高通量基因测序技术在肿瘤研究中的应用研究

现代实用医学2019年7月第31卷第7期• 981 •-讲座与综述• 环状RNA全基因测序在头颈肿瘤中的应用研究袁洁，沈志森,郝文娟，胡燕，徐捷doi:10.39694.issn.l671-0800.2019.07.067【中图分类号】R739.91【文献标志码】C 【文章编号】1671-0800(2019)07-0981-03目前，全世界头颈肿瘤发病率约11%, 2018年约有94万的新发病例UJo头颈部 肿瘤早期症状不明显，往往患者确诊时己 经是肿瘤晚期或者有远处转移。因此，寻 找一个在头珂中瘤早期阶賊感度和特异 性高的生物标志物或潜在治㈱点是非常 有意义的。环状RNA是近年来肿瘤领域研 究的热点，它是一种非编码RNA分子，不同 于传统的线状RNA歼,而;闭和 结构(缺少5帽和3尾尸。环状RNA由于 缺乏RNA夕卜切酶的作用点,比线状RNA分 子更为稳定,这使得环状RNA在临床诊断 肿瘤礙中作櫥型诊断觎物歸优势。 通过全基因测序，可以发现肿瘤组织和匹配 的癌旁组织中差异表达的环状RNA,再借 助A系列生慵息 进一^识靶基因在肿瘤发生发展中的作用。本文主要 综述全基因测序的发展及环状RNA全基因 测序在头颈肿瘤中的应用。1全基因测序自然科学研究过程中，测序发挥着重 要的作用。以双脱氧核昔酸末端终止法 (Sanger法)为代表的第一代测序技术在20 世纪90年代实现自动化，并在人类基因组 计划(1990—2003)期间用于对人类基因组 的测序叫而后来发展的第二代高通量测基金项目:宁波市医疗卫生品牌学科 建设项目(PPXK2018-02)；浙江省自然科学 基金(LYI9HI600I4)；浙江省医药卫生科技 计划(2019ZD018、2018RC063 )；宁波市自然 科学基金(2017A610236,2018A6I0361)；浙 江省医药卫生平台计划项目(骨干人才B类) (2015RCB025)；宁波市领军和拔尖人才培养 工程择优资助科研项目(NBLJ201801032)作者单位：315211宁波，宁波大学医 学院(袁洁、胡燕、徐捷)；宁波大学附属李惠 利医院(沈志森、郝文娟)通信作者：沈志森，Email： szs7216@ 序技术(Roche公司的454技术、Illumina公 司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技 术等)己经广泛应用于动植物的基因组、转 录组等方面的测序研究吧第三代测序技 术主要包括 Oxford Nanopore Technologies 公司的纳米孔单分子测序技术和PacBio 公司的SMRT技术,与先前的测序技术相 比，单分子测序是最大的特点，而且测序过 程不用进行PCR扩增性目前单分子测序 还处于初级阶段，SMRT技术较高的测序 解率(插入和缺失厳),而纳米孔单分 子测序技林鮭行重复测序，成桶高, 这都是日后需要改进的地方叫通过全基因测序可以获得未知基因 组序列物种的基因序列。通过生物信息技 术，研究人员进一步分析个体基因组间的 删差异,同时性(SNP) 及基因组的肿瘤®是 与基因有关的彌,翩乍用的刪册机 制和遗传基础仍然很不清楚。基因测序通 惋分析，可以检测出突变或者缺 失的基因,这对肿瘤:嫌机制研究和临床E 的精准治疗有推动作用。人类基因组绝大 部分是非编码区域，国际人类基因组测序联 盟0HGSC)首先分析得出，人建因组的蛋 白编码基因占整个湛因组為!12%,只有2万 〜25万个叫非编码区域的基因可能在肿 瘤的:中删了蜩乍用。转录组是细胞内转录本的集合，包 括mRNA和非编码RNAll0J.目前转录 组的研究技术主要有生物芯片技术、基 因表达系列分析(SAGE)技术、大规模平 行信号测序系统(MPSS)技术及高通量 测序的RNA-Seq技术。生物芯片技术 过程复杂，只适用于物种己知序列的检 测,特异性较差，灵敏度不高，很难检测 到那些表达量低及差异不明显的序列、 重复序列和异常转录产物mm = SAGE技 术能检测在病理条件下基因表达谱的改 变，而不必考虑所检测的基因是己知的 还是未知的，可以检测到低表达量致病 基因和疾病相关的新基因1叫缺点是费 用高，时间长。MPSS技术是对SAGE 技术的改进，能在更短时间内检测组织 或细胞内的全部基因表达情况，甚至对 基因表达水平做定量的分析冋。但是价 格昂贵，国内外相关报道较少。而RNA-Seq技术相比较上述测序技 术的优点是不用提前设计探针，可以对任 意物种进行转录组分析;灵敏度高,可检 测到低表达的转录信息“叫可以检测单 核昔酸差异水平,区分相似基因的转录本 和剪接亚型冋;成本低，数据重复性好a」。2环状RNA概述环状RNA最早是20世纪70年代研究 者在殊毒中发现。师毒是没有蛋白质外 单链 RNA 册。1979 年,Hsu等皿使电子显微镜第一次在真核细 胞的中赅到了啾RNA.虽然上 由于87^ 知 识水平有限，没有深入瞅环状RNA,反而以 丰度RNA册。随着RNAnsq的族，发现 环状RNA在真核生物中普遍存在。Jedc等J 在中制备了去体RNA 的文库,利用核糖核酸酶RCRNase R)进行重 复富集并利用高通1测鉴定了 25000多种 和 RNA。因为大部分真核基因的排列方式是 分段的，而通常需要剪接产生新生转录 本,_般在前体mRNA(pre-mRNA)剪接 中,外显子连接需要剪接位配对，通常涉 及5,剪接位点和下游3剪接位点,剪切掉 非编码内含子，使外显子互相结合。环状 RNA通过名为“反向剪接”的剪接方式, preTnRNA被剪接后,其剪接供体会连接 到上游剪接受体上，即将5剪接位点剪接

高通量测序技术及其应用

一、本文概述

随着生物信息学的发展，高通量测序技术（High-throughput

sequencing，HTS）已成为现代生物学研究的重要工具。该技术以其高效、快速、准确的特点，在基因组学、转录组学、表观组学等多个领域发挥了重要作用。本文旨在全面介绍高通量测序技术的基本原理、发展历程、主要类型及其在各个领域的应用实例，以期为相关领域的研究人员和技术人员提供参考。

文章将首先概述高通量测序技术的基本原理和发展历程，包括其从第一代到第三代的演进过程以及各自的技术特点。接着，文章将详细介绍高通量测序的主要类型，如全基因组测序、外显子测序、转录组测序等，并讨论它们在基因组结构分析、基因表达调控、疾病机制研究等方面的应用。文章还将探讨高通量测序技术在临床诊断、药物研发、农业生物技术等领域的潜在应用前景。

通过本文的阐述，读者将能够深入了解高通量测序技术的核心原理和应用价值，为其在生物学研究中的应用提供有益的启示和指导。

二、高通量测序技术的基本原理 高通量测序技术，也称为下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS）或大规模并行测序，是一种革命性的分子生物技术，它能在短时间内对大量的DNA或RNA分子进行序列测定。其基本原理主要依赖于DNA或RNA分子的复制和测序。

高通量测序的基本原理首先涉及样本制备，包括DNA或RNA的提取、纯化和文库构建。在文库构建过程中，DNA或RNA被切割成适合测序的短片段，并通过连接适配器进行标记，以便后续的测序反应。

接下来是测序反应，这是高通量测序技术的核心部分。它采用了一种名为“桥式PCR”或“簇生成”的技术，通过在固体表面生成大量的DNA簇，每个簇都包含许多相同的DNA模板分子。这些簇被测序仪器自动识别和定位，然后进行测序反应。

测序反应通常采用的是循环可逆终止法，即每个测序循环只添加一个碱基，并在添加后终止反应，然后通过荧光信号检测添加的碱基类型。这个过程会重复进行，直到所有的碱基都被测序完成。

分子诊断技术在肿瘤医学中的应用

肿瘤医学是现代医学领域的重要一支，而分子诊断技术则是肿瘤医学研究和临床诊疗中的一项全新技术，它给我们的临床诊疗带来了极大的便捷和成效。本文将从肿瘤分子诊断技术的定义、特点、应用和前景等方面进行探讨。

一、分子诊断技术的定义与特点

分子诊断技术是指通过研究组织、器官、个体细胞、DNA、RNA和蛋白质等生物学分子水平上的变化，对人体的代谢、生长、发育、疾病进程等方面进行快速准确的检测、诊断和治疗。肿瘤分子诊断技术就是将分子诊断技术在肿瘤医学中的应用。

肿瘤分子诊断技术主要有三个特点：

1. 高灵敏度。肿瘤分子诊断技术能够检测到非常小的分子变化，一旦出现病变，就能够及时观察，提高诊断的灵敏度。

2. 高特异性。肿瘤分子诊断技术能够非常精确地检测到肿瘤特有的分子标志物，提高了诊断的准确性。

3. 高重复性。肿瘤分子诊断技术能够多次重复进行检测，提高了检测结果的可靠性。

二、分子诊断技术在肿瘤医学中的应用

目前，分子诊断技术在肿瘤医学领域中广泛应用，其主要应用有以下几个方面：

1. 早期肿瘤筛查

随着肿瘤分子标志物的发现和研究，人们发现很多肿瘤早期便已有蛋白质、DNA等分子的异常表达，因此，通过检测血液、尿液等标本中的肿瘤特异性分子标志物，可以在早期发现患者的肿瘤，提高肿瘤诊断的敏感性和特异性。

2. 肿瘤分子分型

肿瘤分子分型是指通过对肿瘤内部的分子特征和基因表达进行分析，将肿瘤分为不同的亚型，从而有针对性地推荐治疗方案。例如，HER2基因的扩增与癌症进展呈正相关性，因此通过HER2基因检测可以指导HER2阳性的乳腺癌患者选择靶向治疗，提高治疗效果。

3. 监测肿瘤治疗效果

在肿瘤治疗中，肿瘤标志物可以用来监测治疗效果和患者复发的风险。例如，前列腺癌的患者在治疗后，PSA（前列腺特异性抗原）的水平下降可以反映治疗进展和预测复发的风险等。

4. 个性化治疗

通过肿瘤分子分型可以发现不同肿瘤亚型之间存在显著的生物学差异，因此可以针对不同肿瘤分子特征设计个性化的治疗方案，提高治疗效果。例如，针对基因突变的遗传性乳腺癌患者可以选择BRCA基因突变负荷的化疗或手术治疗，在保证生活质量的前提下达到良好的治疗效果。

高通量测序技术的应用

随着人类对于生物学和医学的研究日益深入，基因测序技术变得越来越重要。而高通量测序技术，作为一种全新的技术手段，开创性地促进了基因组学领域的发展。本文将介绍高通量测序技术的概念、原理以及应用。

一、高通量测序技术的概念

高通量测序技术，也叫大规模并行测序技术（Massively

Parallel Sequencing, MPS），是一种基因测序的新型技术，以其快速、高效、准确的优点而受到广泛关注。与传统的Sanger测序技术相比，高通量测序技术拥有更高的通量和更低的成本，同时还能够对更长的DNA序列进行测序，从而大大提高了测序效率。

二、高通量测序技术的原理

高通量测序技术的原理与Sanger测序技术相似，都是通过DNA的合成和测序来完成DNA的测序工作。不同之处在于高通量测序技术采用的是大规模并行测序方法，同时将同一DNA分子的不同片段同时进行测序，从而大大提高了测序的效率。

高通量测序技术通常分为两种：第一种是基于光学原理的技术，例如Illumina/Solexa测序技术，通过在芯片上密集地分布着大量的DNA小片段的方式，利用荧光信号记录碱基序列。该技术不仅可以进行全基因组的测序，还可以针对目标区域进行定向测序。第二种是基于无发射电离子二次谐波（SHG）光谱的技术，例如Ion Torrent/PGM测序技术，该技术通过测量测序反应时所产生的质子信号来确定DNA序列。

三、1.基因组学研究

高通量测序技术的最初目的是用于整个基因组的测序。通过高通量测序技术，我们能够更加深入地研究不同物种的基因组结构、基因组大小和基因组序列等方面的内容，进而为基因控制机制的研究和高级生物学的基本理解打下基础。

2.基因分型和序列变异分析

高通量测序技术可以快速准确地对某个个体的基因组进行测序，并比较其与人类参考基因组序列的差异，从而获得基因序列的变异信息，进而确定个体的基因型。基因分型和序列变异分析可以应用于研究人类疾病、肿瘤和药物反应等方面。