牦牛血液氯化血红素的分离提纯及工艺优化研究

牦牛血液氯化血红素的分离提纯及工艺优化研究
杨生忠;韩学燕;李宗文;陈虎;任茜;曹效海
【摘要】试验以新鲜牦牛血液为原料,采用血粉法、冰醋酸法及醋酸钠法,探索制备氯化血红素的最优工艺参数,并对不同方法制备的氯化血红素纯度及得量进行对比.结果显示,血粉法的最优工艺是超声处理时间40 min,酸性丙酮添加量为120 mL,抽提时间30 min,乙酸钠添加量为9 mL,氯化血红素纯度达到96％,得量为7.38 g/L.采用冰醋酸法制备氯化血红素,当冰醋酸添加量为红细胞量的3倍时,氯化血红素纯度达到80％,得量为6.10 g/L.采用醋酸钠法制备氯化血红素,当氯仿添加量为红细胞量的2倍时,氯化血红素纯度达到90％,得量为3.44 g/L.通过对比3种制备方法,氯化血红素纯度依次为血粉法＞醋酸钠法＞冰醋酸法;氯化血红素得量依次为血粉法＞冰醋酸法＞醋酸钠法,由此可知,3种方法中,选用血粉法制备氯化血红素的量更高且更加有利于工业化生产.%The study was conducted to separate and purify the hemin from yak blood and the optimal process of preparing the hemin was confirmed using blood meal,glacial acetic acid and sodium acetate methods.The purity and the yield of the extracted hemin in different methods were compared.The results showed that the purity of hemin in yak blood was 96％ and the yield was 7.38 g/L using blood meal method under the optimal process of 40 min for ultrasonic treatment,30 min for extraction,120 mL acid acetone and 9 mL sodium acetate.The purity of hemin was 80％ and the yield was 6.10 g/L when the amount of glacial acetic acid was 3 times as much as blood cells amount using the glacial acetic acid method.The purity of hemin was 90％ and the yield was 3.44 g/L when the amount of chloroform was 2 times as much as blood
cells amount using sodium acetate method.The purity of the hemin from high to low was blood meal method,sodium acetate method and glacial acetic acid method,and that of the hemin yield was blood meal method,glacial acetic acid method and sodium acetate method by comparing the three preparation methods.So the blood meal method was more conducive to industrial production.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2017(044)011
【总页数】7页(P3163-3169)
【关键词】牦牛血液;氯化血红素;牦牛血粉;醋酸钠法;冰醋酸法
【作者】杨生忠;韩学燕;李宗文;陈虎;任茜;曹效海
【作者单位】乌兰县畜牧兽医工作站,乌兰 817100;大通县畜牧兽医站,大通810100;乌兰县畜牧兽医工作站,乌兰 817100;青海大学农牧学院,西宁 810016;青海大学农牧学院,西宁 810016;青海大学农牧学院,西宁 810016
【正文语种】中文
【中图分类】S823.8+5
牦牛是青藏高原特有的优势畜种，主要分布在中国青海、西藏、四川、甘肃等地区[1-2]。

青海牦牛数量较多，牦牛肉和牦牛乳是重要的畜产品资源，但由于牦牛血液腥味重，不宜食用，利用率极低，还可能会造成严重环境污染。

动物血液中富含多种蛋白质(包括血浆蛋白、血红蛋白等)、微量矿物元素、维生素(烟酸)、激素和其他生理活性物质。

牦牛血液中血红蛋白(Hb)的含量较高，是制取血红素类产品
的优质资源[3-5]。

血红素是由卟啉和一分子的亚铁离子结合的铁卟啉类化合物，是血红蛋白分子的辅基，存在于各种动物血液和肌肉组织中，具有非常重要的生理生化功能[6]。

氯化
血红素(hemin)含铁量较高，是一种新型的补铁剂，对缺铁性贫血的治疗及预防具有重要的作用，是重要的抗贫血和抗肿瘤的原材料[7]。

近年来，氯化血红素已经
广泛应用在食品、化工及医药方面[8-10]，在食品行业中，血红素被用作色素添加剂，能够取代亚硝酸盐及人工合成色素，含有丰富的营养价值[11]。

血红素在食品营养、保健方面的应用在发达国家已有很大突破和发展，但目前国内血红素的应用技术还未完全成熟[12-13]。

本研究以牦牛血为原料，研究氯化血红素的制备工艺
技术，旨在为今后氯化血红素相关产品的研究开发奠定基础。

1.1 材料
新鲜牦牛血液采自青海省百德屠宰场。

尿素、盐酸(分析纯)、乙酸钠(分析纯)、氢
氧化钠(分析纯)、无水乙醇(分析纯)、冰乙酸(分析纯)、柠檬酸三钠(分析纯)、氯仿(分析纯)、丙酮(分析纯)、氯化钠(分析纯)、氯化血红素标准品(95%)均购自天津市河东区红岩试剂厂。

TCL20MV高速冷冻离心机购自湖南赫西仪器装备有限公司；FD-3型真空冷冻干燥机购自上海比朗仪器有限公司；UV-2600紫外-可见分光光
度计购自岛津公司；超声波清洗机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法
1.2.1 牦牛血粉的制备取1 L新鲜牦牛血液，经过抗凝、离心处理之后，收集血
红细胞，加水稀释后喷雾干燥，得到牦牛血粉。

1.2.2 牦牛血红细胞的制备取1 L新鲜牦牛血液，经过抗凝、筛网、过滤、离心
处理之后，加生理盐水洗涤2次，离心，弃去上清液，沉淀备用。

1.2.3 氯化血红素制备工艺的优化
1.2.3.1 血粉法称取2 g牦牛血粉于小烧杯中，然后加入6 mol/L脲溶液30 mL，
搅拌均匀，进行超声处理，然后3 000 r/min离心10 min；向上清液中加入3%
酸性丙酮溶液，搅拌抽提30 min，再加入3%乙酸钠溶液搅拌均匀，然后用1
mol/L NaOH调节pH至7.0，3 000 r/min离心10 min，得到的沉淀用蒸馏水
和无水乙醇洗涤2次，再将沉淀烘干，制得氯化血红素成品[14]。

其中分别选取超声处理时间(10、20、30、40、50 min)、酸性丙酮添加量(90、120、150、180、210 mL)、抽提时间(10、20、30、40、50 min)和乙酸钠添加量(7、9、11、13、15 mL) 4个因素进行单因素试验，分别设置3个水平，采用L9(34)正交表进行正交试验[15]，优化牦牛血粉制备氯化血红素的工艺参数。

正交试验因素水平见表1。

1.2.3.2 冰醋酸法将新鲜的牦牛血液加入柠檬酸抗凝剂，用离心机分离血浆与血细胞。

在配有回流冷凝管的三口烧瓶中加入1、2、3、4、5倍的冰醋酸与氯化钠，
加热使氯化钠溶解，细流加入已经抗凝后的红细胞，持续一定的时间后，停止加热，待反应物冷却到室温，然后再用布氏漏斗抽滤，得到粗血红素，经过纯化去杂后可得到纯度较高的氯化血红素[16]。

1.2.3.3 醋酸钠法将新鲜的牦牛血液立即加入柠檬酸进行抗凝处理，并搅拌均匀，3 000 r/min离心15 min，弃去上清液，用生理盐水将红细胞洗涤2次，加入与
红细胞量相等质量的蒸馏水，搅拌抽提30 min使红细胞溶血，再加入1、2、3、4、5倍红细胞量的氯仿，过滤，收集滤液，在上述滤液量中加入4～5倍3%酸性丙酮，用盐酸校正pH为2～3，搅拌抽提10 min，过滤，收集滤液。

在上述滤液中加入1 mol/L氢氧化钠调节pH至4～6，再加滤液量1%醋酸钠搅拌均匀，静
置后絮状氯化血红素形成沉淀析出，将得到的产物分别用蒸馏水、无水乙醇洗涤2次，干燥得到氯化血红素成品[17]。

1.3 氯化血红素纯度的测定
1.3.1 氯化血红素标准浓度曲线的绘制采用分光光度计法测定氯化血红素纯度[18]。

准确称取干燥的氯化血红素标样0.1000 g，用
2.8%稀氨水定容至500 mL，配成
200 mg/L标准溶液备用。

用移液管准确移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 mL标液，用100 mL的容量瓶配制成浓度为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0 mg/L的溶液，用紫外可见光谱仪在最大吸收峰382 nm处测定不同浓度氯化血红素标准样溶液的吸光度，制备氯化血红素标准浓度曲线。

1.3.2 样品含量的测定将制好的氯化血红素样品烘干后，准确称取0.200 g，然后用
2.8%稀氨水配成10 mg/L待测溶液，在最大峰值(382 nm)测定待测样品的吸
光度，样品中氯化血红素纯度(%)=样品吸光度×93.39%/0.83；得率(%)=目的产
物生成量/反应物量×100%。

2.1 血粉法
2.1.1 单因素试验结果
2.1.1.1 超声处理时间对氯化血红素得量的影响超声处理时间对氯化血红素得量的影响见图1。

由图1可知，随着超声波处理时间的延长，氯化血红素得量先增加后下降，当超声处理时间达到30 min时，氯化血红素得量最多，当超声处理时间太长时，释放的大量声波使反应体系温度过高，蛋白质变性，导致氯化血红素难以被释放出来，从而影响得量。

因此，30 min超声处理时间为最适条件。

2.1.1.2 酸性丙酮添加量对氯化血红素得量的影响酸性丙酮添加量对氯化血红素得量的影响见图2。

由图2可知，当酸性丙酮添加量达到150 mL时，氯化血红素得量达到最大，当继续增加酸性丙酮，氯化血红素得量开始下降。

氯化血红素易溶解在酸性丙酮溶液中，酸性丙酮的添加量会影响氯化血红素从蛋白中解离，但当酸性丙酮溶液添加量超过150 mL后，氯化血红素的得量没有明显增加，故酸性丙酮
的最适加入量为150 mL。

2.1.1.3 乙酸钠添加量对氯化血红素得量的影响乙酸钠添加量对氯化血红素得量的影响见图3。

由图3可知，当乙酸钠的添加量不断增加时，氯化血红素得量先增加
后下降，当乙酸钠添加量达到11 mL时，得到的氯化血红素最多，故乙酸钠的最
适加入量为11 mL。

2.1.1.4 抽提时间对氯化血红素得量的影响抽提时间对氯化血红素得量的影响见图4。

由图4可知，随着抽提时间的增加，氯化血红素得量先增加后下降，当抽提时间达到30 min时，得到的氯化血红素最多，而后随着抽提时间的不断增加，氯化血红素得量又有所减少，为缩短生产周期，故选择抽提时间为30 min。

2.1.2 正交试验结果正交试验结果见表2。

由表2可知，4个因素对产量的影响依次为乙酸钠添加量>超声处理时间>抽提时间>酸性丙酮添加量。

制备氯化血红素
的最优的工艺参数组合是A3B1C2D2，即超声处理时间40 min，酸性丙酮加入量为120 mL，抽提时间30 min，乙酸钠加入量为9 mL。

2.2 冰醋酸法
冰醋酸法制备氯化血红素的试验结果见图5。

由图5可知，冰醋酸的添加量在1～3倍时，随着冰醋酸的添加量的增加，氯化血红素的量逐渐增加，当冰醋酸的添加量为3倍时，氯化血红素的量为6.08 g/L，当继续增加冰醋酸的添加量时，氯化
血红素得量基本趋于稳定。

2.3 醋酸钠法试验结果
醋酸钠法试验结果见图6。

由图6可知，氯仿的添加量在1～2倍时，随着氯仿的添加量的增加，氯化血红素的量逐渐增加，当氯仿的添加量为2倍时，氯化血红
素的量为3.44 g/L，当继续增加氯仿的添加量时，氯化血红素的量增加很少，基
本趋于稳定。

2.4 3种不同方法的效果比较结果
本试验制备的制备氯化血红素标准浓度曲线回归方程为：A=1.144X-3.47×10-3，R2=0.9996，线性关系良好。

3种不同方法的制备氯化血红素的比较结果见表3。

由表3可知，血粉法使用了50.286 g牦牛血粉，冰醋酸、酸性丙酮方法分别使用
了52.842、50.264 g牦牛血红细胞。

氯化血红素纯度依次为血粉法>醋酸钠法>
冰醋酸法；氯化血红素得量依次为血粉法>冰醋酸法>醋酸钠法，血粉法制备氯化
血红素的产品纯度和产品得率都均最高。

牦牛血粉易于贮藏和运输，是工业化制取氯化血红素的天然优质原料。

前人大都单一的研究了血粉法、冰醋酸法和醋酸钠法制备氯化血红素的工艺，没有对3种方
法制备的氯化血红素得量和纯度进行比较，而本研究不仅系统的探索了牦牛血粉法、冰醋酸法及醋酸钠法制备氯化血红素的最优工艺参数，而且对不同方法制备的氯化血红素纯度及得量进行对比分析，得出了血粉法为制备牦牛氯化血红素的最佳方法，氯化血红素得量为7.38 g/L，纯度高达96%，远远高于高子涵等[19](2.30 mg/g)、贾志春[14](6.76 μg/mL)等制备牦牛氯化血红素的得量。

采用血粉制备氯化血红素时，血红细胞可以喷雾干燥成血粉，血清可以制作血浆蛋白粉，可充分利用原料，减少浪费，原料方便保存，不易腐败变质[20-21]。

乙酸
钠的添加量会影响的氯化血红素的得率及纯度，随着加入乙酸钠的增加，氯化血红素沉淀析出越来越多，当乙酸钠过量添加时，不能及时溶解的乙酸钠会混合在析出的氯化血红素中，降低氯化血红素的纯度。

氯化血红素很难在酸性溶液中溶解，但能够溶解在中性和碱性溶液中[13,22-23]。

当用1 mol/L NaOH调节pH至7.0的过程中，要注意pH的变化以及沉淀的析出，如果滴定过程中NaOH过量，氯化血红素则会溶于碱性溶液，影响沉淀析出。

用冰乙酸法制备氯化血红素时，冰醋酸的添加量会影响氯化血红素的得量，随着冰醋酸加入量的增加，氯化血红素得量明显的提高，但当冰醋酸添加量达到红细胞体积的3倍以后，氯化血红素得量提高的速度比较缓慢。

此时，冰醋酸的量达到饱
和状态，继续增加冰醋酸不再对氯化血红素的析出有影响。

醋酸钠法制备氯化血红素，氯化血红素得量较低，且在成品中会有大量的血红素和蛋白质杂质存在。

氯仿的添加量会影响氯化血红素得量，随着氯仿加入量的增加，牦牛氯化血红素得量在
不断增加，当氯仿的添加量为红细胞体积的2倍时牦牛氯化血红素的得量最高，
但当继续增大氯仿的添加量时，制得的氯化血红素的量反而有所降低，此时，析出氯化血红素沉淀的速度缓慢。

利用血粉法制备氯化血红素的优化工艺为超声处理时间40 min，酸性丙酮添加量为120 mL，抽提时间30 min，乙酸钠添加量为9 mL，得量为7.38 g/L；采用
冰醋酸法制备氯化血红素时，冰醋酸添加量为红细胞量的3倍时，制得的氯化血
红素纯度达到80%，得量为6.10 g/L；采用醋酸钠法制备氯化血红素，当氯仿添加量为红细胞量的2倍时，氯化血红素纯度达到90%，得量为3.44 g/L。

3种提取氯化血红素的方法中，选用血粉法更有利于工业化生产。

【相关文献】
[1] 何如喜.牦牛血液资源利用技术的可行性研究[J].中国资源综合利用，2006，24(12)：11-13.
[2] 牛春娥，张利平.我国牦牛资源现状及其产品开发利用前景分析[J].安徽农业大学，2009，
37(17)：8003-8005.
[3] 孙鹏飞，崔占鸿，柴沙驼，等.高原牦牛营养研究进展[J].江苏农业科学，2014，42(9)：172-175.
[4] 卢福山，张才俊.高原型牦牛8项血液指标的测定[J].青海畜牧兽医杂志，2006，36(4)：3-4.
[5] 张志飞，梁春年，郭宪，等.无角牦牛与有角牦牛血液生理、生化指标的比较研究[J].中国畜牧
兽医，2016， 43(12)：3257-3262.
[6] 吴海玥，靳义超，胡勇.牦牛血液中高纯度血红素的提取实验研究[J].青海畜牧兽医杂志，2011，41(5)：25-27.
[7] Lebrun F，Bazus A. Solubility of heme in heme iron enriched bovine hemoglobin hydrolysate[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46(1)：5017-5025.
[8] 刘娅，韩新年.天然补铁剂——血红素铁的研究进展[J].中国食品添加剂，2005，11(4)：5-8.
[9] Wang C，Zhang Y，Han L，et al. Hemin ameliorates influenza pneumonia by attenuating lung injury and regulating the immune response[J].International Journal of Antimicrobial Agents， 2016，49(1)：45-52.
[10] 王君，康平利，张向东，等.超声波法提取氯化血红素的研究[J].药物生物技术，2004，23(4)：260-263.
[11] Feng Z，Kong J，Jin M，et al. A novel porous Al2O3 layer/AgNPs-Hemin composite for degration of azo dyes under visible and UV irradition[J].Chemical Engineering Journal，2016，294(3)：236-245.
[12] Ben-Mordechai T，Kain D， Holbova R， et al. Targeting and modulating infarct macrophages with hemin formulated in designed lipid-based particles improves cardiac remodeling and function[J].Journal of Controlled Release，2017，1(1)：325-332.
[13] 贾志春，张珍，张盛贵.木瓜蛋白酶酶解牦牛血红蛋白制备氯化血红素关键工艺研究[J].食品工业科技，2016， 37(3)：206-215.
[14] 贾志春.酶解牦牛血红蛋白制备氯化血红素工艺及其结构研究[D].兰州：甘肃农业大学，2016.
[15] Alvarez M M，Liu J C，Trujillo-de Santiago G，et al. Delivery strategies to control inflammatory response：Modulating M1-M2 polarization in tissue engineering applications[J].J Control Release， 2016，240(2)：349-363.
[16] Jiang B，Yao Y，Xie R.Enhanced generation of reactive oxygen species for efficient pollutantelimination catalyzed by hemin based on persistent free radicals[J].Applied Catalysis B：Environmental，2016，32(11)：291-297.
[17] Jayanta K P，Manisha J P. Dose-dependent differential effect of hemin on protein synthesis and cell proliferation in Leishmania donovani promastigotes cultured in vitro[J].J Biosci，2001，26(2)：225-231.
[18] 高建帮.基于氯化血红素对G-四链体/盐酸小檗碱复合物的竞争作用构建DNA逻辑门[J]. 西南
大学学报(自然科学版)，2016，38(11)：119-123.
[19] 高子涵，张卫兵，梁琪，牦牛血粉制备氯化血红素工艺优化研究[J]. 食品工艺科技，2013，
34(19)：248-251.
[20] 李敏康，钱冬明，李红心.提取氯化血红素新工艺的研究[J].食品科技，2005，32(12)：51-53.
[21] Harel-Adar T，Ben-Mordechai T，Amsalem Y，et al. Modulation of cardiac macrophages by phosphatidylserine-presenting liposomes improves infarct repair[J].Proc Natl Acad Sci USA，2011,108：1827-1832.
[22] Ndisang J F，Mishra M.The heme oxygenase system selectively suppresses the proinflammatory macrophage m1 phenotype and potentiates insulin signaling in spontaneously hypertensive rats[J].Am J Hypertens，2013，26(3)：1123-1131.
[23] Nahrendorf M，Swirski F K，Aikawa E，et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions[J].J Exp Med，2007，204(38)：3037-3047.。