纳米金对SP C-A1肺癌细胞体外放射增敏作用的研究

纳米金对ＳＰＣ⁃Ａ１肺癌细胞体外放射增敏作用的研究１㊀２１３００３㊀常州市第一人民医院放疗科２㊀通讯作者，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｏｎｇｂｉａｏｌｉｕ＠１６３．ｃｏｍ２１００２９㊀南京㊀南京医科大学第一附属医院放疗科徐国平１，姚志峰，杨㊀航，刘永彪２㊀㊀ʌ摘㊀要ɔ㊀目的㊀研究纳米金联合兆伏级射线对肺腺癌ＳＰＣ⁃Ａ１细胞的体外放射增敏作用，并从细胞周期㊁细胞凋亡角度探讨纳米金的放射增敏机制㊂方法㊀选用肺腺癌ＳＰＣ⁃Ａ１细胞进行体外培养，采用ＣＣＫ⁃８法检测不同浓度纳米金（０㊁１㊁０．５㊁０．２５㊁０．１２５㊁０．０６２５ｍｍｏｌ／Ｌ）处理ＳＰＣ⁃Ａ１细胞２４㊁４８㊁７２ｈ后的细胞毒性，确定纳米金溶液的实验浓度；经纳米金溶液培养的ＳＰＣ⁃Ａ１细胞株分别给予６ＭＶＸ线和４ＭｅＶ电子线照射０㊁１㊁２㊁４㊁６㊁８Ｇｙ后，体外细胞培养克隆法研究纳米金的放射增敏作用，计算存活分数㊂使用单击多靶模型公式拟合，计算出Ｄｑ㊁Ｄ０等放射生物学参数和放射增敏比（ＳＥＲ）；流式细胞仪检测纳米金处理ＳＰＣ⁃Ａ１细胞２４ｈ后各组的细胞凋亡和细胞周期的变化㊂结果㊀不同浓度纳米金处理不同时间后，对ＳＰＣ⁃Ａ１细胞的增殖无明显抑制，确定以纳米金溶液初始浓度（０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ）作为实验浓度㊂直径２５ｎｍ㊁０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ的纳米金粒子联合６ＭＶＸ线和４ＭｅＶ电子线照射ＳＰＣ⁃Ａ１细胞的ＳＥＲ分别是１．１１１和１．２１４㊂流式细胞仪检测显示，纳米金不增加细胞的凋亡，但能明显增加射线对细胞的凋亡作用㊂细胞周期显示纳米金能加速细胞的Ｇ０／Ｇ１期，使细胞周期阻滞在Ｇ２／Ｍ期㊂结论㊀纳米金联合６ＭＶＸ线或４ＭｅＶ电子线对ＳＰＣ⁃Ａ１细胞有放射增敏作用，其机制可能与增加射线对细胞的凋亡和细胞周期同步化有关㊂㊀㊀ʌ关键词ɔ㊀纳米金粒子；㊀ＳＰＣ⁃Ａ１肺腺癌细胞；㊀放射增敏；㊀凋亡；㊀周期阻滞中图分类号：Ｒ７３４．２㊀㊀文献标识码：Ａ㊀㊀文章编号：１００９－０４６０（２０１５）０６－０４９２－０５ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｏｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆＳＰＣ⁃Ａ１ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｉｎｖｉｔｒｏ㊀㊀ＸＵＧｕｏｐｉｎｇ，ＹＡＯＺｈｉｆｅｎｇ，ＹＡＮＧＨａｎｇ，ＬＩＵＹｏｎｇｂｉａｏ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＲａｄｉａｔｉｏｎＯｎｃｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００２９，Ｃｈｉｎａ㊀㊀Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＬＩＵＹｏｎｇｂｉａｏ，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｏｎｇｂｉａｏｌｉｕ＠１６３．ｃｏｍ㊀㊀ʌＡｂｓｔｒａｃｔɔ㊀Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＡｕＮＰｓ）ｏｎＳＰＣ⁃Ａ１ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅｏｆｍｅｇａｖｏｌｔａｇｅｒａｙｒａｄｉａｔｉｏｎｔｈｅｒａｐｙａｎｄｐｒｏｂｅｉｔｓｒａｄｉｏｓｅｓｉｔｉｚｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＳＰＣ⁃Ａ１ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｖｉｔｒｏ．ＴｈｅｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＡｕＮＰｓ（０，１，０．５，０．２５，０．１２５，０．０６２５ｍｍｏｌ／Ｌ）ｏｎＳＰＣ⁃Ａ１ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｍｅａｓ⁃ｕｒｅｄｂｙＣＣＫ⁃８ａｔ２４，４８ａｎｄ７２ｈａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＴｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＡｕＮＰｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＣＣＫ⁃８ｍｅｔｈ⁃ｏｄ．ＳＰＣ⁃Ａ１ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｐｒｏｃｅｓｓｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｏｓｅｓｏｆ６ＭＶＸ⁃ｒａｙａｎｄ４ＭｅＶｅｌｅｃｔｒｏｎｂｅａｍｉｎｃｌｕｄｉｎｇ０，１，２，４，６，８ＧｙａｌｏｎｅｏｒｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈＡｕＮＰｓ（０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ））．Ｔｈｅｃｅｌｌｓｕｒｖｉｖａｌｆａｃｔｉｏｎ（ＳＦ）ｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇａｓｔａｎｄａｒｄｃｏｌｏｎｙ⁃ｆｏｒｍｉｎｇａｓｓａｙ．Ｃｅｌｌｃｙ⁃ｃｌｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄａｔ２４ｈａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＡｕＮＰｓ（０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ）ｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｓ⁃ｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ＣｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＳＰＣ⁃Ａ１ｃｅｌｌｓｗａｓｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＡｕＮＰｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｏｉｎｔｓｏｆｔｉｍｅ，ａｎｄｈａｄｎｏｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｔｉｍｅａｎｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．ＴｈｅｉｎｉｔｉａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＡｕＮＰｓ（０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ））ｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．ＴｈｅｅｎｈａｎｃｅｄｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆＳＰＣ⁃Ａ１ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｈａｓｂｅｅｎｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｒａｔｉｏ（ＳＥＲ）ａｔ３７％ｓｕｒｖｉｖａｌｌｅｖｅｌｗｅｒｅ１．１１１ａｎｄ１．２１４ａｔ２４ｈａｆｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＡｕＮＰｓｃｏｍ⁃ｂｉｎｅｄｗｉｔｈ６ＭＶＸ⁃ｒａｙａｎｄ４ＭｅＶｅｌｅｃｔｒｏｎｂｅａｍｒｅｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｗａｓｎｏｔｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙｉｎｄｉｖｉｄｕａｌＡｕＮＰｓ，ｂｕｔｔｈｅｒａｙｓｏｎｃｅｌｌａｐｏｐｔｏｓｉｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ．ＴｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅｗａｓａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄａｔｔｈｅＧ０／Ｇ１ｐｈａｓｅ，ａｎｄａｒｒｅｓｔｅｄａｔｔｈｅＧ２／ＭｐｈａｓｅａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈＡｕＮＰｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＡｕＮＰｓｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｅｎｈａｎｃｅ⁃ｍｅｎｔｏｆｒａｄｉａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｓｏｎＳＰＣ⁃Ａ１ｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｏｆｍｅｇａｖｏｌｔａｇｅＸ⁃ｒａｙｒａｄｉａｔｉｏｎｔｈｅｒａｐｙａｎｄｅｌｅｃｔｒｏｎｒａｄｉａｔｉｏｎｔｈｅｒａｐｙｂｅａｍｓ．Ｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｍａｙｒｅｌａｔｅｔｏｉｎｃｒｅａｓｅａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｃｅｌｌｃｙｃｌｅｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ．㊀㊀ʌＫｅｙＷｏｒｄｓɔ㊀Ｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；㊀ＳＰＣ⁃Ａ１ｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌ；㊀Ｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｅｎｈｅｎｃｅｍｅｎｔ；㊀Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；㊀Ｃｙｃｌｅａｒｒｅｓｔ㊀㊀肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌占所有肺癌病例的８０％ ８５％，小细胞肺癌占１５％ ２０％㊂放疗是肺癌的主要治疗手段之一，由于肿瘤细胞内在的放射敏感性较差，影响了疗效㊂放射增敏剂能提高肿瘤细胞对射线的敏感性而受到广泛的关注㊂使用具有肿瘤特异性的高原子序数物质的纳米颗粒，能增加肿瘤细胞毒性，减少正常组织的损伤，改善放疗的结果㊂目前许多临床前研究证实纳米金粒子能增强千伏级Ｘ射线对细胞的放射毒性效应［１］㊂其研究机理主要局限在纳米金与千伏级射线相互碰撞的物理机制上［２］㊂临床放疗中普遍使用兆伏级能量的光子线和电子线治疗深部肿瘤如肺癌㊁胰腺癌㊁肝癌和脑部肿瘤等，有关纳米金对高能量射线的增敏作用和机制研究较少㊂本研究探讨纳米金联合兆伏级射线对肺腺癌ＳＰＣ⁃Ａ１细胞的体外放射增敏作用，并从细胞周期和细胞凋亡角度分析其可能放射增敏机制㊂１㊀材料与方法１．１㊀主要试剂㊀自制直径２５ｎｍ的纳米金（ＡｕＮＰｓ）溶液（初始浓度０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ）；肺腺癌ＳＰＣ⁃Ａ１细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所；ＣＣＫ⁃８购自凯基生物公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；ＲＰＭＩ１６４０培养液㊁细胞凋亡和周期检测试剂盒购自北京保赛公司㊂１．２㊀纳米金的制备㊀使用１９７３年Ｆｒｅｎｓ创立的柠檬酸三钠还原法：０．１％ＨＡｕＣｌ４溶液１００ｍｌ，煮沸后迅速加入１０％柠檬酸三钠１．５ｍｌ，继续煮沸７ １０ｍｉｎ，溶液颜色由黄色变成酒红色，冷却至室温过夜㊂经紫外⁃可见光分光光度计检测ＡｕＮＰｓ溶液吸收峰峰值位于波长５２０ｎｍ处，证实ＡｕＮＰｓ直径在２５ｎｍ左右㊂溶液经０．２２μｍ微孔滤膜过滤除菌，４ħ保存备用，过滤液通过离心浓缩或用培养基稀释到所需浓度㊂１．３㊀ＳＰＣ⁃Ａ１细胞的培养㊀将处于对数生长期的ＳＰＣ⁃Ａ１细胞，用含１０％胎牛血清（ＦＢＳ）的ＲＰＭＩ１６４０完全培养液（内含青霉素１００Ｕ／ｍｌ和链霉素１００μｇ／ｍｌ），在３７ħ㊁５％ＣＯ２的饱和湿度培养箱中培养，传代㊂１．４㊀ＣＣＫ⁃８法检测纳米金对细胞增殖抑制作用㊀取对数生长期的ＳＰＣ⁃Ａ１细胞制成浓度４００００个／ｍｌ单细胞悬液，实验设空白对照组㊁对照组及实验组（不同浓度ＡｕＮＰｓ），每孔１００μｌ，接种于９６孔板培养２４ｈ贴壁后，换成含有不同浓度（依次为１㊁０．５㊁０．２５㊁０．１２５㊁０．０６２５ｍｍｏｌ／Ｌ）ＡｕＮＰｓ的完全培养基分别培养２４㊁４８㊁７２ｈ，弃去培养基，ＰＢＳ液洗涤２遍，每孔加入不含纳米金的完全培养基１００μｌ和１０μｌＣＣＫ⁃８溶液，培养２ｈ后直接在酶联免疫检测仪４５０ｎｍ波长处吸光值（Ａ）㊂细胞存活率＝（实验组Ａ值－空白对照组Ａ值）／（对照组Ａ值－空白对照组Ａ值）ˑ１００％㊂实验均设３个复孔，进行３次独立实验，计算平均值㊂１．５㊀纳米金对ＳＰＣ⁃Ａ１细胞的放射增敏作用㊀取对数生长期的ＳＰＣ⁃Ａ１单细胞悬液，用培养液作浓度梯度稀释，相同的照射剂量接种３个平行的６０ｍｍ培养皿㊂每个照射剂量的培养皿内接种细胞数目不等，以保证照射后细胞存活数在１００ ２００㊂２４ｈ细胞贴壁后，分为对照组（不给予ＡｕＮＰｓ和照射）㊁６ＭＶＸ线组㊁４ＭｅＶ电子线组㊁ＡｕＮＰｓ组（０．２５ｍｍｏｌ／ＬＡｕＮＰｓ）和放射增敏组（０．２５ｍｍｏｌ／ＬＡｕＮＰｓ的培养液处理２４ｈ后予以６ＭＶＸ线和４ＭｅＶ电子线分别照射１ ８Ｇｙ）㊂照射后各组细胞更换为不含ＡｕＮＰｓ的培养液，继续在培养箱内培养１２天，用９５％乙醇固定，少量吉姆萨染液染色后，经流水缓慢冲洗，空气干燥㊂肉眼计数每个培养皿内细胞数＞５０个的集落数㊂以对照组为参照计算贴壁率，贴壁率＝集落数／接种细胞数㊂以ＡｕＮＰｓ组的存活分数对放射增敏组进行校正，以去除放射增敏组中ＡｕＮＰｓ对细胞集落的影响㊂校正后计算单纯照射组和放射增敏组的存活分数㊂使用单击多靶模型公式进行拟合，得出Ｄｑ㊁Ｄ０等放射生物学参数，使用Ｄ０值计算两组细胞的放射增敏比（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｅｎ⁃ｈｅｎｃｅｍｅｎｔｒａｔｉｏ，ＳＥＲ）㊂１．６㊀细胞照射技术㊀使用医科达ｐｒｅｃｉｓｅ医疗直线加速器产生的４ＭｅＶ电子线和６ＭＶＸ线照射，剂量率２Ｇｙ／ｍｉｎ左右，照射剂量分别是０㊁１㊁２㊁４㊁６㊁８Ｇｙ，单次分割照射㊂６ＭＶＸ线照射时加速器机架转至１８０度，培养皿下垫１．５ｃｍ的组织补偿膜以消除剂量建成效应㊂电子线照射时培养皿放置在源皮距１００ｃｍ处，使用２０ˑ２０的电子限光筒㊂１．７㊀流式细胞术（ＦＣＭ）检测细胞周期㊀将１ˑ１０６个／４ｍｌ细胞接种于６孔培养板，２４ｈ贴壁后换成终浓度０．２５ｍｍｏｌ／ＬＡｕＮＰｓ的培养液处理２４ｈ，收集细胞经７０％预冷乙醇破膜后置于４ħ冰箱中，次日加入ＲＮａｓｅＡ酶并在３７ħ环境中孵育３０ｍｉｎ，最后加入碘化丙锭（ＰＩ）染液，避光保存５ｍｉｎ使ＤＮＡ染色，上机检测㊂实验重复３次㊂１．８㊀ＡｎｎｅｘｉｎＶ⁃ＦＩＴＣ／ＰＩ双标记染色检测细胞凋亡㊀将５ １０ˑ１０５个／４ｍｌ细胞接种于６孔培养板２４ｈ贴壁后，分为空白对照组（Ａ组）㊁ＡｕＮＰｓ处理２４ｈ组（Ｂ组）㊁ＡｕＮＰｓ处理４８ｈ组（Ｃ组）㊁ＡｕＮＰｓ处理７２ｈ组（Ｄ组）㊁６ＭＶＸ线组（Ｅ组）㊁ＡｕＮＰｓ处理２４ｈ＋６ＭＶＸ线组（Ｆ组）㊁４ＭｅＶ电子线组（Ｇ组）和ＡｕＮＰｓ处理２４ｈ＋４ＭｅＶ电子线组（Ｈ组），收集各组细胞经ＰＢＳ液洗涤后，加入ＡｎｎｅｘｉｎＶ⁃ＦＩＴＣ和碘化丙锭（ＰＩ）溶液，混匀后室温避光孵育不超过３０ｍｉｎ；用流式细胞仪进行细胞分析㊂实验重复３次㊂１．９㊀统计学分析㊀采用ＳＰＳＳ１８．０版软件进行处理㊂数据以均数ʃ标准差表示㊂组间比较采用方差分析㊂以Ｐ＜０．０５为差异具有统计学意义㊂２㊀结㊀果２．１㊀ＡｕＮＰｓ对细胞增殖的影响㊀ＣＣＫ⁃８法实验结果显示：在相同药物浓度下不同时间点，在相同时间点不同药物浓度下，ＳＰＣ⁃Ａ１肺癌细胞存活率差异均无统计学意义（Ｐ＞０．０５）㊂故选取纳米金初始浓度０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ作为后续实验浓度㊂见表１㊂表１㊀ＡｕＮＰｓ对ＳＰＣ⁃Ａ１细胞存活率的影响（％）ＡｕＮＰｓ（ｍｍｏｌ／Ｌ）２４ｈ４８ｈ７２ｈ１㊀㊀㊀９５．９２ʃ７．５４８８．６３ʃ５．３４８１．６１ʃ７．９１０．５９８．６５ʃ７．０９９４．４４ʃ１２．７４９１．１０ʃ１４．１６０．２５１０１．３４ʃ９．４２９５．９９ʃ１６．０３９５．０１ʃ９．２２０．１２５１０５．８５ʃ９．８３９９．５１ʃ８．９９９６．８６ʃ７．９６０．０６２５１１０．８６ʃ１３．０６１０２．２７ʃ６．９３９７．５７ʃ６．７１２．２㊀细胞克隆法放射增敏情况㊀使用单击多靶模型公式进行拟合，直径２５ｎｍ㊁０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ的ＡｕＮＰｓ粒子联合６ＭＶＸ线和４ＭｅＶ电子线照射ＳＰＣ⁃Ａ１细胞的ＳＥＲ分别是１．１１１和１．２１４㊂见表２㊁图１㊂表２㊀各组间细胞存活曲线参数值组别Ｄ０ＤｑＮＳＥＲ６ＭＶＸ线组２．５９１２．３７１２．４９７１．１１１ＡｕＮＰｓ＋６ＭＶＸ线组２．３３１１．６６３２．０４１４ＭｅＶ电子线组２．４８８２．６６５２．９１９１．２１４ＡｕＮＰｓ＋４ＭｅＶ电子线组２．０４９０．５１９１．２８８２．３㊀细胞周期㊀经浓度为０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ的ＡｕＮＰｓ干预２４ｈ后，Ｇ０／Ｇ１期比例较空白对照组显著降低图１㊀各组的细胞存活曲线（Ｐ＜０．０５），而Ｓ期㊁Ｇ２／Ｍ期比例较空白对照组有所增加，但无显著差异，出现轻度细胞同步现象㊂见表３㊁图２㊂表３㊀ＳＰＣ⁃Ａ１细胞经０．２５ｍｍｏｌ／ＬＡｕＮＰｓ干预后的细胞周期情况组别Ｇ０／Ｇ１期Ｓ期Ｇ２／Ｍ期空白对照组５９．１６ʃ０．４８２８．６０ʃ１．２３１２．２４ʃ０．７８ＡｕＮＰｓ组５７．５３ʃ０．７２∗２９．３０ʃ０．５４１３．１６ʃ０．３７㊀注：与对照组比较，∗Ｐ＜０．０５２．４㊀细胞凋亡㊀Ｂ㊁Ｃ㊁Ｄ组的细胞凋亡率与Ａ组比较没有明显差异，Ｅ㊁Ｆ㊁Ｇ㊁Ｈ组的细胞凋亡率显著高于Ａ组，差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０５）㊂见表４㊁图３㊂３㊀讨㊀论放射增敏剂的研究已有３０多年的历史，临床使用最多的主要是化疗药物如铂类㊁抗代谢药物㊁紫杉类等，通过增加ＤＮＡ损伤㊁细胞周期阻滞来提高放疗疗效，但同时也增加了正常组织的损伤，尤其是血液学毒性比单一放射治疗大得多，患者往往难以耐受㊂肿瘤纳米技术促进了肿瘤检测㊁诊断和治疗的巨大进步㊂近年肿瘤化疗领域已经有纳米载体（特别是直径为１０ １００ｎｍ）用于肿瘤治疗㊂ＡｕＮＰｓ粒子对千伏级Ｘ射线的放射增敏效应主要通过两者相互作用的物理过程实现，然而千伏级的Ｘ射线对于临床放射治疗目前无任何实用价值㊂一些研究显示ＡｕＮＰｓ对兆伏级光子线和电子线也能观察到剂量增强效应㊂主要争论点在于不同研究中使用的ＡｕＮＰｓ颗粒参数不同，包括ＧＮＰｓ的形状㊁大小㊁浓度和细胞株的类型以及射线的种类和能量㊂表４㊀各组ＳＰＣ⁃Ａ１细胞的凋亡情况组别Ｑ２＋Ｑ４Ｑ３Ａ组２．１３ʃ０．１５９５．６３ʃ０．４５Ｂ组２．０７ʃ０．１５９５．４０ʃ０．６６Ｃ组２．０３ʃ０．１５９５．００ʃ０．４６Ｄ组２．１０ʃ０．２６９６．６０ʃ０．６２∗Ｅ组５．３３ʃ０．２１∗８８．８７ʃ０．３２∗Ｆ组６．２３ʃ０．１５∗８８．２０ʃ０．２６∗Ｇ组５．２７ʃ０．２５∗８７．７３ʃ０．６４∗Ｈ组６．９７ʃ０．２１∗＃８６．６３ʃ０．３２∗㊀注：Ｑ１：坏死细胞比例；Ｑ２：晚期凋亡细胞比例；Ｑ３：正常细胞比例；Ｑ４：早期凋亡细胞比例；与Ａ组比较，∗Ｐ＜０．０５；与Ｇ组比较，＃Ｐ＜０．０５Ａ：空白对照组；Ｂ：ＡｕＮＰｓ组图２㊀两组细胞周期情况Ａ：Ａ组；Ｂ：Ｂ组；Ｃ：Ｃ组；Ｄ：Ｄ组；Ｅ：Ｅ组；Ｆ：Ｆ组；Ｇ：Ｇ组；Ｈ：Ｈ组图３㊀各组细胞凋亡情况比较㊀㊀本研究发现ＡｕＮＰｓ对肺癌ＳＰＣ⁃Ａ１细胞增殖有轻度抑制作用，但细胞存活率在相同药物浓度下不同时间点或在相同时间点下不同药物浓度各组间差异均无统计学意义㊂提示ＡｕＮＰｓ对ＳＰＣ⁃Ａ１细胞无明显毒性㊂但Ｔｋａｃｈｅｎｋｏ等［３］报道ＡｕＮＰｓ能使ＨｅＬａ细胞株（人宫颈上皮细胞）的活力下降２０％，对３Ｔ３／ＮＩＨ（鼠成纤维细胞瘤）细胞仅为５％；Ｐａｔｒａ等［４］报道ＡｕＮＰｓ能诱导Ａ５４９细胞株（人肺癌细胞）凋亡，但是对ＢＨＫ２１（小仓鼠肾脏细胞）和ＨｅｐＧ２（人肝癌细胞）细胞株无影响㊂因此推测ＡｕＮＰｓ对细胞毒性的大小与细胞株类型有关㊂本研究中细胞克隆试验结果显示，０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ的ＡｕＮＰｓ对６ＭＶＸ线和４ＭｅＶ电子线的放射增敏比（ＳＥＲ）分别达到１．２１４和１．１１１，具有放射增敏效应㊂效应大小较为接近，可能与兆伏级能量射线物质作用特点有关㊂兆伏级射线是通过康普顿散射与人体中骨骼㊁肌肉㊁水等物质作用，受物质的原子序数影响较小，故各组织间的吸收剂量差异较小㊂同样ＡｕＮＰｓ和水的吸收比理论上变得可以忽略不计，故两者的物理作用对增敏效应贡献不大㊂亦可能通过其他途径如增加细胞凋亡，细胞同步化，增加乏氧细胞的杀伤力，抑制损失修复，影响某些基因等，这些途径同样受射线种类㊁能量影响较小，与照射剂量密切相关㊂Ｃｈｉｔｈｒａｎｉ等［５］使用ＨｅＬａ细胞经５０ｎｍ的柠檬酸盐包裹的ＡｕＮＰｓ干预处理２４ｈ后，分别使用１０５ｋＶｐ㊁２２０ｋＶｐ和６ＭＶＸ线照射，结果ＳＥＲ分别达到１．６６㊁１．４３㊁１．１７㊂Ｌｉｕ等［６］使用ＣＴ２６鼠肿瘤细胞经直径６．１ｎｍ的纳米金干预处理４８ｈ后，使用８ｋｅＶ㊁１６０ｋＶｐ和６ＭＶＸ线照射后，ＳＥＲ分别达到了１．４４㊁１．１和１．３２㊂Ｒａｈｍａｎ等［７］报道了０．５ｍｍｏｌ／Ｌ１．９ｎｍ直径的ＡｕＮＰｓ对６ＭｅＶ和１２ＭｅＶ能量电子线的ＳＥＲ更是达到了２．９和３．７㊂但Ｊａｉｎ等［８］研究发现ＡｕＮＰｓ对兆伏级能量的Ｘ射线增敏作用具有细胞特异性，当使用６ＭＶ和１５ＭＶＸ线照射时，ＡｕＮＰｓ对ＭＤＡ⁃ＭＢ⁃２３１乳腺癌细胞ＳＥＲ分别达到１．２９和１．１６，但是在Ｌ１３２正常细胞和ＤＵ１４５前列腺癌细胞中未观察到其增敏效应㊂因此ＡｕＮＰｓ颗粒对射线的增敏效应主要与ＡｕＮＰｓ颗粒直径及细胞株类型有关㊂细胞核内ＤＮＡ的双链断裂（ＤＳＢ）是公认射线对细胞致死效应的最主要原因㊂此外射线对线粒体和细胞膜的损伤同样能引起细胞死亡㊂常用放射增敏药物如顺铂主要通过增加ＤＮＡ的双链断裂和抑制ＤＮＡ的断裂修复起作用，还可能通过作用于放射抵抗途径如表皮生长因子受体或对乏氧细胞有特异性损伤㊂而化疗药物如多西紫杉醇的放射增敏作用主要通过增加细胞凋亡和使细胞周期同步在放射敏感期Ｇ２／Ｍ期㊂本研究中发现ＡｕＮＰｓ组中相对放射抗拒的Ｇ０／Ｇ１期比例较空白对照组显著降低（Ｐ＜０．０５），而放射敏感的Ｇ２／Ｍ期比例较空白对照组有所增加，但无显著差异，出现轻度细胞同步现象㊂同样也有研究证明，直径１５ｎｍ的ＡｕＮＰｓ粒子（Ｇｌｕ⁃ＧＮＰｓ）能导致前列腺癌ＤＵ⁃１４５细胞株细胞周期加速从Ｇ０到Ｇ１期和积聚在Ｇ２／Ｍ期，引起显著的电离辐射增敏作用［９］㊂有研究报道凋亡指数的高低也与放射敏感性成正相关［１０］㊂Ｃｈａｎｇ等［１１］进行了ＡｕＮＰｓ粒子联合６ＭｅＶ电子线对Ｂ１６Ｆ１０黑色素瘤荷瘤小鼠的增敏研究，结果发现联合治疗组的肿瘤体积比对照组缩小更明显，小鼠的存活时间明显延长，并且联合治疗组所观察到的凋亡小体数目明显多于单独放疗组㊂本实验中ＡｎｎｅｘｉｎＶ⁃ＦＬＴＣ／ＰＩ双标记染色结果提示单独ＡｕＮＰｓ不增加细胞的凋亡，但能明显增加射线对细胞的凋亡作用㊂ＡｕＮＰｓ粒子在细胞实验㊁小鼠模型中都显示出有明显的放射增敏效应，而且容易使用，没有毒性，具有临床实用性㊂２００９年ＡＳＣＯ会议报道了首个靶向作用ＴＮＦ⁃ＧＮＰｓ的Ⅰ期临床试验，并且联合化疗的研究亦正在进行中［１２］㊂因此，建议开展更多的ＡｕＮＰｓ放射增敏的动物实验研究，尤其结合了靶向药物的ＡｕＮＰｓ是将来开展临床试验的希望所在㊂参考文献［１］㊀ＢｒｕｎＥ，ＳａｎｃｈｅＬ，Ｓｉｃａｒｄ⁃ＲｏｓｅｌｌｉＣ．ＰａｒａｍｅｔｅｒｓｇｏｖｅｒｎｉｎｇｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅＸ⁃ｒａｙｒａｄｉｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎ［Ｊ］．ＣｏｌｌｏｉｄｓＳｕｒｆＢＢｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２００９，７２（１）：１２８－１３４．［２］㊀ＨａｉｎｆｅｌｄＪＦ，ＤｉｌｍａｎｉａｎＦＡ，ＺｈｏｎｇＺ，ｅｔａｌ．Ｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｒａｄｉａｔｉｏｎｔｈｅｒａｐｙｏｆａｍｕｒｉｎｅｓｑｕａｍｏｕｓｃｅｌｌｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．ＰｈｙｓＭｅｄＢｉｏｌ，２０１０，５５（１１）：３０４５－３０５９．［３］㊀ＴｋａｃｈｅｎｋｏＡＧ，ＸｉｅＨ，ＬｉｕＹ，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒｔｒａｊｅｃｔｏｒｉｅｓｏｆｐｅｐ⁃ｔｉｄｅ⁃ｍｏｄｉｆｉｅｄｇｏｌｄｐａｒｔｉｃｌｅｃｏｍｐｌｅｘｅｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｎｕｃｌｅａｒｌｏ⁃ｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌｓａｎｄｐｅｐｔｉｄｅｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｄｏｍａｉｎｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｏｎｊｕｇＣｈｅｍ，２００４，１５（３）：４８２－４９０．［４］㊀ＰａｔｒａＨＫ，ＢａｎｅｒｊｅｅＳ，ＣｈａｕｄｈｕｒｉＵ，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌｓｅｌｅｃｔｉｖｅｒｅ⁃ｓｐｏｎｓｅｔｏｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ［Ｊ］．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００７，３（２）：１１１－１１９．［５］㊀ＣｈｉｔｈｒａｎｉＤＢ，ＪｅｌｖｅｈＳ，ＪａｌａｌｉＦ，ｅｔａｌ．Ｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓａｓｒａ⁃ｄｉａｔｉｏｎｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓｉｎｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．ＲａｄｉａｔＲｅｓ，２０１０，１７３（６）：７１９－７２８．［６］㊀ＬｉｕＣＪ，ＷａｎｇＣＨ，ＣｈｅｎＳＴ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｃｅｌｌｒａｄｉａｔｉｏｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｂｙｐｅｇｙｌａｔｅｄｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ［Ｊ］．ＰｈｙｓＭｅｄＢｉｏｌ，２０１０，５５（４）：９３１－９４５．［７］㊀ＲａｈｍａｎＷＮ，ＢｉｓｈａｒａＮ，ＡｃｋｅｒｌｙＴ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｒａｄｉ⁃ａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｓｂｙｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｏｒｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌｒａｄｉａｔｉｏｎｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００９，５（２）：１３６－１４２．［８］㊀ＪａｉｎＳ，ＣｏｕｌｔｅｒＪＡ，ＨｏｕｎｓｅｌｌＡＲ，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃｒａｄｉｏｓｅｎｓｉ⁃ｔｉｚａｔｉｏｎｂｙｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓａｔｍｅｇａｖｏｌｔａｇｅｒａｄｉａｔｉｏｎｅｎｅｒｇｉｅｓ［Ｊ］．ＩｎｔＪＲａｄｉａｔＯｎｃｏｌＢｉｏｌＰｈｙｓ，２０１１，７９（２）：５３１－５３９．［９］㊀ＲｏａＷ，ＺｈａｎｇＸ，ＧｕｏＬ，ｅｔａｌ．Ｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒａ⁃ｄｉｏｔｈｅｒａｐｙｏｆｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｅｌｌｃｙｃｌｅ［Ｊ］．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２０（３７）：３７５１０１．［１０］㊀ＭｅｙｎＲＥ，ＳｔｅｐｈｅｎｓＬＣ，ＡｎｇＫＫ，ｅｔａｌ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙｉｎｔｈｅｄｅ⁃ｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｉｒｒａｄｉａｔｅｄｍｕｒｉｎｅｔｕｍｏｕｒｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｉｓｔｏｌｏｇｉｅｓ［Ｊ］．ＩｎｔＪＲａｄｉａｔＢｉｏｌ，１９９３，６４（５）：５８３－５９１．［１１］㊀ＣｈａｎｇＭＹ，ＳｈｉａｕＡＬ，ＣｈｅｎＹＨ，ｅｔａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄａｐｏｐｔｏｔｉｃｐｏ⁃ｔｅｎｔｉａｌａｎｄｄｏｓｅ⁃ｅｎｈａｎｃｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆｇｏｌｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｎｃｏｍｂｉ⁃ｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｓｉｎｇｌｅ⁃ｄｏｓｅｃｌｉｎｉｃａｌｅｌｅｃｔｒｏｎｂｅａｍｓｏｎｔｕｍｏｒ⁃ｂｅａｒｉｎｇｍｉｃｅ［Ｊ］．ＣａｎｃｅｒＳｃｉ，２００８，９９（７）：１４７９－１４８４．［１２］㊀ＬｉｂｕｔｔｉＰＧ，ＭｙｅｒＬ．ＲｅｓｕｌｔｓｏｆａｃｏｍｐｌｅｔｅｄｐｈａｓｅＩｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｏｆＣＹＴ⁃６０９１：Ａｐｅｇｙｌａｔｅｄｃｏｌｌｏｉｄａｌｇｏｌｄ⁃ＴＮＦｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ，２００９，２７（１５Ｓｕｐｐｌ）：３５８６．收稿日期：２０１５－０１－２０；㊀修回日期：２０１５－０３－３０纳米金对SP C-A1肺癌细胞体外放射增敏作用的研究作者：徐国平， 姚志峰， 杨航， 刘永彪， XU Guoping， YAO Zhifeng， YANG Hang， LIU Yongbiao作者单位：徐国平,XU Guoping(213003,常州市第一人民医院放疗科)， 姚志峰,杨航,刘永彪,YAO Zhifeng,YANG Hang,LIU Yongbiao(210029,南京 南京医科大学第一附属医院放疗科)刊名：临床肿瘤学杂志英文刊名：Chinese Clinical Oncology年，卷(期)：2015(6)引用本文格式：徐国平.姚志峰.杨航.刘永彪.XU Guoping.YAO Zhifeng.YANG Hang.LIU Yongbiao纳米金对SP C-A1肺癌细胞体外放射增敏作用的研究[期刊论文]-临床肿瘤学杂志 2015(6)。