a g m e n t s i z e/b p A e r F:G A G C G A G A A G G T G A C C A C C A A G A A C56417R:T T C C A G T C C C A C C A C T T C A C T T C A CA c t F:G A G A A G G T G A C C A C C A A G A A C A42232R:A A C T G A C A T C G G C C T T G A A C T CA l t F:T G A C C C A G T C C T G G C A C G G C57443R:G G T G A T C G A T C A C C A C C A G C80714期王迎平等:大口黑鲈源豚鼠气单胞菌的分离鉴定及全基因组分析续表毒力基因V i r u l e n c e g e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')退火温度A n n e a l i n g t e m p e r a t u r e/ħ片段大小F r a g m e n t s i z e/b p A h a F:G G C T A T T G C T A T C C C G G C T C T G T T631082R:C G G T C C A C T C G T C G T C C A T C T T GL i p F:C A G G A G C A G A A A G A T G C G A T58228R:G A T C A C T T C G C T G T C A G A G GH l y F:T G A C A G G C A A G T A G A A T A A C G C581815R:T G T C C G C T T T C C A C T C C CA s t F:A T C G T C A G C G A C A G C T T C T T58504R:C T C A T C C C T T G G C T T G T T G TA h p F:A A G G G C T A T C A G G A C A A G G T58703R:G G T T G C G A T A G G C G G T A T A GE x u F:R G A C A T G C A C A A C C T C T T C C53323R:G A T T G G T A T T G C C Y T G C A SE l a F:A C A C G G T C A A G G A G A T C A A C55513R:C G C T G G T G T T G G C C A G C A G GO m p A F:G C G G T T T A T C G C T T T G G T55397R:C A C G C T T G G A C T T G C T G AF l a F:T C C A A C CG T Y T G A C C T C55604R:GMY T G G T T G C G R A T G G Te p r C A I F:G C T C G A C G C C C A G C T C A C C49383R:G G C T C A C C G C A T T G G A T T C Gg c a T F:C T C C T G G A A T C C C A A G T A T C A G60237R:G G C A G G T T G A A C A G C A G T A T C T1.2.6药敏试验选取β-内酰胺类㊁氨基糖苷类和四环素类等共24种常用药物,利用K-B纸片法进行药敏试验,将分离菌纯化培养物调整浓度为0.5麦氏比浊度,均匀涂布于L B平板,贴上不同种类药敏纸片,37ħ恒温培养24h,测量并记录抑菌圈直径㊂参照药敏纸片说明书进行结果判定㊂1.2.7全基因组序列测定及组装全基因组测定与组装在成都罗宁生物科技有限公司完成㊂首先提取待测菌株基因组D N A,使其D260n m/D280n m值在1.8~2.0之间㊂将检测合格的基因组D N A片段化,构建大小约350b p的文库,利用I l l u m i n aH i S e q 测序平台P E150方法进行测序㊂将获得的原始数据使用T r i m m o m a t i c软件去除接头污染,采用4b p 滑动窗口法切除两端碱基质量<3的碱基,最短不低于100b p㊂用S P A d e s(v3.12)3软件进行基因组组装,利用P r o d i g a l v2.6.3软件分析编码基因,利用B a r r n a p0.8和t R N A s c a n-S E1.236软件分别对r R N A和t R N A进行分析,使用S i g n a l P5.0软件测定蛋白编码基因中存在的信号肽序列㊂1.2.8基因组注释和功能分析利用e g g N O G 数据库(h t t p:ʊe g g n o g-m a p p e r.e m b l.d e/)对基因组编码蛋白进行功能注释,利用V F D B数据库(h t t p:ʊw w w.m g c.a c.c n/V F s/m a i n.h t m)获得细菌相关毒力因子信息,对毒力基因进行分析,利用C G E数据库(h t t p:ʊw w w.g e n o m i c e p i d e m i o l o g y. o r g/)分析比对该菌株所携带的耐药基因,获得相关耐药信息㊂2结果2.1临床表现与病理变化临床自然感染的16尾大口黑鲈中均可见体表微发红,肛门和胸鳍有出血,剖检可见肝脏肿胀出血㊂随机选择2份病鲈肝脏和肠道组织进行病理组织学观察发现,肝脏中部分血管发生栓塞,肝细胞肿大,可见不规则空泡,细胞间可见红染丝状的纤维蛋白(图1A);肠组织结构可见肠壁发生坏死,黏膜下层的部位发生出血,且有杆菌分布(图1B)㊂9071中 国 畜 牧 兽 医51卷①A ,肝脏;B ,肠道㊂②a ,肝脏血栓;b ,空泡变性;c ,肠壁黏膜出血;d ,杆菌①A ,L i v e r ;B ,I n t e s t i n e .②a ,L i v e r t h r o m b o s i s ;b ,V a c u o l a r d e g e n e r a t i o n ;c ,I n t e s t i n a lm u c o s a l b l e e d i n g ;d ,B a c i l l u s 图1 患病大口黑鲈病理组织学观察(H E ,400ˑ)F i g .1 O b s e r v a t i o no f p a t h o l o g i c a l h i s t o l o g y of d i s e a s e d M i c r o p t e r u s s a l m o i d e s (H E ,400ˑ)2.2 细菌分离鉴定结果分离菌在血平板上呈直径约1m m 的小菌落,乳白色,半透明,边缘整齐,呈β溶血(图2A );为革兰阴性短杆菌,两端钝圆(图2B );16S r D N AP C R 鉴定结果显示,获得大小约1500b p 的目的条带(图2C ),测序比对结果显示,该菌与豚鼠气单胞菌相似性为100%,因而确定分离菌为豚鼠气单胞菌,将其命名为S C M S 株㊂生化试验结果显示,该菌能发酵葡萄糖㊁麦芽糖㊁甘露醇和蔗糖,不能发酵乳糖;M R 试验阳性,硫化氢㊁靛基质㊁枸橼酸盐和V P 试验均为阴性(表2)㊂A ,血平板上的菌落;B ,分离菌革兰染色结果(1000ˑ);C ,16S r D N A 鉴定结果A ,C o l o n i e s o n t h eb l o o d p l a t e ;B ,G r a ms t a i n i n g r e s u l t s o f t h e i s o l a t e db a c t e r i a (1000ˑ);C ,16S r D N Ai d e n t i f i c a t i o n r e s u l t 图2 分离菌菌落形态及16S r D N A 鉴定结果F i g .2 C o l o n y m o r p h o l o g y a n d 16S r D N Ai d e n t i f i c a t i o n r e s u l t s o f t h e i s o l a t e db a c t e r i a 表2 分离菌生化鉴定结果T a b l e 2 B i o c h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o n r e s u l t s o f t h e i s o l a t e 项目I t e m s 结果R e s u l t s 项目I t e m s 结果R e s u l t s 葡萄糖G l u c o s e +硫化氢H y d r o t h i o n -乳糖L a c t o s e -靛基质I n d o l e-麦芽糖M a l t o s e +M R 试验M Rt e s t+甘露醇M a n n i t o l +V P 试验V Pt e s t -蔗糖S u c r o s e+枸橼酸盐C i t r a t e-+,阳性;-,阴性+,P o s i t i v e ;-,N e ga t i v e 01714期王迎平等:大口黑鲈源豚鼠气单胞菌的分离鉴定及全基因组分析2.3致病性试验结果试验组小鼠感染分离菌8h后死亡3只,其余3只表现精神沉郁㊁活动减弱,眼睛有大量分泌物,肛门处有粪便黏连;感染后24h,该组小鼠全部死亡;对照组小鼠均正常㊂剖检死亡小鼠发现肠腔内充满黄色液体,内脏充血出血㊂病理组织学观察发现,肝脏组织中血管发生栓塞,纤维组织增生,肝血窦扩张,出血(图3A);肾脏组织中肾小球与囊壁黏连,并有大量炎性细胞渗出,肾小管扩张,管腔增大(图3B);肠组织中可见肠道绒毛大量坏死断裂,炎性细胞增多(图3C);心脏组织中细胞核破碎溶解,心肌纤维断裂,间隙增宽,染色不均(图3D)㊂①A,肝脏;B,肾脏;C,肠组织;D,心脏㊂②a,肝脏中血栓;b,肝窦扩张出血;c,肾脏中炎性细胞浸润;d,肾小管扩张;e,肠黏膜坏死组织;f,炎性细胞;g,心肌纤维断裂㊁坏死;h,核破碎㊁溶解①A,L i v e r;B,K i d n e y;C,I n t e s t i n a l t i s s u e;D,H e a r t.②a,T h r o m b o s i s i n l i v e r;b,H e p a t i c s i n u s d i l a t i o nb l e e d i n g;c,I n f l a m m a t o r yc e l l s i n f i l t r a t i o n i nk id ne y;d,R e n a l t u b u l a rd i l a t i o n;e,N e c r o t i z i n g t i s s u eof i n t e s t i n a lm u c o s a;f,I n f l a m m a t o r y c e l l s;g,C a r d i a c c e n t r a lm u s c l e f i b e r r u p t u r e,n e c r o s i s;h,N u c l e a r f r ag m e n t a t i o n,d i s s o l u t i o n图3人工感染小鼠病理组织学变化(H E,400ˑ)F i g.3P a t h o l o g i c a l h i s t o l o g y c h a n g e s i na r t i f i c i a l l y i n f e c t e dm i c e(H E,400ˑ)2.4毒力基因检测结果在气单胞菌属常见的14种毒力基因中,S C M S菌株中共检测到9种,分别是A h a㊁A h p㊁A e r㊁A l t㊁g c a T㊁A c t㊁E x u㊁E l a和e p r C A I基因(图4)㊂1~14,分别为毒力基因A h a㊁A h p㊁A e r㊁A l t㊁g c a T㊁A c t㊁E x u㊁E l a㊁e p r C A I㊁A s t㊁L i p㊁H l y㊁O m p A和F l a;M,D L2000D N A M a r k e r 1-14,V i r u l e n c e g e n e s A h a,A h p,A e r,A l t,g c a T,A c t,E x u,E l a,e p r C A I,A s t,L i p,H l y,O m p A a n d F l a,r e s p e c t i v e l y; M,D L2000D N A M a r k e r图4S C M S株毒力基因检测结果F i g.4D e t e c t i o n r e s u l t s o f v i r u l e n c e g e n e s o f S C M S s t r a i n1171中国畜牧兽医51卷2.5药敏试验结果药敏结果显示,S C M C株对β-内酰胺类和氨基糖苷类药物较为敏感,如头孢唑林㊁头孢呋辛㊁苯唑西林㊁哌拉西林㊁丁胺卡那和卡那霉素等,可参考作为临床治疗用药;而对于四环素类及大环内酯类药物,除米诺环素较敏感外,其他均表现耐药或中度敏感(表3)㊂表3豚鼠气单胞菌S C M S株药敏试验结果T a b l e3D r u g s e n s i t i v i t y t e s t r e s u l t s o f S C M S s t r a i no f A e r o m o n a s c a v i a e分类C l a s s i f i c a t i o n药物D r u g s抑菌圈直径D i a m e t e r o f i n h i b i t i o nz o n e/m m判定结果J u d g m e n tr e s u l t s判定标准J u d g m e n t s t a n d a r d/m mR I Sβ-内酰胺类头孢曲松C e f t r i a x o n e35.0Sɤ1314~20ȡ21β-l a c t a m s氨苄西林A m p i c i l l i n15.0Iɤ1314~16ȡ17羧苄西林C a r b e n i c i l l i n23.5Sɤ1920~22ȡ23青霉素P e n i c i l l i n6.0Rɤ1920~27ȡ28头孢唑林C e f a z o l i n18.5Sɤ1415~17ȡ18头孢呋辛C e f u r o x i m e30.0Sɤ1415~17ȡ18头孢拉定C e f r a d i n e19.0Sɤ1415~17ȡ18哌拉西林P i p e r a c i l l i n33.5Sɤ1718~20ȡ21苯唑西林O x a c i l l i n18.0Sɤ1011~12ȡ13氨基糖苷类新霉素N e o m y c i n20.0Sɤ1213~16ȡ17 A m i n o g l y c o s i d e s庆大霉素G e n t a m i c i n19.0Sɤ1213~14ȡ15丁胺卡那A m i k a c i n22.0Sɤ1415~16ȡ17卡那霉素K a n a m y c i n22.0Sɤ1314~17ȡ18大环内酯类红霉素E r y t h r o m y c i n14.0Iɤ1314~22ȡ23 M a c r o c y c l i c l a c t o n e s麦迪霉素M e d e m y c i n6.0Rɤ1314~17ȡ18四环素类多西环素D o x y c y c l i n e8.0Rɤ1213~15ȡ16 T e t r a c y c l i n e s四环素T e t r a c y c l i n e11.0Rɤ1415~18ȡ19米诺环素M i n o c y c l i n e24.0Sɤ1415~18ȡ19酰胺醇类氟苯尼考F l o r f e n i c o l16.0Iɤ1213~17ȡ18 A m p h e n i c o l s喹诺酮类诺氟沙星N o r f l o x a c i n21.0Sɤ1213~16ȡ17 Q u i n o l o n e s多肽类多黏菌素P o l y m y x i n14.0Sɤ78~11ȡ12 P e p t i d e s万古霉素V a n c o m y c i n6.0Rɤ1415~16ȡ17林可霉素类克林霉素C l i n d a m y c i n6.0Rɤ1415~20ȡ21 L i n c o m y c i n c l a s s磺胺类复方新诺明C o t r i m o x a z o l e15.0Iɤ1011~15ȡ16 S u l f o n a m i d e sR,耐药;I,中介;S,敏感R,R e s i s t a n c e;I,I n t e r m e d i a r y;S,S e n s i t i v e2.6基因组测序结果分析及比对S C M C株全基因组测序共获得306个重叠群(c o n t i g s),碱基总数为4329602b p,G C含量为61.5%,基因组序列组装后上传G e n B a n k数据库,登录号为J A R F U Q000000000㊂通过生物信息学软件注释,共有3929个编码序列,1个r R N A,56个t R N A㊂相似性比对分析发现,S C M S株与食源性菌株C o l o n y274和人源菌株K524㊁211703位于同一簇,亲缘关系最为接近,与水源㊁鱼源及污泥源菌株(如W C W1-2㊁T C O22㊁O T55等)关系较远(图5)㊂21714期王迎平等:大口黑鲈源豚鼠气单胞菌的分离鉴定及全基因组分析红色,S C M S 菌株;黄色,食品源豚鼠气单胞菌菌株;蓝色,人源豚鼠气单胞菌菌株R e d ,S C M Ss t r a i n ;Y e l l o w ,F o o do r i g i no f A e r o m o n a s c a v i a e s t r a i n ;B l u e ,H u m a no r i g i no f A e r o m o n a s c a v i a e s t r a i n 图5 S C M S 株与其他宿主源豚鼠气单胞菌全基因组系统进化树F i g .5 P h y l o ge n e t i c t r e e of S C M S s t r a i na n do t h e r s o u r c e s o f A e r o m o n a s c a v i a e s t r a i n s b a s e do n t h ew h o l eg e n o m e 2.7 基因组注释结果分析2.7.1 基因功能注释结果 S C M S 株通过C O G 共注释了3670个基因,占总量的93.4%㊂按其功能分析,与细胞组成及信号传导相关的有974个,主要与细菌细胞壁㊁细胞膜等组分形成及信号传导相关;与细菌信息处理与存储相关的基因有680个,介导细菌的转录㊁翻译及染色质结构和动力学等功能;与细菌新陈代谢相关的基因最多,共1464个,主要参与氨基酸运输㊁代谢及无机离子等物质的运输和代谢;此外,还有705个目前尚不清楚其功能的基因㊂2.7.2 毒力基因注释结果 通过与V F D B 数据库比对,共发现S C M S 株毒力基因53个,分属于黏附㊁分泌系统㊁毒素㊁抗吞噬㊁细胞表面成分和糖基化系统6类(表4)㊂其中黏附相关的毒力基因最多(31个),包括与极性鞭毛㊁侧鞭毛相关的21个,Ⅳ型菌毛10个;其次为分泌系统类(18个),包括Ⅵ型分泌系统12个,Ⅱ型分泌系统6个;分属毒素类㊁抗吞噬类㊁细胞表面成分和糖基化系统的毒力基因各1个㊂3171中国畜牧兽医51卷表4V F D B数据库注释S C M S菌中毒力基因结果T a b l e4A n n o t a t i o n r e s u l t s o f v i r u l e n c e g e n e s i nS C M S s t r a i nb y V F D Bd a t a b a s e毒力基因类别C a t e g o r y o f v i r u l e n c e g e n e毒力基因种类T y p e s o f v i r u l e n c e g e n e毒力基因数量N u m b e r o f v i r u l e n c e g e n e 黏附A d h e r e n c e431分泌系统S e c r e t i o n s y s t e m218毒素T o x i n11抗吞噬A n t i-p h a g o c y t o s i s11细胞表面成分C e l l s u r f a c e c o m p o n e n t s11糖基化系统G l y c o s y l a t i o n s y s t e m112.7.3耐药基因注释结果通过与C G E数据库比对发现,S C M S株共携带7个耐药基因,分别是氨基糖苷类a p h(3ᵡ)-Ⅰb㊁a p h(6)-Ⅰd㊁a a d A2基因,磺胺类s u l1基因,四环素类t e t(E)基因,β-内酰胺类b l a MO X-5基因和酰胺醇类f l o R基因(表5)㊂表5C G E数据库注释S C M S菌中耐药基因结果T a b l e5A n n o t a t i o n r e s u l t s o f d r u g r e s i s t a n c e g e n e s i nS C M S s t r a i nb y C G Ed a t a b a s e耐药基因类别C a t e g o r y o f d r u g r e s i s t a n c e g e n e耐药基因D r u g r e s i s t a n c eg e n e s耐药基因长度L e n g t ho f d r u gr e s i s t a n c e g e n e s/b p在重叠群中的位置P o s i t i o n i n c o n t i g s/b p氨基糖苷类a p h(3ᵡ)-Ⅰb804C o n t i g063463-4266 A m i n o g l y c o s i d e s a p h(6)-Ⅰd837C o n t i g052627-3463a a d A2792C o n t i g042372-3163磺胺类S u l f o n a m i d e s s u l1840C o n t i g031028-1867四环素类T e t r a c y c l i n e s t e t(E)1218C o n t i g011715-2932β-内酰胺类β-l a c t a m sb l a MO X-51153C o n t i g022323-3474酰胺醇类A m p h e n ic o l s f l o R1214C o n t i g033469-46823讨论本试验通过常规细菌分离方法自患病大口黑鲈中获得优势菌株,经鉴定为豚鼠气单胞菌㊂由于大口黑鲈对养殖环境要求较为苛刻,本试验未能将其回归原动物以验证科赫法则,取而代之用试验动物小鼠进行人工感染确定其致病性,通过比较小鼠与自然感染大口黑鲈的病理组织学特征,并结合已报道的豚鼠气单胞菌的发病特点[7],可确定豚鼠气单胞菌为导致本次大口黑鲈发病的致病菌,且通过筛选出的敏感药物病情得到控制,本试验结果对临床大口黑鲈疾病的防控具有参考价值㊂毒力基因的有无是判断菌株致病性的重要指标之一㊂本试验首先结合气单胞菌属常见的毒力基因进行P C R检测,随后通过全基因组测序及V F D B 数据库的比对分析进行毒力基因的检测,在分离菌株中发现了多种毒力基因㊂其中极性鞭毛㊁侧鞭毛参与细菌的运动㊁入侵和黏附,Ⅳ型菌毛在细菌的定植过程中发挥重要作用,且参与生物被膜的形成[8-9],这类毒力基因的数量最多;菌株中还发现了T2S S㊁T6S S等分泌系统相关基因,它们对许多毒力因子的分泌至关重要,其中T6S S能将细菌分泌的与毒力相关的蛋白直接注入到宿主细胞的细胞质中,引起病变[10];毒素类毒力基因中,共发现气溶素㊁溶血素㊁细胞毒性肠毒素和细胞兴奋性肠毒素4种毒力基因,是公认的气单胞菌属主要毒力因子,尤其是气溶素毒力最强,具有细胞毒性㊁肠毒性㊁溶血性3种特性,可破坏宿主细胞膜,裂解细胞,有助于细菌的入侵与定植,在突破肠黏膜屏障㊁破坏肠道上皮细胞㊁引发局部炎症中发挥着重要的作用[11]㊂毒力基因的检测结果与该菌对宿主所表现出的致病特征是一致的,如肠黏膜组织的坏死㊁炎性细胞的浸润㊁内脏器官的充血出血等,进一步说明了豚鼠气单胞菌为大口黑鲈的致病菌㊂气单胞菌耐药现象频发也是一个值得关注的问题,近年来报道在查干湖鲢鱼㊁红鲫㊁罗氏沼虾等养殖中分离到多重耐药菌株[7,12-13]㊂本研究通过药敏试验发现,分离菌对氨基糖苷类和β-内酰胺类药物仍较为敏感,但对四环素类及大环内酯类药物多表41714期王迎平等:大口黑鲈源豚鼠气单胞菌的分离鉴定及全基因组分析现耐药或中度敏感,这与张飘等[14-15]的研究结果存在相似之处㊂通过C G E数据库分析比对共发现7个耐药基因,其中四环素类t e t(E)基因和磺胺类s u l1基因与以往报道的优势耐药基因的结果相一致[16-18],也与该分离菌的耐药表型相符;然而本试验发现,分离株中携带有氨基糖苷类耐药基因a p h(3ᵡ)-Ⅰb㊁a p h(6)-Ⅰd㊁a a d A2和β-内酰胺类耐药基因b l a MO X-5,但在药敏试验中该菌对两类药物均表现为敏感,存在耐药表型与耐药基因不一致的现象,推测可能与药敏试验中药物浓度有关,其详细机制有待于深入研究;酰胺醇类f l o R基因是导致革兰阴性菌对氟苯尼考耐药最主要基因[19],为易化因子超家族转运蛋白家族中的重要成员,可与外膜蛋白通过膜融合蛋白形成一个连续通道,进而利用该通道把药物排出细胞外从而导致细菌耐药[20],f l o R 耐药基因的存在与本研究分离株对氟苯尼考耐药的表型一致,且与临床中使用氟苯尼考治疗效果不佳相吻合㊂抗生素在水产病原菌防控时易产生耐药性,为此科研人员已将目光转向开发新型绿色防控制剂并取得了一定的成效,如利用乌梅-全蝎药方对气单胞菌混合感染的大口黑鲈进行治疗[21],利用库拉索芦荟提取物对维氏气单胞菌进行抑菌效果研究[22],此外还有多种中草药配方对水产动物致病菌体外抑菌效果的研究报道[23-24],其毒副作用小㊁无残留㊁不易使致病菌产生耐药,符合当今绿色养殖的主题,然而目前尚不具备将中草药广泛用于鱼类病害防控的条件,需对中草药主要成分㊁实际功效及其基础理论等进行更深层次的研究㊂4结论本研究确诊了四川眉山某繁育基地患病大口黑鲈的致病菌为豚鼠气单胞菌,成功分离到1株菌,全基因组序列信息提交至G e n B a n k(登录号: J A R F U Q000000000)㊂综合P C R检测㊁生物信息学数据库分析㊁致病性及药敏试验结果,显示该菌具有多种毒力基因和耐药基因,且与其表型基本一致,为临床该病的防控提供了必要的技术支撑㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] A R A V E N A-R OMA N M,B E A Z-H I D A L G O R,T I MO T H Y J,e t a l.A e r o m o n a s a u s t r a l i e n s i s s p.n o v.,i s o l a t e df r o mi r r i g a t i o n w a t e r[J].I n t e r n 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