第四章免疫分析技术

免疫学反应原理单扩散琼脂糖凝胶平板→打孔→点加样本→孵育(过夜) →观察沉淀线可以定性，也可以定量应用：检测抗原抗体。

如免疫球蛋白测定双扩散琼脂糖凝胶平板→打孔(两两对应)→点加样本及对应抗原或抗体→孵育(过夜) →观察沉淀线一般用于定性，也可观察抗原抗体有无交叉反应。

如抗原抗体的鉴定免疫沉淀在试管中加入抗原及抗体，混匀后孵育，观察沉淀的出现环状沉淀：毛细管内进行。

如链球菌的血清学分型对流电泳操作类似于双扩散。

但在两侧施加电场，以加快免疫反应的速度。

适用于抗原抗体检测。

如乙肝表面抗原的检测火箭电泳类似于单扩散，但外加了电场，孔内所加抗原向一特定方向迁移，且迁移沉淀线的长度与抗原的浓度成正比，故可以定量。

如甲胎蛋白的检测。

血球凝集试验将抗体或抗原结合在动物红血球（羊、牛、兔等）上（致敏），当致敏的红血球与相应抗原或抗体相遇时，发生肉眼可见的凝集。

也可制备反向血凝或血凝抑制试验。

血球在致敏前需要进行处理（鞣化），使之不易破坏，也更容易致敏。

如乙肝表面抗原的检测：成本低廉，检测灵敏度也高。

乳胶凝集原理同血球凝集试验，但致敏的是乳胶颗粒，且试剂更易保存。

如细菌抗原的快速检测试剂。

补体结合试验在抗原抗体反应的体系中加入新鲜制备的补体（豚鼠）以及指示系统（红细胞），当有相应的抗原抗体存在并发生反应时，激活补体，红细胞溶解。

若加入与人体的被测抗体相竞争的抗体时，被测抗体消耗掉大量抗原，而无能与指示系统中的抗体反应的抗原剩余，补体不被激活，红血球不被溶解：补体结合抑制试验。

如抗链O检测金标记试验以胶体金致敏抗原，当遇相应抗体时，与之结合并吸附在支持介质上，浓集后形成可见的红色。

一般用于快速试验，卡片式的反应体系方便易用。

但敏感性和特异性不足。

也有用胶体硒的。

如表面抗原、抗HIV等免疫斑点试验原理与金标记法类似，但标记的是酶，在抗原抗体结合后，标记在上面的酶可催化随后加入的显色系统，以出现黑色斑点为阳性。

免疫印迹先将微生物抗原电泳分离，再通过免疫转印技术将琼脂上的抗原转染到硝酸纤维膜上并固定（可裁成小条供多个检测用）。

免疫分析原理
免疫分析原理是利用免疫反应的特异性和灵敏性来检测和定量分析目标物质的方法。

免疫分析中通常采用抗原-抗体反应作为分析原理。

免疫分析的基本原理是通过特异性抗体与目标物质结合形成抗原-抗体复合物，并通过标记物对抗原-抗体复合物进行检测。

标记物可以使目标物质在检测过程中可见或可测，并通过标记物的信号来进行定量。

免疫分析的种类包括免疫荧光分析、酶联免疫吸附分析（ELISA）、免疫层析分析等。

其中，ELISA是应用最广泛的免疫分析方法之一。

ELISA的基本原理是将待测物质固定在固相载体上，与特异性抗体结合，然后添加酶标记的二抗与抗原-抗体复合物结合，通过酶底物的反应产生可见的信号，如颜色变化。

免疫分析方法具有灵敏度高、特异性好、操作简便、快速等优点，广泛应用于生物医学、食品安全、环境监测等领域。

在临床诊断中，免疫分析方法可用于检测病原微生物、肿瘤标志物等，对疾病的早期诊断和治疗起到重要作用。

总之，免疫分析原理是通过抗原-抗体反应的特异性和灵敏性来检测和定量分析目标物质的方法，广泛应用于临床诊断和科学研究中。

免疫分析技术基本原理WORD免疫分析技术基本原理利用抗原、抗体之间的特异性结合来测定、分析特定物质的方法抗原：可诱导动物免疫系统产生免疫应答的物质。

按其引起免疫应答的能力分半抗原、抗原、超抗原。

抗体：由动物免疫系统产生，可特异性结合某种物质的免疫球蛋白。

分IgG、IgM、IgE、IgA、IgD五个亚型。

不同亚型针对同一抗原表位的结合位点的结构一样。

不同亚型出现的先后顺序不同，在血清中的含量不同，在机体中出现的地点不同。

抗原抗体反应的特性1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ,Ag·Ab的解离程度与K值有关。

高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。

解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性2特异性抗原抗体的结合产生在抗原的决意簇与抗体的结合位点之间。

化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。

测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。

3最适比例4敏理性化学比色法的敏感度为mg/ml水平。

酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml。

免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿。

标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。

例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。

固相免疫测定的原理基础:抗原或抗体的固相化与抗原或抗体的酶标记。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。

双抗体夹心法原理此法适用于检验各种卵白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。

只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。

WORD双抗原夹心法原理用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。

此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。

免疫分析免疫分析技术是一种以抗体和抗原的特异性结合来定性和定量分析目标物质的分析技术。

在免疫反应系统中，各种免疫分析的技术原理都是一样的，即抗原抗体反应。

但在检测系统中，根据标记物的不同，可以将免疫分析分为：荧光免疫分析（FIA）、放射免疫分析(RIA)、化学发光免疫分析(CLIA)和酶免疫分析(EIA)。

一、现代免疫分析在农药监测中的应用1）放射免疫分析(RIA)放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)优点是特异性强、灵敏度高、精确、简便易行。

它包括以标记抗原(Antigen, Ag)为特点的放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)和以标记抗体(Antibody, Ab)为特点的免疫放射分析(Immunoradiometric assay ,IRMA)。

前者以液相竞争结合法居多，既测大分子抗原又测小分子抗原；后者以固相法测大分子抗原为主。

最早建立的农药免疫法中，RIA占了很大比重，建立了狄氏剂、艾氏剂、2,4-D和2,4，5-T、对硫磷和百草枯等农药的放射免疫法。

但由于进行RIA需使用昂贵的计数器，存在放射性防护和废物处理等问题，其应用受到较大限制。

1982年后发表的农药免疫分析文章，主要是酶免疫分析法。

2）酶免疫法(EIA)酶免疫法(Enzyme Immunoassay, EIA)是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。

酶免疫法的检测原理与放射免疫法类似，通过测定结合于固相的酶的活力来测定被测定物的量。

用作标记物的酶有辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)。

酶标试剂制备容易、稳定、价廉。

酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫技术，而可借助于简单的仪器作定量测定，是目前农药监测中应用最广泛的免疫分析技术。

EIA法包括酶联免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、酶免疫试验法(Enzyme-monitored Immunotest , EMIT)、竞争结合酶免疫分析法(Competitive Binding Enzyme Immunosorbent Assay, EIA)和免疫酶分析法(Immunoenzymometric Assay, IEMA)。