第３ １卷，第２期 光谱学与光谱分析Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．２，ｐｐ５４７－５５０２ ０ １ １年２月 Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｆｅｂｒｕａｒｙ，２０１１ 油橄榄叶中总黄酮含量测定方法探讨郑媛媛１，２，李 辰２，３，封士兰１，黄新异２，刘永峰２，４，陈小芬２，４，邸多隆１，２＊１．兰州大学药学院，甘肃兰州 ７３００００ ２．中国科学院兰州化学物理研究所，中国科学院西北特色植物资源化学 重点实验室和甘肃省天然药物重点实验室，甘肃兰州 ７３００００３．五邑大学应用物理与材料学院分析测试中心，广东江门 ５２９０２０４．中国科学院研究生院，北京 １０００４９摘 要 建立以芦丁为对照品的油橄榄叶中总黄酮含量的测定方法。
采用Ａｌ（ＮＯ３）３－ＮａＮＯ２－ＮａＯＨ和ＡｌＣｌ３两种显色法测定油橄榄叶中总黄酮的含量，并分别考察了两种方法对测定结果的影响。
结果表明，ＡｌＣｌ３显色法适宜于油橄榄叶总黄酮的含量测定。
该法操作简便，线性关系良好，准确度、重复性和稳定性较好，可用于油橄榄叶总黄酮含量测定，并为中药和天然产物中总黄酮的含量测定提供参考。
关键词 油橄榄叶；总黄酮；紫外－可见分光光度法；ＡｌＣｌ３显色法中图分类号：Ｏ６５７．３ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０．３９６４／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－０５９３（２０１１）０２－０５４７－０４ 收稿日期：２０１０－０５－１０，修订日期：２０１０－０８－２０ 基金项目：中国科学院“百人计划”项目和中国科学院“科技支甘”项目资助 作者简介：郑媛媛，女，１９８６年生，兰州大学药学院在读硕士研究生 ｅ－ｍａｉｌ：ｈｎ＿ｚｙｙ＠１６３．ｃｏｍ＊通讯联系人 ｅ－ｍａｉｌ：ｄｉｄｌ＠ｌｉｃｐ．ｃａｓ．ｃｎ引 言 油橄榄（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｒｅ Ｌ．）为木犀科（Ｏｌｅａｃｅａｅ）木樨榄属（Ｏｌｅａ）植物，主要分布在欧洲地中海沿岸国家和美国加州地区。
自６０年代起，油橄榄开始在我国引种，甘肃陇南市是我国油橄榄最大的种植基地之一［１，２］。
现代药理学研究表明，油橄榄叶提取物具有抗氧化、抗真菌、降血压、降血脂等活性［３，４］。
油橄榄叶中的化学成分包括裂环烯醚萜类、黄酮类、游离醇、甾醇、烷烃类及挥发性成分等。
其中，裂环烯醚萜类和黄酮类是其主要有效成分。
油橄榄叶所含裂环烯醚萜类主要是橄榄苦苷。
黄酮类化合物主要有木犀草苷、芹菜苷、槲皮素、芦丁、山奈酚等［１，５］。
油橄榄叶中黄酮类化合物含量丰富，其药理活性主要表现在抗氧化及清除自由基作用，对心血管系统的作用，抗肿瘤、抗癌作用，对平滑肌的作用，抗炎、抗菌、抗病毒作用，雌激素作用，对中枢神经系统的作用，降血糖作用，镇痛止泻、防治溃疡的作用。
此外，还可作为功能食品添加剂、天然抗氧化剂食用［６］。
目前，总黄酮的含量测定方法主要有分光光度法、薄层色谱扫描法、高效液相色谱法、超临界流体色谱法和毛细管电泳法等几种主要的方法［７，８］。
其中，高效液相色谱法和毛细管电泳法具有较高的准确性和灵敏度，但在测定总黄酮含量时，该方法需要较多的黄酮化合物对照品［９］。
薄层色谱扫描法和超临界流体色谱法存在灵敏度低，重现性差的缺点，也需要较多的黄酮化合物对照品。
紫外分光光度法是测定天然产物中总黄酮最常用的方法之一，具有仪器廉价、操作简便，检测成本低等优点，不需要总黄酮中各黄酮化合物对照品，在分析工作中无需对总黄酮中各黄酮化合物同时定性定量，因此得到广泛应用。
但由于中药和天然药物提取物成分复杂，在应用紫外分光光度法测定含量时很难避免基质对测定结果的干扰。
本文针对油橄榄叶中的总黄酮，选用紫外分光光度法在不同显色体系中进行含量测定，探讨干扰测定的主要基质因素，以期为中药或天然产物复杂基质中总黄酮含量测定方法提供参考。
１ 仪器、试剂与材料 Ｔ６新世纪紫外－可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），ＲＥ－５２Ｃ型旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司），ＢＴ ２２４Ｓ型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。
芦丁对照品（批号为１０００８１－２００７０７）购于中国药品生物制品检定所。
橄榄苦苷对照品为本实验室自制：油橄榄叶乙酸乙酯部位提取物，以氯仿－甲醇（９：１，φ）为洗脱液经硅胶柱色谱反复分离重结晶得到化合物，经１ Ｈ ＮＭＲ和１３ Ｃ－ＮＭＲ确定化合物为橄榄苦苷，并由ＨＰＬＣ－ＤＡＤ法－面积归一化法测得其含量大于９５％。
油橄榄叶（干燥品）采于甘肃省陇南市。
Ａｌ（ＮＯ３）３，ＮａＮＯ２，ＮａＯＨ和ＡｌＣｌ３为分析纯，实验用乙醇为工业纯，实验用水为蒸馏水。
２ 实验部分２．１ 溶液制备２．１．１ 对照品溶液精密称取芦丁对照品１９．７ｍｇ，用６０％乙醇定容于５０ｍＬ容量瓶中，即得芦丁对照品储备液（０．３９４ｍｇ·ｍＬ－１）。
精密量取５ｍＬ芦丁对照品储备液，置于２５ｍＬ容量瓶中，用６０％乙醇稀释定容，即得芦丁对照品溶液Ⅰ（０．０７８ ８ｍｇ·ｍＬ－１）。
精密量取２５ｍＬ芦丁对照品储备液，置于５０ｍＬ容量瓶中，用６０％乙醇定容，即得芦丁对照品溶液Ⅱ（０．１９７ｍｇ·ｍＬ－１）。
精密称取橄榄苦苷对照品１０．１ｍｇ，用６０％乙醇定容于２５ｍＬ容量瓶中，得橄榄苦苷对照品溶液Ⅲ（０．４０４ｍｇ·ｍＬ－１）。
２．１．２ 供试品溶液准确称取２０．０ｇ油橄榄叶，置于２５０ｍＬ圆底烧瓶，加入１２倍（ρ）的８０％乙醇溶液，加热回流提取２ｈ，过滤，残渣中再加入１０倍体积（ρ）的８０％乙醇，加热回流提取２ｈ，过滤。
合并两次滤液，回收乙醇，浓缩液用蒸馏水定容至２５０ｍＬ。
静置沉降２４ｈ，精密量取上清液１０ｍＬ，用６０％乙醇定容至１００ｍＬ，即得样品溶液。
２．１．３ 显色剂准确称取适量的Ａｌ（ＮＯ３）３，ＮａＮＯ２，ＮａＯＨ、ＡｌＣｌ３，用蒸馏水定容至适当体积，使溶液浓度分别为１０％Ａｌ（ＮＯ３）３，５％ＮａＮＯ２，４％ＮａＯＨ和１％ＡｌＣｌ３。
２．２ 测定方法２．２．１ Ａｌ（ＮＯ３）３－ＮａＮＯ２－ＮａＯＨ显色法分别精密量取对照品溶液Ⅱ、对照品溶液Ⅲ和供试品溶液各１．０ｍＬ，置于２５ｍＬ容量瓶中，以３０％乙醇补足至６．０ｍＬ，加入５％的ＮａＮＯ２和１０％的Ａｌ（ＮＯ３）３溶液各１ｍＬ，加入４％的ＮａＯＨ溶液１０ｍＬ，摇匀放置５ｍｉｎ，以３０％乙醇定容，于５１０ｎｍ下测定。
２．２．２ ＡｌＣｌ３显色法分别精密量取对照品溶液Ⅰ、对照品溶液Ⅲ和供试品溶液各１．０ｍＬ，置于１０ｍＬ容量瓶中，以３０％乙醇补足至５．０ｍＬ，摇匀，再加入４ｍＬ １％的ＡｌＣｌ３溶液，用３０％乙醇定容，摇匀放置１０ｍｉｎ后，于４１５ｎｍ下测定。
２．３ 标准曲线的绘制２．３．１ Ａｌ（ＮＯ３）３－ＮａＮＯ２－ＮａＯＨ显色法分别精密量取芦丁对照品溶液Ⅱ１．０，２．０，３．０，４．０，５．０和６．０ｍＬ，置于２５ｍＬ容量瓶中，用３０％乙醇补足至６．０ｍＬ，按照２．２．１节操作，并在５１０ｎｍ下测定吸光度，以芦丁对照品溶液浓度（ｘ，ｍｇ·ｍＬ－１）为横坐标，吸光度（ｙ）为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程、相关系数分别ｙ＝８．３５５ｘ＋０．０３６９，Ｒ２＝０．９９３ ９，ｎ＝６。
由此可知，芦丁对照品溶液在０．００７ ８８－０．０４７ ３ｍｇ·ｍＬ－１的浓度范围内呈现良好的线性关系。
２．３．２ ＡｌＣｌ３显色法分别精密量取芦丁对照品溶液Ⅰ０．０，１．０，２．０，３．０，４．０和５．０ｍＬ，分别加３０％乙醇至５ｍＬ，按照２．２．２节操作，并在４１５ｎｍ处测定吸光度。
以芦丁对照品溶液浓度（ｘ，ｍｇ·ｍＬ－１）为横坐标，吸光度（ｙ）为纵坐标进行线性回归，得线性回归方程、相关系数分别为ｙ＝３２．９９５ｘ＋０．０３０ ８，Ｒ２＝０．９９９ ０，ｎ＝５。
由此可知：芦丁对照品溶液在０．００７ ８８－０．０３９ ４ｍｇ·ｍＬ－１的浓度范围内呈现良好的线性关系。
３ 结果与讨论３．１ 供试品中总黄酮含量测定精密量取供试品溶液０．５ｍＬ，按照２．２．１节操作，测定其吸光度，根据回归方程计算出样品溶液中总黄酮含量为２８．６％。
精密量取供试品溶液１．０ｍＬ，按照２．２．２节测定样品溶液的吸光度，经回归方程计算出样品溶液中的总黄酮含量为１．６０％。
３．２ 主要影响因素３．２．１ Ａｌ（ＮＯ３）３－ＮａＮＯ２－ＮａＯＨ显色法分别精密量取对照品溶液Ⅱ、对照品溶液Ⅲ各１．０ｍＬ，按照２．２．１节操作显色后，在２００～６００ｎｍ波长范围内进行扫描，图谱见图１。
Ｃｙｒｉｌ等［１０］以ＨＰＬＣ法测定了１４个不同品种油橄榄叶中的多酚化合物，发现油橄榄叶提取物中橄榄苦苷含量较芦丁、芹菜素、木犀草素等黄酮化合物更高，约为生药含量的９％～１３％。
该方法测定总黄酮的最大波长为５１０ｎｍ，然而，由图可知，在此波长下橄榄苦苷亦有吸收，而且橄榄苦苷含量较黄酮高出５倍以上。
Ａｌ（ＮＯ３）３－ＮａＮＯ２－ＮａＯＨ络合显色法原理是：在碱性条件下，络合反应发生在黄酮醇类成分邻位无取代的邻二酚羟基部位。
分析其结构发现，橄榄苦苷和黄酮化合物一样，具有邻位无取代的邻二酚羟基，故选用该方法在５１０ｎｍ下测定总黄酮时，橄榄苦苷对测定结果有很大影响。
Ｆｉｇ．１ Ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ａｌ（ＮＯ３）３－ＮａＮＯ２－ＮａＯＨ ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ８４５光谱学与光谱分析 第３１卷３．２．２ ＡｌＣｌ３显色法分别精密量取对照品溶液Ⅰ和对照品溶液Ⅲ１．０ｍＬ，按２．２．２节方法显色后，在２００～６００ｎｍ波长范围内进行扫描得图谱２。
在酸性环境下，黄酮醇母核中５位—ＯＨ、４位Ｃ Ｏ与Ａｌ ３＋络合产生的络合物，在４００ｎｍ左右有最大吸收，且这个反应具有专属性［１１］。
利用这一特性，结合橄榄苦苷和黄酮分子结构的差别，比较橄榄苦苷和总黄酮与ＡｌＣｌ３的显色区别。
结果发现，总黄酮在２１０，２７２，４１５ｎｍ有最大吸收，而橄榄苦苷在４１５ｎｍ下没有吸收，故选用４１５ｎｍ为该方法测定波长，可有效避免橄榄苦苷对测定的干扰。
Ｆｉｇ．２ Ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｍ ｏｆ ＡｌＣｌ３ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ３．３ 方法学考察由于ＡｌＣｌ３显色法测定结果较Ａｌ（ＮＯ３）３－ＮａＮＯ２－ＮａＯＨ显色法测定结果准确，对ＡｌＣｌ３显色法在线性关系良好的基础上进一步进行方法学考察。
３．３．１ 稳定性精密量取供试品溶液１ｍＬ，用６０％乙醇定容至１０ｍＬ，混匀之后移取１ｍＬ溶液，按２．２．２项下显色方法在４１５ｎｍ下进行时间扫描，测定其吸光度稳定性。
结果表明，该方法在９０ｍｉｎ内稳定性良好，吸光值的相对标准偏差（ＲＳＤ％）为１．０３％。
３．３．２ 精密度精密量取供试品溶液１ｍＬ，用６０％乙醇定容至１０ｍＬ，混匀之后分别移取１ｍＬ溶液５份，按照２．２．２项下显色方法在４１５ｎｍ下测定吸光度，测得样品溶液中总黄酮的平均含量为１．５９％，相对标准偏差（ＲＳＤ％）为１．５４％（ｎ＝５）。
