阿托伐他汀对大鼠脑缺血再灌注脑组织Livin_caspase3表达的影响

[3]邓玉清,吴瑞芳,郭燕燕,等.病原体及巨细胞病毒感染与输卵管妊娠的关系[J].中华妇产科杂志,2004,39(2):94.[4]张帝开,覃春容,李秀云,等.女性下生殖道解脲支原体的定量检测与致病性研究[J].中国实用妇科与产科杂志, 2005,21(11):656.[5]顾美皎.泌尿生殖道衣原体和支原体感染的规范治疗[J].中国实用妇科与产科杂志,2005,21(11):645.[6]魏明久.解脲支原体生殖道感染3种治疗方法疗效观察[J].中国实用妇科与产科杂志,2005,21(11):689.(收稿日期:2008209216)・药物与临床・阿托伐他汀对大鼠脑缺血再灌注脑组织Livin、caspase3表达的影响张　益1,蔡志友2,晏　勇2(1.重庆市第八人民医院神经内科　400015;2.重庆医科大学附属第一医院神经内科　400016) 摘　要:目的　观察阿托伐他汀(Atorvastatin)对脑缺血再灌注大鼠脑组织Livin、caspase3表达的影响,探讨阿托伐他汀对脑保护作用机制。

方法　Wistar大鼠随机分为正常组(N组)、假手术组(S组)、模型组(M组)、阿托伐他汀治疗组(M T组)。

处死大鼠取样,采用免疫组织化学和蛋白质印迹法检测大鼠脑组织Livin、caspase3的表达,用图像分析仪测定光密度值,光镜下分析细胞表达阳性细胞数百分率。

结果　M T组caspase3表达较M组降低(P<0.05),M T组Livin表达较M组增高(P<0.05); M T组Livin、caspase3表达较N、S组增高(P<0.05);M组Livin、caspase3表达较N、S组显著增高(P<0.01)。

结论　阿托伐他汀能降低脑缺血再灌注大鼠脑组织caspase3、增强Livin表达,阿托伐他汀可以通过降低脑缺血再灌注大鼠脑组织caspase3、增强Livin表达抑制细胞凋亡发挥脑保护作用。

关键词:脑缺血再灌注;阿托伐他汀;细胞凋亡中图分类号:R365.743;R972文献标识码:B文章编号:167128348(2009)0921112203 细胞凋亡是脑缺血损伤重要的病理生理机制,脑缺血损伤程度和细胞凋亡有着直接的联系,细胞凋亡也参与脑缺血损伤机制过程。

他汀类药物(statins),即32羟基232甲基戊二酸单酰辅酶A(32hydro2xy232methylglutaryl coenzyme A,HM G2CoA)还原酶抑制剂,是一类强效降胆固醇药物,具有安全性高、耐受性好等优点。

研究结果证明该类药物除能明显调节血脂外,还具有多向性抗动脉粥样硬化作用,能显著降低冠心病及卒中的发病率,减少心、脑血管事件的发生率;在心、脑血管疾病的防治方面有着广泛的作用[123]。

他汀类药物不但可以减少脑卒中的发生,而且还可以改善脑卒中患者的临床预后。

本实验采用阿托伐他汀对大鼠脑缺血再灌注进行治疗干预,观察大鼠脑组织Livin、caspase3的表达,探讨阿托伐他汀的脑保护作用机制。

1　材料与方法1.1　材料1.1.1　实验动物和分组　健康成年Wistar大鼠36只,雌性,体质量200～250g,第三军医大学野战医院动物研究所提供,动物中心许可证号:渝实动设施准第260号。

Wistar大鼠适应性喂养1周,经筛选,大鼠按抓取随机原则分为6组:正常组(N组),假手术组(S组),阿托伐他汀治疗组(M T组,分为缺血再灌注12h和24h),缺血再灌注组(M组,分为缺血再灌注12h和24h组),每组6只。

参照文献[527]描述的方法制作大鼠脑缺血再灌注模型,动物苏醒后参考Longa等[4]的5分评分法,2分或2分以上者入选本实验。

将阿托伐他汀用生理盐水稀释成0.5mg/mL浓度备用。

正常组不给予任何处理;假手术组插入0.5～1.0cm线栓,予以等量的生理盐水灌胃;在M 组的基础上,M T组于缺血后120min及14h各给予阿托伐他汀10mg・kg-1・d-1灌胃;M组行缺血和再灌注处理并予以等量的生理盐水灌胃。

阿托伐他汀的剂量选择参考Oria等[8]和Hong的阿托伐他汀神经保护作用机制研究。

1.1.2　主要试剂及设备　阿托伐他汀钙片:北京红惠生物制药股份有限公司,生产日期:2005年9月2日,生产批号: 0500934,剂量:20mg/片;Livin,caspase3免疫组织化学检测试剂盒:北京搏奥森生物科技有限公司;Mias图像分析系统(3.0):四川大学图像分析研究所。

1.2　方法1.2.1　免疫组织化学染色法　实验大鼠于缺血12h和缺血24h,用3.5%水合氯醛麻醉,打开胸腔,右心室内取血2mL,分离备存。

取血后立即经升主动脉快速灌注生理盐水,直至右心房流出液清亮为止。

然后用4%多聚甲醛(p H7.4的磷酸缓冲液配制)150mL灌注固定,断头取脑。

冠状切取视交叉后部脑组织,将大脑置于4%甲醛中固定。

冠状切取大脑视交叉部位组织,常规梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,室温保存备用。

免疫组织化学染色法严格按照说明书步骤进行。

图像处理:采用Mias图像处理系统,每组大鼠各取一张免疫组化切片,每张随机取5个视野,分别分析Livin、caspase3的光密度值,计算Livin、caspase3的阳性细胞百分率。

取平均值作为统计参数。

全部数据输入计算机进行统计学处理。

1.2.2　Western blotting　用Western blotting方法检测额顶叶皮质和海马Livin、caspase3蛋白含量。

10%的SDS2PA GE 凝胶电泳,上样量为28μg。

电泳条件:4℃。

电流20～30mA。

电泳结束后,进行蛋白质转膜。

转膜条件:采用孔径为0.22m 的硝酸纤维素膜(NC),4℃,电流400mA,转膜3h。

Western blotting杂交步骤如下:10%脱脂牛奶封闭NC膜1h,T Y BS (20mmol/L Tris2HCl,p H7.5;0.15mmol/L NaCl;0.05% Tween20)漂洗3次,每次10min,然后室温下与A PP一抗(1∶3000)杂交反应3h,T TBS漂洗同前。

再将NC膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶5000)杂交反应1h。

最后用T TBS漂洗NC膜3次,每次10min,加入ECL试剂反应5min,保鲜膜包裹,暗室进行X线胶片曝光、显影和定影。

然后同一张NC膜再与β2actin(1∶1000)进行Western blotting 杂交反应,并获得蛋白印迹结果。

Western blotting条带经G el 2oc 凝胶成像分析系统扫描处理,计算单位吸光度值和条带。

1.3　统计学方法　所有数据以x ±s 表示,全部数据采用SPSS11.0软件包进行统计学处理,两组之间同一时相点比较采用t 检验,P <0.05差异有统计学意义。

2　结 果2.1　各组大鼠脑组织caspase 3的表达　M 组脑组织caspase 3明显表达。

与同时点M 组比较,M T 组caspase 3光密度值和阳性细胞百分率差异均有统计学意义(P <0.05),M T 组阳性细胞百分率降低,光密度值增高。

M 组与S 组和N 组大鼠的检测结果间均差异有统计学意义(P <0.01),M T 组与S 组和N 组检测结果间差异有统计学意义(P <0.01),见图1、2。

表1 各组大鼠脑组织caspase 3的表达组别阳性细胞百分率(%)12h24h 光密度LDV12h 24h N 组 1.4±2.3 1.61±2.1196.0±5.7196.6±4.8S 组3.9±2.43.3±2.2196.3±3.6195.6±4.4M T 组20.3±2.3■◆23.7±2.1■◆150.6±5.8■◆153.3±5.4■◆M 组31.1±3.2■32.5±2.3■114.3±5.2■116.6±5.1■ 与N 、S 组比较,■:P <0.01;与M 组比较,◆:P <0.05。

表2 各组大鼠脑组织Livin 的表达组别阳性细胞百分率%12h24h 光密度LDV12h 24h N 组 6.4±3.4 6.1±2.4163.3±3.2176.3±2.3S 组7.9±2.48.0±2.8161.4±2.6164.6±2.7MT 组37.2±3.2■◆38.7±2.1■◆152.6±2.6■◆155.3±2.4■◆M 组26.3±2.7■27.3±2.3■142.3±3.4■146.6±2.1■ 与N 、S 组比较,■:P <0.01;与M 组比较,◆:P <0.05。

正常组(×400),胞浆、胞核无黄染;假手术组(×400),胞浆微量黄染,胞核无黄染,caspase 3在胞浆中微量量表达,在胞核中无表达;M12h 组(×400),caspase 3在胞浆中大量黄染,在胞核中少量黄染;M24h 组(×400),胞浆、胞核均黄染,胞浆、胞核中均表达;M T12h 组(×400),caspase 3胞浆、胞核少量黄染;M T24h 组(×400),caspase 3胞浆、胞核少量黄染。

图1 caspase 3免疫组织化学检测结果2.2　各组大鼠脑组织Livin 的表达　M 组脑组织Livin 可见明显表达。

与同时点M 组比较,M T 组Livin 光密度值、阳性细胞百分率均有不同程度升高(P <0.05)。

M 组与S 组和N 组大鼠的检测结果间均差异有统计学意义(P <0.01),M T 组与S 组和N 组检测结果间差异有统计学意义(P <0.01),见图3、4。

与M 组比较,3P <0.01。

图2 caspase 3蛋白质印迹检测 正常组(×400),胞浆、胞核无黄染;假手术组(×400),胞浆微量黄染,胞核无黄染,caspase 3、Livin 在胞浆中微量量表达,在胞核中无表达;M12h 组(×400),Livin 胞浆黄染,胞核少量黄染;M24h 组(×400),胞浆、胞核均黄染,胞浆、胞核中均表达;M T12h 组(×400),Livin胞浆、胞核中明显表达;M T24h 组(×400),Livin 胞浆、胞核中明显表达。