原位杂交步骤-自己整理的1

昆虫原位杂交一、昆虫原位杂交是什么呢？哎呀，小伙伴们，昆虫原位杂交可有趣啦！简单来说呢，就是一种在昆虫身体里直接做的杂交技术。

你想啊，昆虫那么小一只，要在它身体里搞这么复杂的事情，就像在一个小小的城堡里进行一场神秘的魔法实验一样。

这个技术啊，就像是给昆虫细胞里的基因们安排了一场相亲大会。

科学家们呢，要找到那些来自不同地方的基因“小帅哥”和“小美女”，然后让它们在昆虫细胞这个特殊的“相亲场地”里见面，看看能不能擦出爱的火花，组合成新的基因组合。

二、昆虫原位杂交的步骤有哪些呢？1. 准备工作首先得抓昆虫啦，不过这可不能乱抓哦。

要根据研究的目的，选择合适的昆虫种类。

比如说，如果是研究某种蝴蝶翅膀颜色的基因，那就得专门去找那种蝴蝶。

然后呢，要把昆虫处理一下，让它的细胞能够乖乖听话，就像要把调皮的小孩子哄好，才能让他们配合做游戏一样。

还得准备各种试剂呢。

这些试剂就像是做菜的调料，少了哪一种都不行。

像有一些可以让细胞的结构更清晰的试剂，还有能标记基因的特殊试剂。

2. 杂交过程要把昆虫的细胞或者组织小心翼翼地放在一个特制的环境里。

这个环境的温度、湿度什么的都得控制得很好，就像给小婴儿营造一个舒适的小床一样。

然后把那些带有标记的基因片段放进去，让它们去找自己的“另一半”。

这个过程有点像在大海里捞针，但是科学家们有自己的小窍门，能让这个过程更顺利。

在杂交的时候，还要时刻盯着，就像守着一个小火炉，火候不对就不行。

要保证基因们能够准确地结合，不能让它们乱搭伙。

3. 检测环节杂交完了之后，要看看有没有成功呀。

这时候就需要用到一些特殊的仪器了，这些仪器就像超级侦探一样，能够发现那些成功结合的基因组合。

如果没有检测到，那可能就得重新来一遍，就像做饭没做好，得重新下锅一样。

三、昆虫原位杂交有啥用呢？1. 研究昆虫的进化你知道吗？通过昆虫原位杂交，我们可以了解昆虫的基因是怎么变化的。

就像看一部昆虫家族的历史纪录片一样，能知道它们是怎么从古老的祖先慢慢变成现在各种各样的模样的。

原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4） PBS清洗3分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6） PBS清洗10分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟；8） PBS清洗2次，每次3分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次3分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗2次，每次5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17）PBS清洗3分钟；18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟；19）PBS清洗5分钟；20）室温，2×SSC清洗10分钟；21）37℃，1×SSC清洗10分钟；22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；23）缓冲液A孵育10分钟；24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟；25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时；26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30）固红，脱水以及封片进行核的复染。

2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟；2）无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4） PBS清洗5分钟；5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6） PBS清洗5分钟；7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟；8） PBS清洗2次，每次5分钟；9） 0.2N的HCl孵育30分钟；10）PBS清洗2次，每次5分钟；11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2×SSC清洗10分钟；18）37℃，1×SSC清洗10分钟；19）37℃，0.5×SSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37℃孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。

原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。

下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。

常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。

2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。

标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。

3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。

4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。

这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。

5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。

6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。

这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。

7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。

评估信号的位置、强度和特异性。

这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。

原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。

荧光原位杂交技术流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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1. 细胞制备。

收取培养细胞或组织切片。

原位杂交实验步骤(一)原位杂交1、溶液配置：（1）Hybridization buffer（20ml）：Formamide 10ml；20x SSC 5ml；Denhand’s2ml；100mg/ml yeast tRNA 50μL；10mg/ml salmon sperm DNA 1ml；Blocking regent 0.4g；DEPC-water 1.95ml。

（2）The acetylation solution（600ml）：triethanolumine 8ml；Conc. HCl 1050μL；DEPC-water 590ml。

（3）PK ：DEPC-PBS 75ml；PK stock(10mg/ml) 37.5μL。

（4）Denaturizing hybridization buffer（20ml）：hybridization buffer 18.25ml；20%CHAPS 250μL；DEPC-water 1480μL；Tween-20 20μL。

（5）溶液B1（1L）：1M tris PH7.5 100ml；5M NaCl 30ml；Sterile water 1L。

（6）溶液B3（1L）：1M tris PH9.5 100ml；5M NaCl 20ml；1M MgCl 50ml；Water up to 1L。

（7）Blocking solution（20ml）：B1 buffer 18ml；FCS 2ml；10%Tween 100μL。

（8）Developer solution（1ml）：B3 buffer 953μL；N BT(17mg/ml) 20μL；BCIP(8mg/ml) 21μL；Levamisol 5μL；Tween 0.5μL。

2、实验步骤（1）石蜡玻片置于二甲苯中浸泡5分钟，两次，室温。

（2）无水乙醇，95%乙醇，75%乙醇和PBS分别浸泡3分钟，室温。

（3）DEPC-PBS浸泡3min×3，室温并准备the acetylation solution。

原位杂交操作流程：步骤备注材料的固定和包埋1、固定：将花芽浸入20倍于材料的FAA固定液中，抽气除去材料表面附着的气泡直至材料沉于容器底部，4 °C过夜（24h-72h），然后保存于70%乙醇中。

100mlFAA固定液包含：乙醇50 ml 冰醋酸 5 ml 37% 甲醛溶液10 ml DEPC-H2O 35 ml2、脱水：材料经70%，80%，90%，100%，100%，100%乙醇脱水，每步60分钟。

3、透明：依次经25%二甲苯-75%乙醇，50%二甲苯-50%乙醇，75%二甲苯-25%乙醇，100%二甲苯，100%二甲苯，100%二甲苯，每步45分钟。

4、浸蜡：50%石蜡-50%二甲苯，42°C处理24h，重复此操作一次，移入60°C温箱，换入纯石蜡，60°C保温四天，每天换两次纯石蜡60°C石蜡过滤，超过62°C可能会破坏石蜡结构5、包埋：包埋时注意除气泡石蜡包埋块4°C可以保存1年以上切片1、载玻片：使用进口的处理好的载玻片。

2、切片展片：42°C粘片四天。

探针标记1、转绿反应（10µl）：线性化模板200-300ng（2µl）5x Transcription Buffer 2µl5x Labeling Mix 2µlRNApolymerase 1µlDEPC-H2O 2.5µlRnase Inhibitor 1µl37 °C or 42°C反应2小时2、收集探针：1µl 10mg/ml tRNA2.5µl 4M Licl75µl 100%乙醇，-20°C放置2小时，4°C，1,2000，30分钟70%乙醇洗涤沉淀，风干，溶于50µl DEPC-H2O中。

为使探针彻底溶解，可以在60°C 保温15分钟3、探针半定量：不同稀释倍数的探针和标准品点同样体积于尼龙膜，按照说明书进行显色。

原位杂交技术的具体步骤原位杂交技术是一种用于研究基因组结构和功能的重要方法。

它可以帮助我们了解基因在细胞中的定位和表达情况，进而揭示基因调控的机制。

本文将详细介绍原位杂交技术的具体步骤。

一、制备探针在进行原位杂交实验之前，首先需要制备合适的DNA或RNA探针。

探针是一段标记有荧光染料或放射性同位素的DNA或RNA序列，用于与待检测样品中的靶标DNA或RNA进行互补配对。

制备探针的方法有多种，常见的包括随机引物标记法、PCR标记法和转录标记法等。

二、取样和固定在进行原位杂交实验时，需要采集待检测样品，并将其固定在载玻片上。

固定的目的是保持样品的形态结构和细胞核的完整性，以便后续的杂交反应能够准确地进行。

常用的固定方法有冷冻固定、乙醛固定和细胞固定等。

三、脱水和处理在固定完样品后，需要对其进行脱水处理。

脱水的目的是去除样品中的水分，使探针能够更好地与靶标DNA或RNA结合。

脱水处理通常采用浓度递增的乙醇溶液进行，如70%、85%和95%乙醇溶液。

四、杂交反应杂交反应是原位杂交技术的核心步骤。

在杂交反应中，将制备好的探针与待检测样品中的靶标DNA或RNA进行互补配对。

杂交反应的条件包括温度、时间和缓冲液的选择等。

一般来说，杂交温度较高可以提高探针与靶标的互补配对效率，但也可能导致非特异性杂交的发生。

五、洗涤和检测在杂交反应完成后，需要对样品进行洗涤，以去除非特异性杂交的探针。

洗涤的条件通常是选择适当的盐溶液和洗涤时间，以确保只有与靶标DNA或RNA互补配对的探针能够保留在样品中。

洗涤完成后，可以使用适当的检测方法来检测样品中的探针信号，如荧光显微镜、放射自显影等。

六、结果分析根据样品中的探针信号，可以进行结果的分析和解读。

通过观察探针的分布和强度，可以确定靶标DNA或RNA在细胞中的定位和表达情况。

此外，还可以通过对多个样品的比较分析，揭示基因的差异表达和调控机制。

原位杂交技术是一种重要的分子生物学方法，可以帮助我们研究基因组的结构和功能。

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在开展荧光原位杂交实验之前，需要做好充分的准备工作。

原位杂交实验步骤原位杂交实验步骤原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。

根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA 杂交三类。

根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。

直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。

间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。

原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。

尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。

一、基本要求1.组织取材：组织取材应尽可能新鲜。

由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。

2.固定目的是：（1）保持细胞结构；（2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；（3）使探针易于进入细胞或组织。

最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。

3.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：（1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。

组织和细胞标本亦可用0.2M HCl处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。

（2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。

荧光原位杂交操作步骤荧光原位杂交听起来很复杂呢，其实操作步骤也有章可循啦。

一、样本准备。

要做这个实验，先得把样本处理好。

如果是细胞样本的话，就得把细胞乖乖地固定在载玻片上，就像把小娃娃放在小床上一样安稳。

这一步可不能马虎，固定不好后面就不好办啦。

要是组织样本呢，得把组织切成薄片，薄到像纸片一样精致才行。

然后同样把它固定好，这就为后面的杂交打下了好基础。

二、探针准备。

接下来就是探针啦。

探针就像是专门去找目标的小侦探。

得按照实验要求把探针配好，浓度要刚刚好哦，太浓了可能会乱了阵脚，太稀了又可能找不到目标。

把探针在合适的缓冲液里调配好，就像给小侦探准备好装备一样。

三、杂交反应。

然后就到了杂交这一步啦。

把准备好的探针滴到有样本的载玻片上，再盖上盖玻片。

这时候就像把小侦探放到了有目标的地方，让它们去寻找匹配的东西。

然后把载玻片放到一个合适温度的环境里，这个温度很关键呢，就像给小侦探们创造一个舒适的工作环境。

在这个环境里让探针和样本中的目标DNA或者RNA去结合，这个过程需要一点时间，就像小侦探寻找目标也不能太着急呀。

四、洗涤。

杂交完了之后呢，就要把那些没有结合的多余探针洗掉。

这就像是把那些凑热闹的家伙赶走，只留下真正找到目标的小侦探。

用合适的洗涤液轻轻地洗，可不能太粗暴，不然把已经结合好的也冲走了就糟糕啦。

五、检测。

最后就是检测啦。

这时候要用专门的荧光显微镜去看。

打开显微镜，就像打开一个神秘的宝藏盒子。

如果杂交成功了，就能看到漂亮的荧光信号啦，就像在黑暗中看到了闪闪发光的小星星。

那些荧光信号所在的地方就是探针找到目标的地方呢。

荧光原位杂交虽然有点复杂，但是按照这些步骤一步一步来，就像照顾小宠物一样细心，也能顺利完成这个有趣的实验啦。

FISH（原位杂交）SOP流程------探针直接带荧光标记一、FISH实验步骤1、石蜡切片脱蜡至水：将挑选好的组织切片置于切片架上放入烘箱中65℃烤片2-3h（观察组织周围石蜡是否被熔化流至切片边缘），烤片完成后将组织切片放入脱蜡机中脱蜡。

脱蜡完成后取出切片，进行抗原修复。

2、抗原修复：脱蜡完成后取出切片，进行酶修复。

稍甩净切片上水分，水平放置在孵育盒，用组化笔在组织周围画圈（过程中组织不能干片，组化笔不能碰到组织，否则会损坏组织或使抗体无法孵育到组织；不可用力按压组化笔以免笔内液体流出覆盖组织），蛋白酶K（PK）37度孵育15-20min，修复完后用PBS冲洗，再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、固定：甩去残留在片子上的PBS，滴加4%多聚甲醛，室温孵育5min。

用PBS冲洗。

再将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、预杂交：滴加Hyb buffer（预杂交液）55度避光预杂交2小时。

5、准备探针：将探针原液与Hyb buffer按比例稀释，混合均匀后85℃变性3min,37℃平衡2min。

6、杂交：预杂交结束后，吸去Hyb buffer，滴加平衡后的杂交工作液，切片平放于湿盒内，37-42°C（杂交温度依据探针TM值确定）孵育过夜（湿盒内加少量水防止杂交液蒸发）。

7、洗涤：用1XSSC冲洗，浸泡2min。

（洗涤时间不宜过长，可能会洗掉表达）。

8、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育20min。

9、封片：PBS冲掉DAPI，切片稍甩干后用WGA封片剂封片（封片时应避免组织上出现气泡）。

10、镜检拍照：切片于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。

（蓝光紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm；FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm；CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm）二、荧光结果判读DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光。

原位杂交实验操作步骤一质粒制备1质粒的转化和扩增1.1制备XL1-Blue感受态细菌1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm 培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200μ/tube)，-80℃保存。

2.转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。

3.轻轻摇匀，冰浴30min。

4.42℃热激9O秒，然后迅速冰浴2min。

5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37℃，100转/min水浴孵育60min。

6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h。

1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落1.用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37℃，200转/分培养2h，取1ml之一Eppendorf离心管，加50μl10mmol/L EDTA(pH8.0)。

2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡30秒。

3.在70℃温育5min，然后冷却到室温。

4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。

5.12000g，4℃离以3min，以除去细菌碎片。

6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。

恒压50V，进行电泳。

7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA 分于量的大小是否与转入质粒相符。

原位杂交实验操作步骤撰写人：范为民一、实验原理原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。

现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。

二、试剂盒本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。

过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。

两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。

用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。

DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。

下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。

三、实验步骤原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。

（一）组织冰冻切片1. 实验准备（1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。

一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。

这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。

（2）缓冲液配备1.1器具准备剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。

以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。

铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。

原位杂交流程以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA ；書标汕湘对彳则制「进汀mRNA检测的流秽」:轧这些实验援咋力法艰盗参占书屮均右门没伐一木卡是号为坟个冃的帀桑统地扫以总结的和恋加以淙合佻同行参考在貝依操作过稈小很窗地方"J酌倩变匹在:临床应用屮常常町以买到己经标紀好的商Nh探针邓么前M—人部分扩增基囚、酎刃鉴定、标记探针时工柞就叮以省去从右蛇切片处理做起即叽卜丽介绍的方怯笔右二亲手悭过数次可茯满总結果级主瓦操柞步驟制备感受态细菌用含目的基因的质粒转化细菌小量培养转化的细菌小量提取质粒小量酶切质粒电泳鉴定大量培养转化的细菌大量提取质粒大量酶切质粒电泳分离、回收及纯化标记探针石蜡切片的处理预杂交、杂交杂交后处理抗体连接、显色制备感受态细菌【试剂及配制】1 LB液体培养基在900ml胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g酵母提取物(bacto-extract) 5gNaCl 10g5mol NaOH调节pH至7.0 対储I试欷环启讦•證容为1000ml 橋儿朋20min。

2 0.1mol CaCI21.1g 90ml二燕水「:匚容至100ml •用0.22卩m滤器过滤除菌置4 C保存。

【材料】大肠杆苗I菌落或冻存茵种也对以苏戏IH的感受态细菌重新制备新的感受态。

【操作方法】1 37C培养12 16h I5ml LB 37C 振摇200r/mi n 1ml加入含100ml LB培养基的500ml毛形烧抱37 200 300r/min 约2 3h将烧瓶取出立即置冰浴10 15mi n2 . 50ml离心管小3 4C离心5000g x 10min 厅收汀］〉|4 1min5 用沐预冷鬥O.lmol CaCI2 10ml 'I1'昱|/|牟首讣:浴30min6 4｛国心5000g x 10min 齐上清创宜”芒汎上1min7 'T 4ml用冰预冷的0.1molCaCI2 动件观-怦8 '7 4 C 冰箱12 24h感受态细菌的冻存一次二.备i u感爱态不葩用甕晶存起来备用。

CISH原位杂交步骤实验流程：一．细胞爬片或者冰冻切片1.冰冻切片厚度5-8um，用防脱载玻片；细胞爬片的盖玻片要用多聚赖氨酸处理。

防止脱片。

2.固定：用RNA Free4%多聚甲醛室温固定20-30min，用DEPC 水充分水洗，自然晾干后，-20℃冷冻可保存2周以上。

3.制作湿盒：取出保湿盒，用酒精正反面喷洒消毒，晾干，垫上双层纸巾，用5×SSC（35ml）+甲酰胺（35ml）湿润。

4.30%H2O21份+9份纯甲醇混合液室温处理10min。

DEPC水洗3次，每次1min;5.切片置于湿盒内，用0.2mol/L盐酸滴于组织上，常温放置15min，用DEPC水洗2次，每次1min（盐酸可中和带电荷的碱性蛋白，降低背景）6.蛋白酶K覆盖组织，分子杂交仪中37℃20min。

蛋白酶K可以消化和暴露被遮蔽的靶核酸，增加探针的结合效率。

7.用0.2%或0.1mol/L甘氨酸洗液洗1min（现用现配），终止蛋白酶K。

8.PBS洗两次，每次一分钟。

9.用4%PFA多聚甲醛固定组织10min。

10.PBS洗三次，每次1min。

11.用acetic anhydride乙酸酐ph=8.0（乙酰化作用，降低背景）室温洗5min，2次。

12.用PBS洗5次，每次1min。

13.用5×SSCph=7.5洗两次，每次1min。

14.切片放置湿盒内，用预杂交液覆盖组织，65℃预杂交1h。

15.500ng/ml digoxigenin-labeled pube探针覆盖切片，在杂交仪内62-70℃避光反应24~72h，反应温度与反应时间视不同的组织与探针而定，建议一般65℃48h。

16.用2×SSC ph=7.5，室温洗1次，1min。

17.用甲酰胺加4×SSC ph=4.5 1:1混合液在60℃或65℃洗三次，每次20min。

18.用PBS洗5次，每次1min，室温。

19.将切片置于湿盒内，用封闭液覆盖切片，室温反应至少30min。

原位杂交流程第一天（全程DEPC水，注意不要污染）1配制4%PFA固定液，pH调至9.0-10.0；2用酒精棉擦干净展片台，升温到50 ℃；3从-80 ℃冰箱中取出冰冻切片，在50 ℃烤片台上烘片2-3 min（目的避免形成液滴）；4染缸中，4% PFA固定1 h；51×PBS洗涤2次，每次5 min；6氯仿去脂肪，5 min；71×PBS洗2次，每次5min；81% Triton-X100透膜20 min；此期间配预杂交液，杂交液及湿盒底部等渗液。

9染缸中，1×PBS洗涤3次，每次5 min；10预杂交：在切片上滴加预杂交液（20-100 μl/片，视组织大小而定），要均匀的覆盖在组织上，室温下载湿盒中静置15 min。

11探针在85 ℃ PCR仪中变性3 min后，立即放回冰上静置2 min（因此需要在实验开始时制冰；或是将铝盒盛装一些水敞口放在-20 ℃，1 h左右即可结冰，并可一直保存）。

探针变性后，按1 μl/100μl杂交液（浓度控制在1—2 ng/μl之间）加入杂交液，混匀，每张片子上滴加20-50 μl/片杂交液，加盖玻片后，湿盒中55 ℃杂交过夜。

第二天1开启水浴锅，设定为55 ℃，预热。

配制5×SSC（50% 甲酰胺）2份，2×SSC（50% 甲酰胺）1份，0.2×SSC（50% 甲酰胺）2份，0.2×SSC（H2O）1份。

前5个染缸用PE手套套上，放入水浴锅预热洗涤液15 min；最后一个在室温放置。

2将切片从湿盒取出倾倒掉杂交液，洗涤：5×SSC（50% 甲酰胺），55 ℃，5 min；5×SSC（50% 甲酰胺），55 ℃，15 min；2×SSC（50% 甲酰胺），55 ℃，30 min；0.2×SSC（50% 甲酰胺），55 ℃，30 min；0.2×SSC（50% 甲酰胺），55 ℃，30 min。