慢病毒携带shRNA对乳腺癌HPA基因表达的抑制作用

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小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定

小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定一、本文概述本文旨在探讨小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定。

我们将详细介绍Zhangfei基因在小鼠体内的功能和作用，以及其在生物学研究中的重要性。

接着，我们将阐述过表达和shRNA干扰技术在基因功能研究中的应用，并解释为何选择慢病毒载体作为本研究的工具。

在构建过表达慢病毒载体方面，我们将采用基因克隆技术将小鼠Zhangfei基因插入慢病毒载体，以实现目的基因的高效表达。

同时，我们将对构建的过表达载体进行严格的鉴定，包括PCR、测序和Western Blot等方法，以确保载体的正确性和有效性。

在构建shRNA干扰慢病毒载体方面，我们将设计并合成针对小鼠Zhangfei基因的特异性shRNA序列，并将其插入慢病毒载体以干扰Zhangfei基因的表达。

我们将对构建的shRNA干扰载体进行同样的鉴定步骤，包括PCR、测序和Western Blot等方法，以确保载体的正确性和有效性。

我们将对构建的过表达和shRNA干扰慢病毒载体进行功能验证，以评估其在小鼠体内对Zhangfei基因表达的调控效果。

本研究的成果将为进一步揭示Zhangfei基因的功能和机制提供有力的工具，并为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。

二、材料与方法2 载体：慢病毒载体pLV-IRES-Puro和pLV-shRNA2购自Clontech 公司。

3 酶和试剂：限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、PCR 引物、PCR试剂等购自TaKaRa公司；胎牛血清（FBS）和DMEM培养基购自Gibco公司；脂质体转染试剂购自Invitrogen公司；RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；小鼠Zhangfei基因的cDNA序列通过PCR从小鼠cDNA文库中扩增得到。

4 仪器：PCR仪、凝胶电泳仪、超净工作台、离心机、细胞培养箱、荧光显微镜、倒置显微镜等。

RNA干扰和小 RNA在癌症中的作用机制研究

RNA干扰和小 RNA在癌症中的作用机制研究RNA干扰和小RNA在癌症中的作用机制研究近年来，癌症已成为全球医学界关注的一大问题，许多研究机构和学者都在研究癌症的治疗方法和机制。

其中，RNA干扰和小RNA在癌症中的作用机制引起了广泛的关注。

1. RNA干扰RNA干扰指的是在一些物种中发现的一种与后转录过程相关的现象，通常是通过使用双链RNA来触发这种干扰作用。

一些研究表明，RNA干扰可能有助于抵抗肿瘤的发生。

RNA干扰的基本原理是通过切割mRNA，并将其降解为短的非编码RNA序列。

这些非编码RNA序列通常被称为siRNA （small interfering RNA）或shRNA（short hairpin RNA）。

这些RNA序列结合到RISC（RNA诱导沉默复合体）中，并引导RISC 到靶标的mRNA，从而切割靶标的mRNA，并阻止其进一步翻译成蛋白质。

最近的一些研究表明，RNA干扰还可能参与调节一些在癌症细胞中异常表达的基因。

例如，一些TRAIL基因在癌症中表达异常，这可能导致细胞抗凋亡能力的提高，从而导致癌症的生长和扩散。

然而，在一些研究中发现，使用RNA干扰将TRAIL的表达抑制，可以抑制癌细胞的生长和扩散。

2. 小RNA小RNA是指长度在20-30个核苷酸之间的RNA序列。

小RNA通常分为miRNA（microRNA）和siRNA（small interfering RNA）两类。

miRNA在基因表达调控中发挥了重要作用。

研究表明，miRNA可以通过下调调控基因的mRNA表达量来抑制基因的表达，从而影响细胞的生长、凋亡和分化等功能。

miRNA在癌症的发生和发展中也发挥了重要作用。

一些miRNA的表达异常可能导致细胞凋亡的下调，从而导致癌细胞的生长和扩散。

例如，一些miRNA在癌症中表达下调，这可能抑制一些细胞凋亡途径的活性，从而导致癌症的生长和扩散。

siRNA可以通过RNA干扰作用来抑制基因的表达。

shRNA对乳腺癌细胞VEGF-C表达的抑制作用

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2009
年第 3 6 卷第 3 期
中国肿瘤临床
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对乳腺癌细胞 VE GF
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目的：观察 R N A 干扰技术对乳腺癌 M D A
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慢病毒介导RNA干扰HPIP蛋白抑制肿瘤细胞增殖

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［图分类号］Ｑ８；Ｒ３．中７６７５７
［献标识码］Ａ文
［章编号］１０ — ０２２１）３ｏ２ — ４文０９００（０１一３１００
ＬｅｉｉａＭｅａｅｎｔｖｒｌ— ｄｉｔｄＫｎｏｋ — ｏｃＤｗｎｏＨｕｍａＨＰＩＩｈｉｔＣｅｌｆｎＰｎｂｉｓｌＧｒｗｔｎｄＰｒｌｆｒｔｏｏｈａｏｉｅａｉｎ
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３．北京军区总医院，京１００北０７０
［要］目的：立高效稳定的造血相关的ＰＸ相互作用蛋白质（ＰＰ小干扰ＲＡ（ｉＮ细胞导入方法，测摘建ＢＨＩ）ＮｓＡ）Ｒ检ＨＩ的表达对肿瘤细胞生长增殖的影响。方法：建人ＨＩＰＰ构ＰＰ慢病毒ｓＮ干扰载体，重组质粒转染人胚肾２３ｉＡＲ将９Ｔ细胞，通过实时定量Ｒ — Ｃ及ＷｅｔｒＴＰＲｓｎ印迹分析检测ＬｎｉＨ１ＰＰｓＮ的干扰效果；将ＬｎｉＨ１ＨＰＰｅｅｔＨＩｉＡ — ＲｅｔＩ — ｓＮ与４个包装质粒共同转染２３ｉＡＲ９Ｔ细胞，装成慢病毒后，染宫颈癌Ｈｅａ和肝癌ＨｅＧ包感Ｌｐ２细胞，嘌呤霉素筛经

慢病毒携带shRNA对内皮细胞组织因子表达的抑制作用

ｐｅｓｏｎｎｏｈｅｉｌｃｌｒｓｉｎｉｅｄｔｌａｅｌｓ．ＭｅｈｏＴｗｏｈｒｈｉｉＲＮＡｓｔｒｅｉｇｔｈｍａＴＦｗｅｅｃｏｅｔｄｓｓｏｔａｒｎｐａｇｔｎｏｕｎｒｌｎｄｉｔＥＮＴＲＴＭ／Ｕ６ｐａｍｉｔｏｔｉａｅｔｙｌｎｎｏｐｌｓｄｏｂａｎｎｎｒｃｏｅ，ａｄｈｐｓｔｖｃｏｅｗｅｅｅｆｅｂｓ－ｎｔｅｏｉｅｌｎｓｉｒｖｒｉｄｙｅｉｑｅｃｎｕｎｉｇ．ＡｅｏｒｃｍｂｉａｉｎｒａｔｏｗａｒｏｅｂｔｅｔｐＴＲ／Ｕ６ｎｒｃｎｔｃｉｎｎｎｔｏｅｃｉｎｓｐｅｆｒｄｅｗｅｎｈｅＥＮｍｅｔｙｏｓｒｔｏａｄｕ
表达。结论：成功构建了携带人基因的ＲＡ慢病毒栽体，病毒携带的短发夹干扰ＲＡ能干扰内Ｎｉ慢Ｎ
皮细胞中的表达，为血栓栓塞性疾病的防治提供一种有效的方法。可
［键词］组织因子；ＲＡ；慢病毒栽体关Ｎｉ【中图分类号］Ｒ４；６５７［献标识码］Ａ［３Ｒ０９２文文章编号］ｌ７．３７（０８０．６２０６２７４２０）８０８．６
慢病毒携带ｓＲＡ对内皮细胞组织因子表达的抑制作用ｈＮ
熊石龙，王前，郑磊，包杰，黄宪章，刘竞争，曾方银，裘宇容

shRNA对乳腺癌细胞VEGF-C表达的抑制作用的开题报告

shRNA对乳腺癌细胞VEGF-C表达的抑制作用的开题报告
题目: shRNA对乳腺癌细胞VEGF-C表达的抑制作用
背景：
乳腺癌是目前全球最常见的女性恶性肿瘤之一。

VEGF-C是一种重要的血管生成因子, 在乳腺癌的生长和转移中发挥着重要作用。

研究表明, VEGF-C水平的升高与乳腺癌细胞的侵袭和转移有关。

因此, 抑制VEGF-C的表达可能有利于抑制乳腺癌的发展和转移。

研究内容:
本研究将采用shRNA技术, 合成几个不同的VEGF-C shRNA序列, 并转染到乳腺癌细胞中, 从而实现对VEGF-C表达的抑制。

之后, 通过Western blot和实时荧光定量PCR等方法检测VEGF-C蛋白和mRNA的表达情况, 以评估shRNA对VEGF-C表达的抑制效果。

同时, 利用Transwell和Matrigel划痕实验等方法探究shRNA对乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响, 进一步证明shRNA能否抑制乳腺癌的发展和转移。

意义：
本研究将为研究VEGF-C在乳腺癌中的作用提供新思路, 并为乳腺癌的治疗提供新的治疗策略。

通过shRNA技术的应用, 可以实现对基因的针对性调节, 进一步深化对乳腺癌发生和发展机制的理解, 为治疗乳腺癌提供新的思路和方法。

RNA干扰技术抑制乳腺癌SKBr3细胞HER2的表达

RNA干扰技术抑制乳腺癌SKBr3细胞HER2的表达【摘要】构建含表皮生长因子受体2基因(HER2)的短发夹状双链RNA(shRNA)重组质粒,体外观察对人乳腺癌细胞SKBr3的HER2 mRNA及蛋白表达的影响。

方法利用分子克隆技术,将含HER2的双链DNA,与经双酶切后的载体pSilencer连接,构建重组质粒,在脂质体的介导下转染高表达HER2的乳腺癌细胞系SKBr3。

分析HER2 mRNA的表达,Western blot检测蛋白的表达,MTT法测定细胞增殖情况。

结果酶切鉴定证实重组质粒构建成功,转染后能明显抑制HER2 mRNA及蛋白的表达,抑制细胞的增殖。

结论构建的重组质粒能有效地降低人乳腺癌细胞HER2的表达,抑制细胞的增殖,为HER2高表达预后不良的乳腺癌基因治疗提供新策略。

【关键词】 RNA干扰受体表皮生长因子乳腺肿瘤瘤细胞培养的基因表达表皮生长因子受体2(HER2)在包括乳腺癌在内的多种上皮源性肿瘤中过度表达,与乳腺癌的发生、发展、预后等关系密切[1],是极具发展前途的基因治疗靶位。

约有30％乳腺癌患者伴随有HER2及其基因产物的过表达,HER2过表达是乳腺癌病人不良预后的重要标记物。

RNA干扰是近年来发展起来的基因阻断技术,它通过将双链NA)导入细胞后,在Dicer酶的作用下产生有活性的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),与该段RNA同源mRNA产生特异性降解,从而导致特异基因表达抑制的转录后基因沉默现象。

笔者采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人乳腺癌细胞株SKBr3细胞HER2的表达,探讨利用质粒表达载体体内合成siRNA的方法能否有效介导肿瘤细胞出现RNAi，从而为乳腺癌的基因治疗提供新策略。

1材料和方法材料细胞株SKBr3细胞(人乳腺癌细胞株，湖南远泰生物技术有限公司)。

主要试剂逆转录酶、TaqDNA聚合酶(立陶宛MBI公司);质粒美国Ambion公司);限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ和T4DNA连接酶、100 bp DNA ladder(大连宝生物技术公司);RMPI 1640培养基、Trizol 和Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司);MTT(美国Sigma公司);鼠抗人HER2单克隆抗体(美国R&D公司);TMB Western Blot 试剂盒(美国KPL公司)。

慢病毒介导shRNA稳定干扰P210_bcr_abl_基因表达的体内外研究

文章编号（Article ID）：1009－2137（2012）05－1090－05·论著·慢病毒介导shRNA稳定干扰P210bcr/abl基因表达的体内外研究朱玉峰，王元占*，孟凡义1南方医科大学南方医院实验动物研究中心，1血液病科，广东广州510515摘要P210bcr/abl融合基因在慢性髓系白血病（CML）发生、发展中起重要作用。

针对P210bcr/abl融合基因的小分子抑制剂（如伊马替尼）治疗CML非常有效，但容易产生耐药性。

P210bcr/abl基因的融合区为RNA干扰其表达提供了一个特异性靶点。

本研究通过病毒载体建立能同时表达P210bcr/abl shRNA和P210bcr/abl基因的BaF3细胞系，并探讨慢病毒介导的shRNA对P210bcr/abl基因表达的作用。

用荧光显微镜检测慢病毒对BaF3细胞的感染率，用台盼蓝拒染法检测细胞的增殖能力；用RT-PCR和Western blot分别检测P210bcr/abl mRNA和蛋白的表达。

结果发现，P210bcr/abl shRNA能使BaF3-P210bcr/abl细胞中的P210bcr/abl mRNA及蛋白表达明显下降，并且能增强BaF3-P210bcr/abl细胞对伊马替尼的敏感性，与不表达P210bcr/abl shRNA的BaF3-P210bcr/abl细胞相比，伊马替尼对该细胞系的IC50下降50%以上。

将该细胞由尾静脉移植到受致死剂量照射的裸小鼠体内，移植该细胞的小鼠生存期较移植BaF3-P210bcr/abl细胞的小鼠生存期明显延长。

结论：稳定表达针对P210bcr/abl基因融合区的shRNA可能增强CML常规治疗的效果。

关键词慢性髓系白血病；P210bcr/abl融合基因；RNA干扰；慢病毒载体中图分类号R733．72；Q7文献标识码AStable Interference on P210bcr/abl Gene Expression by Lentiviral Vector-delivered shRNA In Vitro and In VivoZHU Yu-Feng，WANG Yuan-Zhan*，MENG Fan-Yi1Experimental Animal Research Center，1Department of Hematology，Nanfang Hospital，The Southern Medical University，Guangzhou510515，Guangdong Province，China*Corresponding Author：WANG Yuan-Zhan，Associate Senior Scientist．Tel：（020）61641041．E-mail：yydws@fimmu．comAbstract P210bcr/abl fusion gene is indispensable for generation and progression of chronic myeloid leukemia（CML）．Small molecule inhibitors，such as imatinib，are effective for P210bcr/abl gene mediated CML，but drug resistance may occur．The unique fusion junction of P210bcr/abl gene is an attractive target for therapeutic intervention using RNA interference（RNAi）．This study was purposed to constructed the BaF3cell line by viral vector which can stably express P210bcr/abl shRNA and P210bcr/abl mRNA at the same time，and investigate the effect of lentiviral-victor-delivered shRNA on P210bcr/abl gene expression．The infective rate of lentiviral vector on BaF3cells with P210bcr/abl gene was assayed by fluorescent microscopy；the cell proliferation ability was determined by trypan blue exclusion；the P210bcr/abl mRNA and protein expressions were detected by RT-PCR and Western blot respectively．The results found that stable expression of the P210bcr/abl shRNA resulted in obvious inhibition of P210bcr/abl mRNA and protein expression and increased sensitivity of these P210bcr/abl gene transformed Ba/F3cells to imatinib．The IC50to imatinib in these cells decreased＜50%as compared with Ba/F3-P210bcr/abl cells which did not express P210bcr/abl mRNA．The survival time of the lethal dose irradiated mice induced by intravenous injection of these Ba/F3cells was longer than the other group induced by Ba/F3-P210bcr/abl．It is concluded that stable expression of shRNA targeting the P210bcr/abl gene fusion junction may potentiate the effects of conventional therapy for CML．Key words CML；P210bcr/abl gene；RNA interference；lentiviral vectorJ Exp Hematol2012；20（5）：1090－1094慢性髓系白血病（chronic myelogenous leu-kemia，CML）是累及骨髓造血干细胞的一类恶性肿瘤，表现Ph染色体或P210bcr/abl基因阳性是CML患者的分子遗传学特征［1，2］。

慢病毒表达载体研究全长组织因子对乳腺癌的作用

Ｓｔｕｄｙｏｎｒｏｌｅｏｆｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｗｉｔｈ
ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ
ＮＡｐａｒｔｉｃｌｅｓｔｏｋｎｏｃｋｄｏｗｎｆｕ１１．１ｅｎｇｔｈｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒ．Ｔｈｅｅｆｒｅｃｔｓｏｆｆｕ１１一ｌｅｎｇｔｈｔｉｓｓｕｅｆａｃｔｏｒ ’ Ｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｋｎｏｃｋ — ｄｏｗｎｏｎｅｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｗｅｒｅｓｈｏｗｎｂｙＴｒａｎｓｗｅｌ１ａｓｓａｙ，ｅｅｌｌｃｙｃｌｅｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅ —
的迁移并对其生长速度产生了一定的影响。在肿瘤细胞中下调ｆｌＴＦ的表达，能在一定程度上抑制肿瘤细胞的迁移和生长。结论慢病毒表达载体在ｆｌＴＦ的表达对乳腺癌细胞的影响中得到成功应用，ｆｌＴＦ可作为抑制肿瘤细胞生长和迁移的
靶分子，下调ｆｌＴＦ的表达或许能为乳腺癌的临床治疗开辟一条新的途径。
胞周期的影响，蛋白印迹法检测ｆｌＴＦ过表达和下调表达的效果，结合ＭＴＳ方法检测ｆｌＴＦ对细胞增殖的影响。结果ｆｌＴＦ

siRNA和shRNA：通过基因沉默抑制蛋白表达的工具

siRNA和shRNA：通过基因沉默抑制蛋白表达的工具RNA干扰（RNAi）是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，该过程通过双链RNA（dsRNA）使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。

RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。

沉默机制可导致由小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）诱导实现靶mRNA的降解，或者通过小RNA（miRNA）诱导特定mRNA翻译的抑制。

这篇综述将重点介绍shRNA和siRNA是如何导致蛋白质表达抑制的。

通过几种蛋白的活性（下面讨论），通过短反义核酸（siRNA和shRNA序列）锁定细胞mRNA，从而实现其随后的降解。

这反过来阻断了该蛋白的进一步表达/聚集，导致其水平的下降，最终实现抑制作用。

[放大]图1.siRNA和shRNA结构。

（A）siRNAs是短的RNA双链，在3‘端有两个碱基的游离。

（B）shRNA由正义链和反义链通过环状序列隔开共同组成。

（C） shRNA构建用于插入表达载体。

源自 [1, 2] 。

背景调控途径的发现和组成元件早在1984年人们就发现反义RNA能够抑制基因的表达。

1993年，Nellen和Lichtenstein提出了一个模型来解释这个观察。

然而，直到1998年，Fire等人发表了在线虫RNA干扰的结果，他们发现双链RNA在抑制基因表达方面实际上比单链RNA更有效。

最终确定小RNA 途径涉及的蛋白质组分有许多与RNA 干扰途径一样。

表一总结了RNA 干扰机制的主要元件。

它们包括锁定靶基因的双链RNA （siRNA 或shRNA ）、Dicer 酶，Argonaute 蛋白家族的蛋白质（具体来说是Ago-2）、Drosha 、RISC 、TRBP 和PACT 。

术语描述 siRNA 小干扰（siRNA ），有在3’端有两个碱基的游离，可激活RNA 干扰，通过与目标mRNA 互补结合序列特异性地实现mRNA降解。

shRNA 短发夹RNA （shRNA ），包含一个环结构，可加工成siRNA ，也可通过与目标mRNA 互补结合序列特异性地实现靶mRNA 降解.Drosha 是一种核糖核酸酶III 的酶，可加工细胞核中的前体-miRNA和shRNA 。

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慢病毒携带shRNA对乳腺癌HPA基因表达的抑制作用cancer. Methods: The HPA genes were chosen as target gene, 3 pairs expression vectors of recombinant lentivirus carried shRNA were constructed according to the sequence designed principle of interfering RNA (RNAi) were transfected in MDA-MB-231 cell of breast cancer. Western Blot was used to detect the expression level of HPA gene in vitro, and the breast cancer model was constructed for vivo verification, and then the expression level of HPA gene was detected by using immunohistochemistry. Results: In vitro experiment, both of the HPA-shRNA-1 group and HPA-shRNA-2 group effectively inhibited the expression of HPA gene in MDA-MB-231 cells of breast cancer. In vivo experiment, the expression of HPA gene of HPA-shRNA-2 group was obviously lower than that of negative group and blank group. The difference of positive rate between HPA-shRNA-2 group and blank group was statistically significant (x 2=12.504, P <0.05). And these results revealed that the expression of HPA gene in HPA-shRNA-2 group could be down-regulated in vivo experiment. Conclusion: The HPA is chosen as the targeting point to construct recombinant lentiviral vector carried shRNA, and the results of vitro and vivo experiment reveals that the expression of HPA gene can be down-regulated in the two groups. This result verifies that the new method can provide new targeting point for targeted therapy of breast cancer.[Key words] Breast cancer; HPA; shRNA; MDA-MB-231 cell; Immunohistochemistry; Western Blot[First-author’s address] Department of The First Surgery, Affiliated Hospital of Chengde Medical University, Chengde 067000, China.作者简介陈国利,男,(1980- ),硕士研究生，主治医师。

承德医学院附属医院外一科，从事乳腺癌基础与临床研究。

收稿日期：2017-04-28e103242.Gao YQ,Pan BC,Sun W,et al.Anxiety symp-tomsamong Chinese nurses and the associated factors: a cross sectional study[J].BMC Psychi-atry,2012,12:141.张兴贵,郑雪.青少年学生大五人格与主观幸福感的关系研究[J].心理发展与教育,2005,21(2):98-103.Kaufman SB,Quilty LC,Grazioplene RG,et al.Openness to experience and intellect differentially predict creative achievement in the arts and sciences[J].J Pers,2016,84(2):248-258. Sampaio A,Soares JM,Coutinho J,et al.The bigfive default brain: functional evidence[J].Brain Struct Funct,2014,219(6):1913-1922.曾进辉.体育锻炼与大学生人格特征的关系研究[J].重庆科技学院学报,2007(5):193-194.ConnVS.Anxiety outcomes after physical acti-vity interventions:meta-analysis findings[J].Nurs Res,2010,59(3):224-231.金胜真.体育锻炼对大学生焦虑情绪影响的元分析[J].体育研究与教育,2015(2):67-73.*基金项目：承德市科学技术研究与发展计划项目(20151029)“探讨以HPA为靶点治疗乳腺癌可行性”①承德医学院附属医院外一科河北承德 067600②承德医学院附属医院小儿内科河北承德 067000③承德市平泉县医院药剂科河北平泉 067500④承德市隆化县医院外二科河北隆化 068150*通讯作者：chenguoli1015@[9] [10] [11] [12] [13] [14] [15]学术论著乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，也是导致女性死亡主要肿瘤之一，且呈逐年上升趋势，严重威胁女性的身心健康，甚至生命安全。

目前的研究认为，乳腺癌是全身性疾病，病因尚不清楚，可能与乳腺良性疾病、雌激素、孕激素、环境因素以及生活方式等有一定关系，乳腺癌目前的治疗方案与以往大不相同，目前以手术切除为主，配合放化疗和内分泌治疗以及生物治疗的个体化综合治疗。

尽管乳腺癌患者5年生存率明显提高，但是乳腺癌的复发和转移仍然是导致患者死亡的主要原因，因此乳腺癌的复发转移是急需攻克的难题。

乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是目前发现的一种能裂解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的β-D糖苷内切酶，HPA通过降解细胞外基质和诱导血管生成促进乳腺癌的复发转移[1]。

本研究以HPA基因为靶点构建HPA短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)重组慢病毒表达载体，通过体内、体外实验研究靶向抑制乳腺癌HPA基因表达的可行性，为乳腺癌的基因治疗寻找新的靶点。

1 材料与方法1.1 设备材料和试剂(1)Thermo Forma培养箱(美国，Thermo Electron 公司)；Cytoprep-1离心机(长沙英泰仪器有限公司)。

(2)慢病毒包装293T 细胞和人乳腺癌M D A -MB-231细胞株均购自上海市中科院细胞库；L-15培养基和胰酶购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；Mouse monoclonal to Heparanase 1抗体购自英国abcam公司；慢病毒系统由上海吉玛制药技术有限公司合成；健康BALB/C雌性裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

(3)细胞可溶性蛋白制备试剂购自上海GenMed Scientifics公司；Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司；SYBR Premix Ex Taq荧光实时定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；1.2 体外实验方法(1)乳腺癌MDA-MB-231细胞培养。

乳腺癌MDA-MB-231细胞株接种于含10%胎牛血清L-15培养基中，放置于37℃、5%CO2培养箱内培养。

(2)靶向HPA shRNA序列设计。

以HPA为靶点，根据shRNA序列设计原则，设计出的shRNA序列见表1。

(3)HPA shRNA慢病毒表达载体的构建和重组慢病毒的包装。

将合成寡核苷酸片段退火形成双表1 HPA 特异性干扰序列序列号干扰序列HPA-shRNA15’GCAAGCCTCCAAGGTAGTAAG3’HPA-shRNA25’GCTTGCGTCCTTTCTGAAATA3’HPA-shRNA35’GGAGAATGTAGCTCTCGTTAT3’HPA-阴性对照5’GTTCTCGCTACGTGTGAGCGT3’链DNA，PCR扩增、回收、纯化。

双链DNA经T4 DNAligase与线性化质粒连接，转化DH5α大肠杆菌，挑取重组阳性克隆进行测序鉴定。

将293T细胞进行培养，当密度达到70%～90%开始转染，用HPA-RNA干扰(RNA interfering，RNAi)序列重组质粒和病毒包装3个质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)，共转染细胞293T，72 h后收集上清液，离心(10000 r/min，3 min)，过滤浓缩获得慢病毒浓缩液，并测定慢病毒原液的滴度，分装后在-80 ℃保存。

(4)HPA shRNA重组慢病毒转染乳腺癌MDA-MB-231细胞效果检测。

实验中将细胞分为5组：①HPA-shRNA-1组；②HPA-shRNA-2组；③HPA-shRNA-3组；④HPA-阴性对照组；⑤空细胞组。

其中，除空细胞组外的1～4组MDA-MB-231细胞分别感染HPA shRNA-1、HPA shRNA-2、HPA shRNA-3和HPA shRNA-阴性对照慢病毒，空细胞组未做任何处理。

将感染后的细胞培养72 h后在荧光显微镜下观察转染效率。

(5)采用蛋白质印迹(western blot)法检测HPA 的表达。

转染72 h后去除各组细胞培养液，用PBS 洗涤细胞，通过RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，采用考马斯亮蓝法蛋白定量，10% SDS-PAGE电泳分离后转移到PVDF膜，封闭转印膜2 h，然后加入稀释HPA单克隆抗体，于冰箱内4 ℃温育12 h，洗涤，加入稀释二抗，在室温温育2 h后显色，通过凝胶成像系统分析，采用3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参照。