实验3---悬浮细胞的培养

细胞悬浮培养摘要：悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。

但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。

随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。

关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化1．细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。

应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。

细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。

应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法2.1 机械法早期用机械法分离叶组织单细胞。

Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。

随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。

Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。

2.2 酶解法酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。

人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。

293悬浮细胞转染标准操作规程1.0 目的：规范293悬浮细胞转染相关操作，保证293悬浮细胞转染工作正常进行,确保获得高表达的293工程细胞。

2.0 适用范围：适用于生物部日常293悬浮细胞转染相关实验。

3.0 工作程序：3.1细胞复苏：操作者按照《哺乳动物细胞复苏标准操作规程》要求，复苏293悬浮细胞于25CM2培养瓶中，培养体积为5-7ml，放CO2培养箱，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%。

3.2培养3-5天，细胞长满后，用移液管反复吹打细胞，使细胞重悬，将细胞悬液转至15ml 离心管，1000rpm离心3min。

3.3用无菌移液管轻轻将离心后的上清吸出，加入20ml新培养基，吹打、重悬细胞，将细胞悬液转入2个25CM2培养瓶，每个培养瓶10ml，放CO2培养箱，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%。

3.4当细胞密度长到2×106cells/ml左右时，用无菌移液管吹打培养瓶内的细胞，是细胞重新悬浮成单个细胞，将细胞转至125ml细胞摇瓶中，补充新鲜培养基至30ml，放CO2摇床，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%。

3.5培养3-4天，细胞密度达到1×106cells/ml左右时，收集细胞悬液，1000rpm离心3min。

3.6弃上清，用60ml新鲜培养基重悬细胞，将细胞转至250ml细胞摇瓶中，放CO2摇床，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%，摇床转速为125rpm。

3.7培养2-3天，细胞密度达到2×106cells/ml左右时，1:3传代至新摇瓶，传代后细胞密度为5-6×105cells/ml，摇瓶放CO2摇床，37℃通气培养，CO2浓度为5-8%，摇床转速为125rpm。

3.8培养1-2天，细胞密度达到1-1.2×106cells/ml左右时，进行转染。

3.9质粒DNA中加入0.5-3ml不等的70%乙醇，10000rpm离心5min，吸去上清，将离心管倒置于吸水纸上，室温晾干。

植物细胞悬浮培养的方法植物细胞悬浮培养是一种常用的细胞培养方法，它可以用于研究植物细胞的生长、分化和代谢等方面的问题。

本文将介绍植物细胞悬浮培养的基本原理、培养条件和应用。

一、植物细胞悬浮培养的基本原理植物细胞悬浮培养是将植物细胞从组织中分离出来，以液体培养基为基质，在适宜的温度、光照和气体条件下进行培养。

悬浮培养的优势在于可以提供细胞自由生长的环境，有利于探究植物细胞的生理和生化特性。

二、植物细胞悬浮培养的培养条件1. 培养基：植物细胞悬浮培养的基础是培养基的选择。

培养基中应含有适宜的营养物质，如碳源、氮源、无机盐和维生素等。

常用的培养基有MS培养基、B5培养基等。

2. 温度：植物细胞的适宜生长温度通常在20-25摄氏度之间，不同植物细胞可能有所差异，需要根据具体情况进行调整。

3. 光照：光照条件对植物细胞的生长和代谢有一定影响。

一般情况下，光照强度为1000-2000勒克斯，光周期为16小时光照/8小时黑暗。

4. 气体：植物细胞悬浮培养通常需要提供充足的氧气和适量的二氧化碳。

因此，培养容器应具有良好的通气性，可以使用摇床或气体通气系统进行培养。

三、植物细胞悬浮培养的应用植物细胞悬浮培养在植物生理学、生物工程和药物研发等领域具有广泛的应用价值。

1. 植物生理学研究：植物细胞悬浮培养可以用于研究植物的生长发育过程，如细胞分裂、细胞扩增和细胞器的形成等。

2. 生物工程：植物细胞悬浮培养可以用于生物工程的研究和应用，如基因转化、蛋白质表达和次生代谢产物的生产等。

3. 药物研发：植物细胞悬浮培养可以用于药物的筛选和生产，如植物次生代谢产物的提取和纯化，以及药物的生物活性和毒性测试等。

四、植物细胞悬浮培养的优缺点1. 优点：(1) 与传统的植物培养相比，悬浮培养提供了更便利的细胞生长环境，可以快速获得大量的细胞。

(2) 可以对植物细胞的生理和代谢进行深入研究。

(3) 可以为生物工程和药物研发等领域提供重要的研究手段和应用平台。

1.组织培养：是指通过无菌操作分离植物体的一部分接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。

继代培养：指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。

2.单倍体培养：单倍体植物的主要特点是其孢子体细胞的染色体数目和配子体细胞染色体数目一致，因此可以从其“表型”观察“基因型”。

利用这一特点在杂交育种中可以提高选择效率，避免误选和漏选。

对单倍体植物进行染色体人工加倍之后，即可得到同质结合的纯系，使育成的杂种不再分离，缩短育种年限，加快育种速度。

3.悬浮细胞培养定义：将离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养步骤：选择外植体---诱导疏松易碎的愈伤组织---悬浮继代培养---悬浮细胞同步化---细胞计数与活力测定三个条件：分散性良好、均一性好、生长迅速特点：1）细胞可不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；2）能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。

4.花粉培养与花药培养一、从概念来看，花药离体培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花药内花粉粒的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。

花粉离体培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术，由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育而成的植株都是单倍体，且不受花药的药隔、药壁、花丝等体细胞的干扰。

二、从培养层次来看，花药离体培养属器官培养，花粉离体培养属细胞培养，但花药离体培养和花粉离体培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。

三、从培养过程来看，花药离体培养相对较容易，技术比较成熟，但最后需要对培养成的植株进行染色体倍数检测；花粉离体培养尽管不受花药壁、药隔等二倍体细胞的干扰，但这种特殊单倍体细胞的培养技术难度较大，目前只在少数植物上获得成功。

悬浮细胞培养方法和注意事项悬浮细胞培养方法和注意事项悬浮细胞培养是一种将细胞悬浮于培养基中进行培养的方法。

这种方法通常用于培养悬浮生长的细胞，如血液中的白细胞、淋巴细胞等。

下面将介绍悬浮细胞培养的方法和注意事项。

1. 准备培养基和细胞首先要准备适合的培养基和细胞。

培养基的选择要根据细胞的需求来选取，一般要添加适量的血清、营养物质等，以满足细胞的生长和分裂需求。

细胞的获取可以通过酶消化、机械剪切等方式获得，注意要保持细胞的完整性和活力。

2. 调整细胞密度将细胞悬浮于培养基中前，需要对细胞密度进行调整。

一般来说，细胞密度应该控制在适当的范围内，过高或过低都会影响细胞的生长和分裂。

可以通过显微镜观察来确定细胞密度，或者使用自动化细胞计数器进行计数。

3. 培养细胞将细胞悬浮于培养基中，放置在恒温恒湿的细胞培养箱中。

要定时观察细胞的生长情况，调整培养基或细胞密度，以满足细胞的需要。

此外，还要注意培养箱的清洁和消毒，以避免细菌和其他微生物的污染。

4. 注意事项在进行悬浮细胞培养时，要注意以下几点：- 细胞密度控制：过高或过低的细胞密度都会影响细胞的生长和分裂，要控制在适当的范围内。

- 培养基选择：不同的细胞对培养基的要求不同，要选择适合的培养基。

- 细胞活力：细胞的获取和处理过程中要注意保持细胞的完整性和活力。

- 消毒措施：细胞培养箱的清洁和消毒很重要，要避免微生物的污染。

- 观察和调整：定时观察细胞的生长情况，及时调整培养基或细胞密度，以满足细胞的需要。

总之，悬浮细胞培养是一种有效的细胞培养方法，但要注意细胞密度、培养基选择、细胞活力、消毒措施等方面的问题。

只有在细心认真的操作下，才能获得高质量的细胞培养物。

悬浮细胞培养步骤悬浮细胞培养是一种常用的细胞培养方法，适用于那些不依附于培养基底的细胞，如血液细胞、淋巴细胞等。

本文将介绍悬浮细胞培养的具体步骤。

步骤一：选择适当的培养基在进行悬浮细胞培养前，需要选择适合细胞生长的培养基。

常用的培养基有RPMI-1640、DMEM等，其中含有丰富的营养物质和生长因子，可以满足细胞的生长需求。

步骤二：准备培养器具在进行悬浮细胞培养前，需要准备一些必要的培养器具，如离心管、培养瓶、移液管等。

这些器具需要事先进行无菌处理，以确保培养过程的无菌性。

步骤三：收集细胞将需要培养的细胞收集起来。

对于血液细胞等悬浮细胞，可以通过采血或离心分离的方式获得。

将细胞悬浮在培养基中，使细胞均匀分散。

步骤四：培养细胞将细胞悬浮液转移到培养瓶中，并加入适量的培养基。

将培养瓶放入恒温培养箱中，设置适当的温度和湿度，提供细胞生长所需的条件。

步骤五：观察细胞生长定期观察细胞的生长情况。

可以通过显微镜观察细胞形态的变化，或使用细胞计数仪测定细胞数量的变化。

根据细胞的生长情况，可以调整培养基中的营养物质浓度或添加适当的生长因子来促进细胞增殖。

步骤六：细胞传代当细胞密度达到一定程度时，需要进行细胞传代，即将细胞转移到新的培养瓶中。

传代的目的是避免细胞过度生长而导致细胞凋亡或失去特性。

传代时要注意保持细胞的无菌性，避免细菌或真菌的污染。

步骤七：采集细胞上清液在培养过程中，细胞会释放出一些细胞因子或代谢产物，这些物质存在于培养基的上清液中。

可以定期采集上清液，进行进一步的分析或利用。

步骤八：实验操作悬浮细胞培养可以用于各种细胞实验，如细胞增殖实验、药物筛选实验等。

根据实验的要求，可以对培养条件进行调整，如改变培养基中的成分或添加特定的试剂。

步骤九：细胞收获当需要收获细胞时，可以通过离心的方式将细胞从培养基中沉淀下来。

收获的细胞可以用于细胞分析、蛋白质提取等后续实验。

总结：悬浮细胞培养是一种常用的细胞培养方法，适用于不依附于培养基底的细胞。

悬浮细胞培养及siRNA转染1.悬浮细胞培养用T25的培养瓶，一般密度较少时培养基最多5ml2.换液，动作缓慢的将培养瓶拿出，将上面无细胞的培养基弃去2ml加入新鲜培养基置于37℃，5%CO2培养箱中培养3.传代培养，将细胞吹匀，计数后，将细胞放入离心管内进行离心，1000rpm，5min后，弃去上清，用新鲜培养基重悬后放入T25中进行传代置于37℃，5%CO2培养箱中培养4. siRNA转染24孔板中以2x105细胞/孔密度进行接种后（6孔板或96孔板接种密度进行相应调整）准备进行siRNA转染，实验每组设置3个复孔，siRNA以Nuclease-Free Water稀释至储存液浓度，通常为20 μM。

（实验组一般设置：阴性对照，阳性对照，空白对照，siRNA 实验组，其他siRNA荧光标签组（要避光保存））。

5.根据siRNA终浓度进行溶液配制（以下溶液配制以50 nM为siRNA 最终浓度，24孔板中终液体体积为500 μl为例），溶液1配制：每孔1.25 μl siRNA储存液以无血清无双抗培养基稀释至25 μl，按此比例依照孔数进行扩大，将最终液体进行充分混匀；溶液2配制：每孔2 μl Lipo 2000转染试剂（可用其他替代，用量参照说明书推荐或自行优化）以无血清无双抗培养基稀释到25 μl，按此比例依照孔数进行扩大，将最终液体进行充分混匀；上述2种溶液混匀后分别室温静置5min；6.将溶液1滴加至溶液2中并进行充分混合（每孔为50 μl），室温静置20-30 min；静置完成后，将上述混合液滴加进去24孔板中，每孔50 μl，注意滴加不要过快，以防冲起细胞，滴加完成后每孔加入450 μl无血清无双抗培养基，充分混匀，将板放入37℃，5%CO2培养箱中培养7.6h后，将板取出放入cytation5中看荧光显色，siRNA是否转染成功8.在细胞操做台上，将24孔中每孔细胞液移入1mlEP管内进行离心，6000 rpm离心5min，弃去上清，加入有10%FBS无双抗的培养基进行重悬后加入24孔板进行培养。

用MDBK 悬浮细胞培养BPIV-3的初步研究刘国英 张晨宇 张燕红 齐志涛 路荣 范秀丽 高艳华 方建国 郝鹏**/金宇保灵生物药品有限公司 010100基金项目：国家重点研发计划资助（2017YFD 0500903）作者简介：刘国英，兽医硕士，主要从事兽用疫苗研究与开发。

*通讯作者：郝鹏摘 要：为了提高BPIV-3灭活疫苗产能及稳定性，初步探究了在MDBK 悬浮细胞中的培养条件。

将种毒按不同接种比例在MDBK-S 悬浮细胞中，72h 后收获病毒液，测定TCID 50，探究最佳的病毒接种量；按2%的种毒接种在不同密度的悬浮细胞中，72h 收获病毒液，通过测定TCID 50，探究最佳的细胞密度；将2%的种毒接种在2.0×106cells/ml 的悬浮细胞中，于接毒后不同时间收获病毒液，测定TCID 50，探究最佳的收毒时间；在最佳培养条件的基础上，与贴壁毒TCID 50做对比。

结果表明，病毒接种比例为2%，MDBK 悬浮细胞密度为2.0×106cells/ml ，接毒后72h 收获，病毒TCID 50最高；悬浮细胞产毒能力比贴壁细胞高。

关键词：MDBK 悬浮细胞；牛副流感3型；悬浮培养牛副流感病毒3型（BPIV-3）是副粘病毒科的呼吸道病毒属成员[1]。

该病毒是多形的，被包膜，直径为150-300nm [2]，非分段的负链RNA 。

BPIV-3是世界范围内犊牛和成年牛病毒呼吸系统疾病相关的重要病原体之一，在运输中也称为热应激，导致牛发病和大量死亡。

BPIV-3常与其它病毒或细菌混合感染，引起以高热、咳嗽等症状的牛呼吸道疾病综合征（BRDC ），成为全球范围内影响牛健康的主要问题，给养牛业造成了极大的经济损失，给全世界的畜牧业带来了沉重负担。

最早于1959年，Reisinger 等在美国因运送牛，从发热牛体内分离出该病毒，最初被命名为粘液病毒SF-41[3]。

之后，前苏联、丹麦、法国、加拿大、日本、意大利、澳大利亚等国家也接连分离出该病毒。

悬浮细胞的免疫荧光实验步骤引言悬浮细胞的免疫荧光实验是一种常用的细胞学研究方法，通过荧光染色的方式，可以对细胞进行定量和定位的研究。

本文将详细介绍悬浮细胞的免疫荧光实验的步骤和操作要点。

实验材料和仪器•悬浮细胞培养物•PBS缓冲液•4% paraformaldehyde•0.1% Triton X-100•阻断液（如5% BSA）•一抗和二抗•荧光染料（如FITC、TRITC等）•荧光显微镜•离心管•倒置显微镜实验步骤1. 细胞的处理和固定1.1 用PBS缓冲液洗涤悬浮细胞，去除培养基中的杂质。

1.2 将细胞转移到离心管中，并进行离心（1000 rpm，5分钟）。

1.3 倒掉上清液，用PBS缓冲液洗涤一次。

1.4 加入4% paraformaldehyde固定细胞（室温，15分钟）。

1.5 倒掉固定液，用PBS缓冲液洗涤一次。

2. 细胞的渗透和阻断2.1 加入0.1% Triton X-100渗透液，使细胞膜通透（室温，10分钟）。

2.2 倒掉渗透液，用PBS缓冲液洗涤一次。

2.3 加入适当浓度的阻断液，阻断非特异性结合位点（室温，1小时）。

3. 一抗的孵育和洗涤3.1 加入适当浓度的一抗（如抗体）溶液，孵育细胞（室温，1小时）。

3.2 倒掉一抗溶液，用PBS缓冲液洗涤三次，每次洗涤5分钟。

4. 二抗的孵育和洗涤4.1 加入适当浓度的二抗（如荧光标记的二抗）溶液，孵育细胞（室温，1小时）。

4.2 倒掉二抗溶液，用PBS缓冲液洗涤三次，每次洗涤5分钟。

5. 荧光染色和显微观察5.1 加入适当浓度的荧光染料（如FITC、TRITC）溶液，孵育细胞（室温，30分钟）。

5.2 倒掉荧光染料溶液，用PBS缓冲液洗涤三次，每次洗涤5分钟。

5.3 用倒置显微镜观察细胞的荧光信号，并进行拍照记录。

结果与分析通过悬浮细胞的免疫荧光实验，我们可以观察到细胞中特定蛋白的分布和定位。

荧光信号的强度和位置可以提供有关细胞功能、代谢和亚细胞结构的重要信息。

悬浮细胞转染步骤一、细胞准备：1.选择合适的细胞系：不同类型的细胞具有不同的转染效率和稳定性，因此需要根据实验需要选择合适的细胞系。

常用的细胞系包括293细胞、CHO细胞、HEK293细胞等。

2.细胞培养：将细胞培养至对数生长期，通常细胞密度达到70-80%时适合进行转染。

3.细胞分离：用一种适当的方法将细胞从培养皿或瓶中分离出来，以便用于后续的转染实验。

常用的方法包括（1）磁珠分离法、（2）离心分离法、（3）胶体金法。

二、DNA转染：1.选择DNA载体：根据实验需要选择合适的DNA载体，常用的载体包括质粒、病毒载体等。

2.制备转染复合物：将目标DNA与转染试剂混合，制备转染复合物。

常用的转染试剂有聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体（Lipofectamine）等。

将DNA和转染试剂按照一定的比例混合，放置一段时间使其形成复合物。

3.转染：将转染复合物加入到细胞培养液中，轻轻摇晃培养皿或瓶使其均匀分布。

可以将细胞与转染复合物共培养一段时间，常见的培养时间为4-6小时。

4.改善转染效率：为了提高转染效率，可以参考以下措施：（1）优化细胞密度，细胞密度过高或过低都会降低转染效率。

（2）优化转染试剂的浓度和比例。

（3）使用流式细胞术多次转染。

三、细胞培养：1.细胞恢复：在转染后的4-6小时内，将培养液中的转染复合物移除，用含有适当浓度的培养液代替。

继续培养细胞直到目标基因的表达达到最佳效果。

2.筛选和鉴定：根据实验的需要，可以对转染细胞进行筛选和鉴定，如使用含有抗生素的培养液筛选得到带有目标基因的细胞。

3.进一步培养：将筛选得到的转染细胞选择性地进行培养，培养至需要的细胞数量。

可以根据需要进行细胞扩增或冻存，以备后续实验使用。

总结起来，悬浮细胞转染主要包括细胞准备、DNA转染和细胞培养三个步骤。

关键的技术点包括合适的细胞系选择、转染复合物的制备和转染条件的优化。

通过合理的实验设计和技术操作，可以成功地将外源DNA导入到悬浮细胞中，实现对目标基因的研究和应用。

悬浮细胞扫描电镜的标本的制备
悬浮细胞扫描电镜的标本制备是一个关键的步骤，它需要精确
的操作和耐心。

首先，我们需要准备一个含有悬浮细胞的样品。

这
些悬浮细胞可以来自培养物中的细胞，或者从组织中分离出来。

接
下来，我们需要将这些悬浮细胞固定在一个适当的载玻片上。

固定
的方法通常包括用乙醛或氧化铂等化学物质进行固定，或者使用冷
冻固定技术。

固定后，样品需要进行脱水处理，通常使用乙醇浓度
逐渐升高的方法。

然后，样品需要被干燥，可以通过自然干燥或者
使用临界点干燥法。

接下来是金属涂覆，通常使用金属如金或铂进
行喷涂，以增加样品的导电性。

最后，样品可以被放入扫描电镜中
进行观察和成像。

在整个制备过程中，需要严格控制各个步骤的时
间和条件，以确保最终的标本能够展现出清晰的细胞结构和形态特征。

此外，在操作过程中需要注意安全，避免对人体和环境造成伤害。

总的来说，悬浮细胞扫描电镜的标本制备需要细致的操作和严
格的控制，以确保最终观察到的细胞结构和形态信息是准确可靠的。

悬浮细胞的免疫荧光实验步骤引言悬浮细胞的免疫荧光实验是一种常用的实验方法，用于检测细胞表面或细胞内的特定抗原。

本文将详细介绍悬浮细胞的免疫荧光实验步骤。

实验材料•细胞培养物•PBS 缓冲液•离心管•血清（含抗体）•荧光染料（如 FITC、PE 等）•显微镜片•封口胶实验步骤1. 细胞培养与收集1.1 预先准备好需要进行实验的细胞培养物，确保其在良好的生长状态下。

1.2 使用 PBS 缓冲液洗涤细胞，去除培养物中的残留物。

1.3 使用离心管将洗涤后的细胞收集起来，并进行离心，以沉淀细胞。

2. 细胞固定与渗透化处理2.1 将离心后的细胞沉淀加入适量的 PBS 缓冲液，使细胞悬浮。

2.2 将细胞悬浮液滴于显微镜片上，并用封口胶固定显微镜片，使细胞固定。

2.3 使用适当的渗透剂（如 Triton X-100）进行渗透化处理，以使荧光染料能够进入细胞内。

3. 抗体染色3.1 准备含有特定抗体的血清。

3.2 将抗体血清滴于固定的细胞上，保持一定时间的孵育，使抗体与细胞中的目标抗原结合。

4. 荧光染色4.1 准备荧光染料（如 FITC、PE 等），按照说明书中的指导将其溶解于适量的溶剂中。

4.2 将荧光染料溶液滴在固定并经抗体染色后的细胞上，并保持一定时间的孵育，以便荧光染料与抗体结合。

5. 洗涤与封片5.1 使用 PBS 缓冲液洗涤固定、染色后的细胞，去除多余的抗体和荧光染料。

5.2 将洗涤后的细胞沉淀加入适量的 PBS 缓冲液，使细胞悬浮。

5.3 将细胞悬浮液滴于显微镜片上，并用封口胶固定显微镜片，以封装细胞样品。

6. 显微观察与分析6.1 将封好的显微镜片放置在荧光显微镜下，调整合适的放大倍数和曝光时间。

6.2 使用荧光显微镜观察固定、染色后的细胞，并记录荧光信号。

6.3 根据观察结果，分析细胞表面或细胞内特定抗原的表达情况，并进行数据统计和图形展示。

结论悬浮细胞的免疫荧光实验是一种用于检测细胞表面或细胞内特定抗原的常用方法。

悬浮细胞传代步骤简介悬浮细胞传代是一种常用的细胞培养技术，用于扩增和维持悬浮细胞系的生长。

本文将详细介绍悬浮细胞传代的步骤，包括准备工作、传代操作和培养条件的调整。

准备工作在进行悬浮细胞传代之前，需要做一些准备工作，以确保实验顺利进行。

1.消毒操作：在进行任何实验之前，必须对实验室台面、培养器具和试剂进行彻底消毒，以防止污染和交叉感染。

2.培养基准备：根据所需的培养基配方，准备好足够的无菌培养基。

常用的培养基有DMEM、RPMI-1640等。

保持培养基在4摄氏度下保存，并避免阳光直射。

3.培养器具准备：准备好所需的培养器具，包括离心管、移液管、离心机、显微镜等。

确保这些器具已经消毒并无污染。

4.细胞培养条件调整：根据所需的细胞系，调整培养条件，包括温度、CO2浓度和湿度等。

一般来说，细胞在37摄氏度、5% CO2和95%湿度下生长最为理想。

传代操作悬浮细胞传代的步骤如下：1.收获细胞：将培养好的悬浮细胞系从培养瓶中收获出来。

可以使用离心机将细胞沉淀到离心管中，或者使用吸管等工具将细胞转移至新的培养器具中。

2.计数细胞：使用显微镜或自动计数器对收获的细胞进行计数。

这一步是为了确定需要传代多少个细胞，以便保持适当的密度。

3.离心沉淀：根据所需的传代比例，将计数好的细胞进行离心沉淀。

离心速度和时间根据不同的实验要求而定，一般为1000-1500rpm，5-10分钟。

4.去除上清液：倒掉上清液，并留下适量的液体悬浮细胞沉淀。

5.细胞重悬：将沉淀的细胞用适量的培养基进行重悬，使细胞均匀分散在培养基中。

注意避免产生气泡，以免对细胞造成机械损伤。

6.接种新培养器具：将重悬的细胞转移到新的培养器具中。

可以是新的培养瓶、离心管或96孔板等，根据实验要求选择合适的培养器具。

7.补充培养基：将足够量的新鲜培养基加入到新的培养器具中，使细胞能够正常生长和繁殖。

保持适当的培养基液面高度，以确保细胞获得足够的营养和氧气。

8.培养条件调整：将新接种的培养器具放入恒温箱中，并根据之前调整好的培养条件进行调整。

THP1细胞复苏传代以及冻存步骤
一,复苏
1,将液氮中冻存细胞拿出，迅速放在37℃水浴锅1-2min至融化。

2,1640培养液提前放入37℃,用1640培养基6ml左右洗涤一次，注意吹打使细胞分散，然后300g（rcf）5min离心（活细胞最大1400g）3,弃掉上清，用6ml左右培养基重悬。

4,加入到T25培养瓶，镜下观察细胞状态。

5,悬浮细胞竖立放入温箱。

二，传代（传代两次以上再用于后续实验）
1,镜下观察细胞密度，计数板计数，确定稀释倍数。

2,300g（rcf）5min离心，去除培养液。

3,加入适量预热的培养基，制成10^5个细胞/ml 的细胞悬液。

4,分装到2-3个新培养基，将其放入培养箱，24h观察一次（变黄了就传一次，2d左右）
三,冻存细胞
1，离心弃上清，用冻存液（领商品化试剂或者领血清，DMSO等配制），1ml左右混匀，注意避免气泡。

2,商品化的先放进-80℃，4h左右，再放入液氮罐，自己配制的要缓冻，先将-80℃盒子拿出来平衡，然后放入-80℃过夜，然后放液氮，或者在4℃，-20℃，-80℃依次放4h，然后转入液氮。