细胞色素P450nor在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化
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收稿日期：2009－03－20；修回日期：2009－05－31基金项目：国家自然科学基金（No．30170011）作者简介：陈舒丽（1980－），女，硕士；通讯作者：罗德生（1950－），男，教授，E-mail ：jxa12419@126．com 。
doiʒ10.3969/j．issn．1008－9632．2010.04．005细胞色素P450nor 在大肠杆菌中的克隆表达及分离纯化陈舒丽1，刘德立2，蔡朝晖3，刘汉才1，罗德生1（1．咸宁学院基础医学院，湖北咸宁437100；2．华中师范大学生命科学学院，湖北武汉410079；3．咸宁学院化学与生命科学学院，湖北咸宁437100）摘要：研究改造了原有的未能高效表达的重组表达载体pRSET-p450nor ，通过PCR 方法，去除了P450nor 起始密码子ATG 上游的59个碱基序列。
将真菌细胞色素P450nor 基因首先克隆至克隆载体pBluescript II 上，然后亚克隆到高效表达载体pET-28上，得到了重组表达载体pET-p450nor 。
该基因在30ħ、0.1mM IPTG 诱导下在大肠杆菌中获得高效表达融合蛋白His-P450nor 。
SDS-PAGE 蛋白电泳表明在45kD 处出现强特异性带。
将大量表达的重组蛋白用Ni-NTA 亲和层析柱纯化，得到了单一的目的条带。
关键词：细胞色素P450nor ；克隆；表达；大肠杆菌中图分类号：Q503；Q78文献标识码：A文章编号：1008－9632（2010）04－0005－03Cloning expression and purification of cytochrome P 450nor in Escherichia coliCHEN Shu-li 1，LIU De-li 2，CAI Zhao-hui 3，LIU Han-cai 1，LUO De-sheng 1（1．Basis medical college ，Xianning College ，Xianning 437100；2．College of Life Science ，Huazhong Normal University ，Wuhan 430079；3．College of Chemistry and life Science ，Xianning College ，Xianning 437100，China ）Abstract ：P450nor gene was amplified by PCR using previously constucted pRSET-p450nor as template．59bp of the upstream se-quence of P450nor gene was deleted．The recombinant plasmid pBlue-p450nor was constructed by inserting PCR fragment ，i．e．P450nor gene ，into cloning vector pBluescript II．Then the P450nor gene from pBlue-p450nor was sub-cloned into the prokaryotic ex-pression vector pET-28to construct recombinant expression plasmids pET-p450nor．The pET-p450nor was transformed into Escherichia coli BL21．The expression level of recombinant protein His-P450nor was high at 30ħafter 0.1mM IPTG inducing．SDS-PAGE analy-sis showed a specific band （about 45kD ）．It indicated that the target protein was expressed successfully．The over-expressed cyto-chrome P450nor was purified to electrophoretic homogeneity by the facilitation of metal （Ni 2+）chelate affinity chromatography．A sin-gle band ，about 45kD ，was detected．Keywords ：cytochrome P450nor ；cloning ；over-expression ；purification细胞色素P450是一类能与CO 结合，形成的复合物在450nm 附近有最大吸收峰的血红蛋白的总称［1］。
已经发现的细胞色素P450超过3000种，从细菌到高等动、植物都普遍存在这种蛋白［2］。
它可催化多种生化反应，在外源性和内源性化合物代谢中起着非常重要的作用［3］。
细胞色素P450nor 是一类独特的细胞色素P450，虽然它属于P450超家族，但没有单加氧酶活性［4］。
它在真菌反硝化中起着NO 还原酶的作用，能以NAD （P ）H 为直接电子供体将NO 还原成N 2O ［5］。
其催化机制如下：2NO +NAD （P ）H +H +→N 2O +NAD （P ）++H 2O 。
反硝化在大气氮循环中起着重要的作用［6］，可去除污水中的硝酸盐或亚硝酸盐，使其转变为N 2或N 2O 。
细胞色素P450nor 在真菌的反硝化中起着重要的作用，所以研究细胞色素P450nor ，对污水的治理将有非常重要的价值。
虽然已有5种真菌细胞色素P450nor 被克隆和测序［7－8］，但重组细胞色素P450nor 却一直未能高效表达。
这就极大地限制了对细胞色素5P450nor作用机理以及酶结构与功能的研究。
本研究改造了原来构建的未能高效表达的表达载体pRSET-p450nor，去除了P450nor基因上游59个碱基序列，并利用高效表达载体pET-28在大肠杆菌中构建了重组细胞色素pET-p450nor，为细胞色素P450nor的高效表达和分离纯化奠定了良好的基础。
1材料与方法1．1材料1．1．1菌株与质粒大肠杆菌TG1、BL21，质粒载体pBluescriptⅡ，pET-28a，均由本室保存。
1．1．2工具酶及主要试剂DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶均为TaKaRa公司产品。
DNA Marker及低分子量蛋白质标准购于华美生物工程公司。
1．2方法1．2．1细胞色素P450nor的克隆PCR方法扩增细胞色素P450nor片段。
根据P450nor核苷酸序列设计引物，P450nor基因核苷酸序列及编码蛋白质序列见GenBank，登记号为：D78512。
引物序列为：P1：5'CGGGATCCATGCACGCTACCGAAGACGA3'；P2：5'CCCAAGCTTGCCATCTGTCATCCATCTACCA3'。
下划线部分为酶切位点，分别是：Bam HI和Hin dIII。
反应程序为：95ħ加热预变性5min后，95ħ变性30s，55ħ退火30s，72ħ延伸1min，30个循环，72ħ延伸10min，4ħ保温。
1．2．2蛋白质的原核表达将含有重组表达质粒pET-p450nor的大肠杆菌单菌落接种到5mL含相应抗生素的LB培养基上，37ħ培养过夜。
然后以1ʒ100稀释到新鲜的培养基中，培养约2h使其OD600值约为0.6，加IPTG至终浓度为0.1mM，在30ħ诱导不同时间取出制样，SDS-PAGE检测表达结果。
1．2．3目的蛋白的大量制备将含有重组表达质粒的大肠杆菌单菌落接种到5mL含相应抗生素的LB培养基中，37ħ培养过夜。
按1ʒ100体积比将过夜培养物转移至200mL新鲜培养基中，培养2 4h，待OD600值达0.6时，加入IPTG（终浓度为0.1mM），30ħ诱导培养8h。
4000r/min离心30min收集菌体，用10mL裂解缓冲液重悬菌体。
冰浴中超声破碎，13000r/min离心30min，取上清保存备用。
1．2．4Ni-NTA亲和层析柱分离纯化蛋白质用10倍体积的H2O和10倍体积的裂解缓冲液依次平衡Ni-NTA树脂。
取10mL超声波上清液上样，待流尽后加入15mL漂洗缓冲液漂洗杂蛋白，最后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，用EP管分步收集。
SDS-PAGE电泳检测。
2实验结果2．1重组质粒pBlue-p450nor的构建和鉴定。
2．1．1细胞色素P450nor的克隆以pRSET－p450nor为模板，PCR扩增细胞色素P450nor基因。
PCR产物检测结果见图1。
图1PCR产物电泳图Fig1Product of PCR1：PCR产物；2：Marker图2pBlue－p450nor的酶切鉴定Fig2Analysis of pBlue-p450nor1：Marker；2：pBlue－p450nor；3：BamHⅠ/HindⅢ双酶切pBlue－p450nor；4：HindⅢ单酶切pBlue－p450nor2．1．2重组质粒pBlue-p450nor的构建和鉴定限制性内切酶Bam HⅠ/Hin dⅢ双酶消化回收的PCR产物，将p450nor基因片段克隆到载体pBluescript构建成重组克隆载体pBlue-p450nor。
构建的重组质粒pBlue-p450nor转化大肠杆菌TG1，用Amp平板筛选阳性克隆，提取重组质粒DNA。
用Bam HⅠ/Hin dⅢ双酶消化重组pBlue-p450nor，有一外源片段放出，且大小与p450nor基因相等，约1．3kb。
证明重组质粒pBlue-p450nor构建成功（见图2）。
图3pET－p450nor的酶切鉴定Fig3Analysis of pET-p450nor1：pET－p450nor；2：BamHⅠ/HindⅢ双酶切pET－p450nor；3：HindⅢ单酶切鉴定pET－p450nor；4：Marker图4P450nor蛋白的SDS－PAGE分析Fig4Analysis of pET-p450nor by SDS PAGE1：BL21；2：E．coli pET－p450nor IPTG未诱导；3：E．coli pET－p450nor IPTG诱导2h；4：E．coli pET－p450nor IPTG诱导4h；5：E．coli pET－p450nor IPTG诱导6h；6：E．coli pET－p450nor IPTG诱导8h；7：Marker62．2重组表达质粒pET-p450nor 的构建和鉴定限制性内切酶Bam H Ⅰ/Hin d Ⅲ双酶消化pBlue-p450nor ，回收P450nor 基因片段，将P450nor 基因片段亚克隆到表达载体pET-28，构建重组表达载体pET-p450nor 。
