实验三超氧化物歧化酶SOD的提取及活性测定

SOD(超氧化物歧化酶)活性测定氮蓝四唑法一、原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)普遍存在动、植物的体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下面的反应：o 2.-+H O 222+O H ＋反应产物H 2O 2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性的大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易被氧化而产生超氧阴离子，超氧阴离子可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大吸收。

而SOD 可清除超氧阴离子，从而抑制了甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶的活性愈低，反之酶的活性俞高。

据此可计算出酶活性的大小。

二、材料、仪器设备及试剂(一)材料植物器官(花瓣、叶片等)(二)仪器设备冰箱、低温高速离心机、微量加样器 (1mL 、20μL 、100μL)、移液管、精密电子天平、UV-752型紫外分光光度计、试管、研钵、剪刀、镊子、荧光灯(反应试管处照度为4000Lux 或Lx)(三)试剂(1) 0.05mol/L 磷酸缓冲液(PH7.8)。

(2) 130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液：称1.9399gMet 用磷酸缓冲液定溶至100mL 。

(3)750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT 用磷酸缓冲液定溶至100mL ，避光保存。

(4)100μmol/LEDTA -Na 2溶液：称取0.03721g EDTA-Na 2，用磷酸缓冲液定溶1000mL 。

(5)20μmol/L 核黄素溶液：称取0.0753g 核黄素用蒸馏水定溶到1000mL ，避光保存。

三、试验步骤(一)酶液的提取(1)称取植物材料(去叶脉)0.2g ，加1ml 预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使体积为5mL。

取2mL于1000r/min下离心20min，上清液即为SOD粗提液。

SOD 、CAT 、POD 测定方法一、超氧化物歧化酶（一、超氧化物歧化酶（SOD SOD SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法））活性测定（氮蓝四唑光化还原法））活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制、试剂的配制（1）0.05mol/L 磷酸缓冲液磷酸缓冲液(PBS (PBS (PBS，，pH7.8)pH7.8)：：A 母液：母液：0.2mol/L 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液磷酸氢二钠溶液: : 取Na2HPO4Na2HPO4••12H2O （分子量358.14358.14））71.7g 71.7g；；B 母液：母液：0.2mol/L 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4NaH2PO4••2H2O 2H2O（分子量（分子量156.01156.01））31.2g 31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml 1000ml。

0.05mol/L PBS （pH7.8pH7.8）的配制：分别取）的配制：分别取A 母液母液(Na2HPO4) 228.75ml (Na2HPO4) 228.75ml ，B 母液(NaH2PO4) 21.25ml ，用蒸馏水定容至，用蒸馏水定容至1000ml 1000ml。

（2）14.5mM 甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met 用磷酸缓冲液（pH7.8pH7.8））定容至1000ml 1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml 100ml。

（4）60μM 核黄素溶液：核黄素溶液：取取0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml 100ml，，避光保存。

存。

（5）2.25mM 氮蓝四唑氮蓝四唑(NBT)(NBT)(NBT)溶液：取溶液：取0.1840g NBT 用PBS 定容至100ml 100ml，避光，避光保存。

保存。

酶液制备：取0.2g 0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入2ml 50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液（pH7.8pH7.8））在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、℃、12000g 12000g 下离心20min 20min，上清液即为酶液。

一、原理1.超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是一种能专一地清除超氧离子自由基（）的金属酶，它具有抗衰老、抗辐射、抗炎及抗癌等作用因而在医药、化妆品及食品工业等方面有了广泛的应用前景。

SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。

按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD（二聚体，蓝绿色）、Mn-SOD（紫红色）和Fe-SOD（黄褐色）三种。

SOD催化下述反应：2+2→+。

机体内的过量和不足均对机体不利，SOD 对过量的的及时清除保证了机体内的含量相对的平衡。

机体内的形成可分为生理性和病理性两方面。

在一些正常生理过程中会形成一些。

例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些。

在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的。

过量的如不及时清除，会对细胞损伤。

SOD将歧化为和，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化或氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。

2.有机溶剂沉淀法分离纯化蛋白质本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行分离纯化。

有机溶剂沉淀法的基本原理：①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀；②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。

常见的有机溶剂有丙酮和乙醇等。

3.邻苯三酚自氧化法测定酶活力酶活性测定的方法有以下几种方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法及亚硝酸法等。

本实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为1个酶单位。

邻苯三酚自氧化法的原理：利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，产生，生成有颜色的中间产物。

反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，吸光度值与反应时间能在3～4 min内维持线性关系。

摘要：通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。

跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。

实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力以及总蛋白不断减小，比活力不断上升，最终得到的结果为总纯化倍数为0.68，活性得率为5.24%。

一、前言：超氧化物歧化酶简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶。

分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。

在微生物中主存于需氧菌。

SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2.H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O 和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。

它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。

自1968 年发现SOD 后，立刻引起科学界的高度重视，近40 年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD 也有了产品.国外从牛红细胞中制得的超氧化物歧化酶，其商品名为Orgotein.不少人研究Orgotein的药理性质，证明它无毒，无抗原性，能抗发炎、抗超氧离子、抗病毒感染。

二十世纪80 年代后期，我国关于SOD 的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。

SOD作为治因而受到医药界的关注。

目前中国国内已进入临床试验阶段。

本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。

二、实验材料与方法：<一>材料:绿豆种子,市售新鲜绿豆种子浸泡蒸馏水24小时备用.<二>试剂:葡聚糖（sephadexG-100）, NaCl（AP）, 磷酸氢二钠（AP）, 磷酸二氢钠（AP）, 三羟甲基氨基甲烷（Tris）, 盐酸（浓盐酸），硫酸铵（AP）, PEG6000 ，考马斯亮蓝G250 , 磷酸，乙醇（95%），牛血清蛋白BSA , 连苯三酚(焦性没食子酸), EDTA(钠盐) , 超氧化物歧化酶（sigma公司）。

动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定原理超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。

它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。

离子(02-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。

由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2 -)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。

按金属辅基成分的不同可分成3种类型。

最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D 酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。

每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。

第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。

第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。

Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。

l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。

自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。

迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。

藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。

为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。

超氧化物歧化酶（SOD）活力测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。

这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。

近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。

过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。

自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。

生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。

植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。

抗坏血酸（V C）、V E和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。

SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。

自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。

二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。

超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。

自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。

如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。

H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。

一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。

网上说定容到100ML我也不懂。

拜托（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。

取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。

2、酶活性测定2．显色反应取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。

- · O2 -· O 2 + + 2H + H 2O 2 + O 2 SOD 玉米超氧化物歧化酶（SOD ）的提取及活性测定一、目的1．通过对玉米超氧化物歧化酶（SOD ）的提取及活性测定，掌握硫酸铵盐析沉淀蛋白质和超滤浓缩的方法和原理。

2．掌握测定超氧化物歧化酶（SOD ）的活力和比活力的方法。

3．掌握分级盐析沉淀的方法和原理，以及透析的方法和原理。

二、原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，简称SOD ），它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：Cu,Zn-SOD ，Mn-SOD ，Fe-SOD 。

SOD 催化如下反应：在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂，能治疗人类多种病症，如炎症、脑外伤、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老等，对生物体有保护作用。

在玉米中，SOD 主要存在于胚芽中，当将萌发的玉米籽粒打浆破碎后，以中性盐沉降其蛋白质部分，SOD 就存在于沉淀中，但其中有许多杂蛋白，因此在盐析时先用40%（NH 4）2SO 4去除杂蛋白部分，再用90%（NH 4）2SO 4饱和上清液，经过一定时间后，再将盐析液离心，取其沉淀进行透析，一定时间后，则其中的SOD 成分即被浓缩分离。

超滤也是一种蛋白质浓缩方法，其工作原理是运用液压迫使溶质透过膜，并按溶质分子量、形状、大小的差异，把大溶质分子阻留在膜的一侧，而小分子溶质则随溶剂透过膜到另一侧，使大小溶质分子得到分离。

利用此原理只要选择适当的超滤膜即可将玉米浆中SOD 与其它小分子杂蛋白、可溶性糖等分离，并去除水份，得到SOD 浓缩液。

SOD 活性的测定：采用NBT 光还原法。

其原理为核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O 2-，当加入NBT 后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），既而还原成二甲月替（呈兰色）。

该产物在560nm 下有最大吸收峰。

当加入SOD 时，可以使超氧自由基与H +结合生成H 2O 2+O 2，从而抑制了NBT 光还原的进行，使兰色二甲月替 生成速度减慢。

超氧化物歧化酶（SOD ）活性的测定方法
一、试剂
1. 0.1mol/L HCl
2. 10mmol/L HCl
3. 0.1mol/L Tris 标准溶液：12.114g 三羟甲基氨基甲烷溶于蒸馏水，并定容至1000ml.
4. 50mmol/LTris 缓冲溶液：50ml0.1mol/L Tris 标准溶液中加入0.1mol/L HCl 19.9～22.0ml,定容至100ml ，PH 为8.20。

5. 30mmol/L 邻苯三酚盐酸溶液：3.7833g 邻苯三酚溶于10mmol/LHCl 中，并用10mmol/LHCl 定容至1000ml.
二、仪器
1. 紫外分光光度计
2. 酸度计
3. 恒温水浴锅
三、操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率测定
在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris 缓冲溶液，于25℃保温20min,加入10～20ul 30mmol/L 邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm 下，每隔1min 测吸光值一次，空白以10mmol/L HCl 代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 OD/min 左右。

%1004
min 1min 5⨯值值－第第自氧化速率＝OD OD 2.SOD 活性测定
将样液加入到Tris 缓冲溶液中，其余步骤同自氧化速率测定方法。

活力单位定义：将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%的酶量定义为一个单位（u ）。

样品质量样液体积样品稀释倍数自氧化速率速率自氧化速率－样液氧化＝活力（⨯⨯⨯⨯5.4%50%100)/SOD ml u。

超氧化物歧化酶活性的测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物体内一种重要的抗氧化酶，它能够将有害的超氧自由基（superoxide radical, O2•⁻）转化为氧和过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2），从而防止细胞和组织受到氧化应激的损伤。

因此，超氧化物歧化酶活性的测定对于研究氧化应激与各种疾病的关系具有极大的重要性。

超氧化物歧化酶活性的测定方法有多种，以下主要介绍两种常用的方法：一、停止法停止法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，用发生超氧自由基的化学反应（如PMS-NADH系统）制造超氧气自由基以模拟体内超氧自由基的生成，观察并测定经超氧化物歧化酶处理后剩余的超氧自由基量的下降速率，通过计算算出SOD活性。

步骤：1、准备试剂：PMS（N-甲基-苯肼）溶液、NADH（辅酶Ⅰ）溶液、EDTA-Na2溶液、碳酸氢钠-硫酸溶液、紫外分光光度计。

2、制定反应液：取适量PMS溶液和NADH溶液加入缓冲液中，使最终浓度分别为100μM和780μM，混匀。

3、制备样品：用生理盐水或缓冲液将要测定的样品进行稀释，并在4℃下保存备用。

4、制备标准品：以SOD标准品（0-10U/mL）为浓度系列，每组分别加入50μL的样品和反应液，在37℃水浴中反应30min。

5、反应终止：以碳酸氢钠-硫酸溶液均匀混合停止反应。

6、测定吸光度：用紫外分光光度计测定反应液的吸光度，波长设置在340 nm。

7、计算超氧化物歧化酶活性：计算标准品的反应速率（Vx）和酶反应的反应速率（Vt），按照以下公式计算超氧化物歧化酶活性：SOD活性（U/mL）=（Vt–Vx）/Vx×标准品的酶活力二、降解法降解法测定超氧化物歧化酶活性的原理是，将超氧自由基产生物质注入试管中，随着时间的推移，样品中的超氧自由基将越来越少。

超氧气自由基和非酶物质将通过电子色谱法被检测和测量。

1、制备反应液：将样品加入含有相应浓度的降解剂中，使反应液中超氧气自由基的浓度达到稳定状态。

超氧化物歧化酶（SOD）活力测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。

这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。

近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。

过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。

自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。

生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。

植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。

抗坏血酸（VC ）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。

SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。

自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。

二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。

超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。

自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。

如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。

超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。

H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。

一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。

1．实验材料：玉米籽粒。

2．试剂：注意配好每一试剂时，应立即转入试剂瓶当中，不要将试剂放在容量瓶当中存放，一定要及时将试剂瓶贴好相应的标签，标明溶液的浓度、pH值、体积、试剂名称、配制时间、配制人。

配制时一定要标清，使用时注意不要将其弄掉，这一点将给您带来无比的快捷和方便。

在未经老师允许的情况下，不要随意倒掉实验室内的任何药品或试剂。

（1）1％次氯酸钠：用移液管准确吸取4mL次氯酸钠，置于500mL大烧杯中，再用量筒准确量取400mL自来水稀释该次氯酸钠。

（2）提取缓冲液：0.05mol/L磷酸氢二钾—磷酸二氢钾缓冲液，pH7.8。

具体配制方法如下：首先是1mol/L pH7.8的磷酸钾缓冲液母液的配制。

a. 1mol/L KH2PO4溶液：称取13.6g KH2PO4，置于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。

b. 1mol/L K2HPO4溶液：称取22.8g K2HPO4，置于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，可稍加热，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。

c. 取5mL a 液与55mL b液混合后，调节pH为7.8，该液即为1mol/L的磷酸钾缓冲液母液。

d. 0.05mol/LpH7.8磷酸钾缓冲液的配制（内含1mmol/L EDTA及0.1% β-巯基乙醇）：称取EDTA·2Na·2H2O 0.372g置于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL容量瓶中，用移液管吸取1mL β-巯基乙醇置入该1 000mL 容量瓶中，用50mL量筒量取50mL c液至该1 000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。

（3）测试缓冲液：0.026mol/L Met—磷酸钠缓冲液具体配制方法：首先是0.1mol/L pH7.8 Na2HPO4—NaH2PO4缓冲液母液的配制。

a. 称取Na2HPO4·12H2O（MW=358.14）35.814g于100mL小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法一、超氧化物歧化酶(SOD)活性测定(氮蓝四唑光化还原法)1、试剂得配制(1)0、05mol/L磷酸缓冲液(PBS,pH7、8):A母液:0、2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O(分子量358、14)71.7g;B母液:0、2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4·2H2O(分子量156、01)31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0、05mol/L PBS(pH7、8)得配制:分别取A母液(Na2HPO4) 228、75ml,B母液(NaH2PO4) 21、25ml,用蒸馏水定容至1000ml。

加入10gPVP(聚乙烯吡咯烷酮)参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理与技术、高等教育出版社,2000:267～268。

(2)130mmol/L甲硫氨酸溶液:取1、399g Met用磷酸缓冲液(pH7、8)定容至100ml。

网上说定容到100ML我也不懂。

拜托(3)100μmol/L EDTA-Na2溶液:取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml;(4)100μM核黄素溶液:取0、0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml,避光保存,随用随配,并稀释10倍(5)750μmol/L氮蓝四唑(NBT)溶液:称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存;酶液制备:取一定部位得植物叶片(视需要定,去叶脉)0.5g于预冷得研钵中,加2ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆,加缓冲液使终体积为10ml。

取5ml于10000r/min下离心10min,上清液即为SOD粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完得需要放在4℃得冰箱里。

2、酶活性测定2.显色反应取试管(要求透明度好)5支,3支为样品测定管,1支为对照管,另外1支作为空白,按表39-1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处,其它各管于4000lx日光灯下反应20min(要求各管受光情况一致,反应室得温度高时时间可适当缩短,温度低时时间可适当延长)。

⽣物化学实验报告⽣物化学实验报告动物营养研究所张树润2015.10.12猪⾎中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活性测定⼀．实验⽬地1.通过实验了解活性物质的分离提取。

2.了解超氧化物歧化酶的基本功能与应⽤。

⼆．实验原理超氧化物歧化酶是⼀种酸性蛋⽩，是唯⼀以⾃由基为底物的酶，具有清除⾃由基的功能酶，在酶分⼦上共价连接⾦属辅基，因此它对热、PH、以及某些理化性质表现出异常的稳定性。

该酶⾸次从⽜红细胞中分离得到，是⼀种蓝⾊含铜蛋⽩，之后，研究发现该蛋⽩酶具有催化氧发⽣歧化反应的能⼒，因此将其命名为超氧化物歧化酶1-2。

超氧化物歧化酶是⼀种能专⼀地清除超氧离⼦⾃由基（O2-）的⾦属酶，它具有抗衰⽼、抗辐射、抗炎抗癌等作⽤，因⽽在医药（如关节炎、红斑狼疮等疾病的治疗3）、化妆品(有防晒抗炎效果4)、⾷品⼯业（SOD灵芝菌5等）等⽅⾯具有了⼴泛的应⽤前景。

超氧化物歧化酶是⼴泛存在于⽣物体内的⼀种⾦属酶,可催化超氧阴离⼦⾃由基(O2-)与H+发⽣歧化反应, ⽣成H2O2和O2。

SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。

超氧化物歧化酶按照它所含⾦属离⼦的不同，可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。

Cu-Zn-SOD为⼆聚体，呈蓝绿⾊；Mn-SOD呈紫红⾊；Fe-SOD呈黄褐⾊。

SOD提取、纯化制备⽅法各异, 常⽤⽅法有经典的溶剂沉淀法、盐析法、超滤法和层析法等6-7。

本实验采⽤有机溶剂沉淀法8以新鲜猪⾎为原料，从中提取SOD并进⾏纯化。

酶活⼒测定可⽤以下⽅法：邻苯三酚⾃氧化法9、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素⾃氧化法、亚硝酸法等。

该实验SOD酶活性采⽤邻苯三酚⾃氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚⾃氧化速率达50%的酶量定义为⼀个酶单位。

样品中蛋⽩质含量⽤考马斯亮蓝G-250法测定。

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红⾊，与蛋⽩质结合呈现蓝⾊。

植物组织中超氧化物歧化酶活性测定植物组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定是一项重要的生物化学实验，它有助于了解植物体内抗氧化系统的运行机制及其在应对环境压力中的作用。

以下是测定植物组织中超氧化物歧化酶活性的实验步骤和注意事项。

一、实验材料1.实验植物：选择新鲜、健康的植物组织，如叶片、根或茎。

2.实验试剂：包括磷酸缓冲液（pH 7.8）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氮蓝四唑（NBT）、核黄素、酶提取液等。

3.实验设备：包括分光光度计、离心机、研钵、试管、滴定管等。

二、实验步骤1.酶提取：将植物组织研碎，加入适量的酶提取液，充分研磨并混合均匀，然后置于离心机中以3000-4000 r/min的速度离心10-15分钟，得到清亮的上清液。

2.酶活性测定：取3毫升磷酸缓冲液、0.1毫升的EDTA、0.1毫升的氮蓝四唑（NBT）、0.1毫升的核黄素和0.002毫升的酶提取液，混合均匀后用分光光度计在560纳米处测定吸光度。

3.空白对照：取3毫升磷酸缓冲液、0.1毫升的EDTA、0.1毫升的氮蓝四唑（NBT）和0.1毫升的核黄素，混合均匀后用分光光度计在560纳米处测定吸光度。

4.数据记录：记录酶活性测定和空白对照的吸光度值，并计算超氧化物歧化酶活性。

三、注意事项1.实验过程中要保证所用试剂的纯度和新鲜度，避免影响实验结果。

2.离心机使用前应预热，保证离心的效果和效率。

3.在酶活性测定中，加入酶提取液时应十分小心，避免产生气泡，影响吸光度的测定。

4.在整个实验过程中要保证温度、光照等环境因素的一致性，以减小误差。

5.在数据处理时，应按照公式计算超氧化物歧化酶活性，并进行统计分析和比较。

四、结果分析通过对实验数据的分析，可以得出不同植物组织中超氧化物歧化酶活性的大小及其变化规律。

这些数据可以帮助我们了解植物体内抗氧化系统的运行机制及其在应对环境压力中的作用。

例如，当植物受到逆境条件的影响时，超氧化物歧化酶的活性可能会发生变化，通过比较不同植物组织的超氧化物歧化酶活性，可以筛选出抗逆性较强的植物品种，为农业生产提供参考。