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Real-time PCR方法检测肉品中的沙门氏菌方平;杨永莉;杨宝;王晓闻【摘要】应用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到沙门氏菌fimI基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,通过熔解曲线可知其熔点值约为85.6 ℃,而对其他非沙门氏菌则检测不到荧光信号.建立了一种肉品中的沙门氏菌Real-time PCR检测方法,用该方法检测市售牛肉、香肠中的沙门氏菌,其检测灵敏度分别为13,12 cfu/25 g,从样品的处理到得出检验结果可以在10 h内完成.该检测方法具有简便、快速、特异性强、敏感度高等特点.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2010(038)008【总页数】6页(P71-76)【关键词】沙门氏菌;Real-time PCR;快速检测;肉品【作者】方平;杨永莉;杨宝;王晓闻【作者单位】山西农业大学食品科学与工程学院,山西,太谷,030801;山西农业大学食品科学与工程学院,山西,太谷,030801;山西农业大学食品科学与工程学院,山西,太谷,030801;山西农业大学食品科学与工程学院,山西,太谷,030801【正文语种】中文【中图分类】TS207.4在我国，沙门氏菌污染引起的食物中毒占食源性疾病中细菌食物中毒病例的70%～80%[1]，且WHO已将沙门氏菌列入具有严重为害和中等为害的食物传播性病原[2]。
而沙门氏菌常规检测方法和普通PCR方法的灵敏度及检测所需要的时间还有待于进一步提高。
本研究用普通PCR方法检测引物对沙门氏菌的特异性，并用SYBR Green I作为荧光染料，拟用Real-time PCR方法检测熟制牛肉和香肠中沙门氏菌，以建立一种检测肉品中沙门氏菌速度快、灵敏度高的方法。
1 材料和方法1.1 主要材料与试剂试验样品：熟制牛肉（市售）、香肠（市售）。
试验菌株：沙门氏菌和非沙门氏菌标准菌株各10株（表1）。
SYBR Green I，dNTP，buffer，Taq 酶等均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA Ladder购自天根生物（北京）有限公司。
分析检测等温扩增荧光技术快速检测沙门氏菌的研究梁振瑞，张 薇，许绍坤，李鲜鲜，冯 红，自武全（云南瑞栢泰生物科技有限公司，云南昆明 650000）摘 要：本文研究并建立等温扩增荧光技术快速检测沙门氏菌的方法。
通过对沙门氏菌的SSAQ基因序列保守区设计引物，采用最佳引物组搭配其他配套试剂建立一种针对沙门氏菌的等温扩增荧光技术快速检测方法；采用直扩法提取DNA，通过等温扩增荧光技术与常规PCR法对不同浓度沙门氏菌进行扩增检测，检测最低检测限，对其灵敏度进行评价。
结果表明，所建立的针对沙门氏菌等温扩增荧光检测的方法与常规PCR法相比，等温扩增荧光检测的方法灵敏度更高，且根据干扰实验结果可知该方法对沙门氏菌具有良好的特异性，所建立的针对沙门氏菌的等温扩增荧光技术检测方法具有操作快捷、简便、反应时间较短、良好的特异性和较高的灵敏度的特点，能够用于沙门氏菌的快速检测。
关键词：等温扩增荧光技术；沙门氏菌；特异性；灵敏度Research on Rapid Detection of Salmonella by Isothermal Fluorescence Amplification TechnologyLIANG Zhenrui, ZHANG Wei, XU Shaokun, LI Xianxian, FENG Hong, ZI Wuquan(Yunnan Rare Biotechnology Co., Ltd., Kunming 650000, China)Abstract: A method for rapid detection of Salmonella by isothermal amplification fluorescence was developed. By designing primers for the conserved region of SSAQ gene sequence of Salmonella, an isothermal amplification fluorescence method for rapid detection of Salmonella was established by combining the best primers with other supporting reagents. The direct expansion method was used to extract DNA, and the isothermal amplification fluorescence technique and conventional PCR method were used to detect Salmonella with different concentrations. The minimum detection limit was detected, and the sensitivity was evaluated. The results showed that the established method for isothermal fluorescence amplification detection of Salmonella is more sensitive than the conventional PCR method, and it has good specificity for Salmonella based on interfering experimental results. The characteristics of this method are fast, simple, short reaction time, good specificity, and high sensitivity. It can be used for rapid detection of Salmonella.Keywords: isothermal fluorescence amplification technology; Salmonella; specificity; sensitivity沙门氏菌是革兰氏阴性菌，属于肠杆菌科，是常见的食源性致病菌，目前已知血清型有2 500个以上[1-3]。
PCR鉴定沙门氏菌血清分型方法的建立与应用赵建梅;李月华;宋传周;赵格;曲志娜【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2018(035)001【摘要】为建立快速有效、经济适用的沙门氏菌血清型鉴定方法,利用PrimerPlex 软件设计畜禽中常见沙门氏菌的菌体(O)抗原和鞭毛抗原(H)的引物,优化引物比例和退火温度等反应条件,建立沙门氏菌血清型鉴定的PCR法,并对46株沙门氏菌分离株进行血清型鉴定,同时与传统玻片凝集法和美国CDC的液相芯片(Luminex-xMAP)法进行比较.优化后获得了O抗原中B、C1、D和E1群的多重PCR引物,以及鞭毛抗原H1相抗原基因(fliC)和H2相抗原基因(fljB)的2对引物;建立了一套基于沙门氏菌O和H抗原的多重PCR血清型鉴定法;PCR法和Luminex-xMAP 法鉴定出7种沙门氏菌血清型,传统玻片凝集法鉴定出6种血清型;PCR法与传统玻片凝集法和Luminex-xMAP鉴定结果的符合率均为95.65%.本研究建立的PCR 沙门氏菌血清型鉴定法简便、快速,预期可在沙门氏菌的血清分型研究中发挥作用.【总页数】5页(P73-77)【作者】赵建梅;李月华;宋传周;赵格;曲志娜【作者单位】中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032;平原县畜牧兽医局王庙镇动检分所,山东德州253100;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛 266032【正文语种】中文【中图分类】S852.61【相关文献】1.复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌方法的建立及初步应用 [J], 贺英;赵萍;储岳峰;高鹏程;张建军;逯忠新2.复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌方法的建立及初步应用 [J], 贺英;赵萍;储岳峰;高鹏程;逯忠新;赵海燕3.福氏志贺菌4av和Yv血清型PCR鉴定方法的建立及应用 [J], 罗霞;王建平;孙强正4.复合PCR鉴定胸膜肺炎放线杆菌方法的建立及初步应用 [J], 李树清;易建平;陈志飞;王巧全;周筱华;罗满林;方怡;陈敏;夏谦5.流行性出血病病毒血清分型RT-PCR方法的建立及应用 [J], 杨振兴;李占鸿;宋子昂;李卓然;朱建波;廖德芳;杨恒因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
3类食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立摘要建立了3类食品中沙门氏菌快速、敏感、特异的PCR快速检测方法。
选取invA基因作为靶序列设计1对引物,在沙门氏菌中能扩增出198 bp的预期片段,而大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的沙门氏菌种特异性。
通过对沙门氏菌标准菌种纯培养液PCR方法灵敏性的检测,发现纯培养的检测极限为72个细菌。
用该方法对3类共计56份食品样品进行检测,检测结果与传统分离鉴定方法完全相符,表明该方法适用于食品中沙门氏菌的快速检测。
关键词食品;沙门氏菌;PCR快速检测方法;建立沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中重要的常见人畜共患病原菌。
该菌广泛分布于自然界,目前全世界已经发现2 523个血清型,我国发现的血清型近300个。
许多血清型的沙门氏菌都能产生毒素,以肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌最为常见[1]。
常见的肉类食品和奶蛋类食品都会被沙门氏菌污染,在世界各地的食物中毒中,沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第2位[2-3]。
有资料显示,我国细菌性食物中毒中70%～80%是由沙门氏菌引起的[4]。
另外,每年出口的食品由于沙门氏菌污染而造成退货或索赔,以及食品加工厂由于沙门氏菌污染,经常导致重大的经济损失。
因此,对食品中致病菌的监测和检验也就越显示其重要性。
为有效地预防和控制疾病的发生,同时满足食品出口业日益发展的需要,建立快速、敏感而又特异的检测沙门氏菌的方法是非常必要的。
随着分子细菌学研究的开展,人们对细菌的毒素、侵袭素与毒力岛等毒力因子的认识不断深入,使细菌检测从表型特征鉴定逐渐向遗传特征的鉴定,而PCR技术是近年来发展起来的一种体外扩增特异性DNA片段的技术,具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点[5-7],因而从20世纪90年代以来开始尝试利用该技术来检测食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌。
PCR检测方法的特异性与灵敏度主要取决于相应检测靶点的选择,本研究选取invA基因作为靶序列设计1对引物,成功地建立了沙门氏菌的PCR快速检测方法。
实时荧光定量PCR技术在食源性致病菌检测中的应用
李敏;綦国红
【期刊名称】《中国食物与营养》
【年(卷),期】2014(020)008
【摘要】实时荧光定量PCR技术作为一种高效的微生物定量检测法,在食品工业中具有广泛的应用前景.本文综述了实时荧光定量PCR技术检测原理,及其在食源性致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌和副溶血性弧菌检测中的应用.
【总页数】5页(P13-17)
【作者】李敏;綦国红
【作者单位】中国药科大学药学院,南京210009;中国药科大学药学院,南京210009
【正文语种】中文
【相关文献】
1.实时荧光定量PCR技术在食源性致病菌检测中的应用 [J], 吕艳芳;马春颖;励建荣
2.实时荧光定量PCR技术在致病菌检测中的应用 [J], 周丽民;雷永良;王小光;叶碧峰;陈秀英
3.PCR技术在快速检测食源性致病菌中的应用 [J], 何维凤
4.食源性致病菌检测中PCR技术的应用 [J], 何军霞;田香红
5.实时荧光定量PCR技术在食源性细菌检测中的应用效果评价 [J], 王寒冰
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基于荧光PCR检验方法对食品中沙门氏菌检验的分析研究作者：孔庆岩胥小荣庞婕王艳英苗育可来源：《食品安全导刊·中旬刊》2021年第09期摘要：目的：针对国家标准中沙门氏菌检验周期比较长的问题，探究利用PCR检测致病菌病源的方法。
方法：利用沙门氏菌特异性片段作为PCR扩增的靶序列，制作相应模板，进行实时荧光PCR扩增，找到最佳方案，选择30份食品采取实时荧光定量PCR检测方式进行检测，同时对同等份数食品运用传统方法的进行检测，随机分为研究组和参照组，对两组食品的食源性致病菌总检出率进行对比。
结果：利用PCR检测沙门氏菌正确率和国家标准相似，检验时效大幅缩短。
结论：利用实时荧光定量PCR技术检测食品中沙门菌，为食源性沙门菌污染的快速检验提供方法学支持。
关键词：食品安全;沙门氏菌;PCR食品安全是当今社会非常关注的话题，而食品安全多是由于食源性致病菌所致，沙门氏菌是近年来食源性致病菌最主要原因之一，所以快速有效的檢测方法有利于减少食品安全的事件的发生。
荧光PCR法检测致病菌病源，以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快和全封闭反应等优点而成为分子生物学研究中的重要工具[1-2]。
传统的食品安全国家标准规定沙门氏菌的检验需要前增菌、二次增菌、平板分离、生化鉴定及血清学分析等步骤，培养时间长，出具实验结果需要至少5 d时间。
其他如以抗原-抗体反应为基础的检测方法，如免疫酶实验、免疫扩散法、乳胶凝集实验、免疫荧光法及酶联免疫吸附试验等，使得沙门菌的检测受到一些限制[3]。
因此，快速、准确、高效的检测方法是大势所趋，对快速及时发现致病菌，控制污染起到积极作用。
目前最成熟的技术就是实时定量PCR检测致病菌病源。
1 材料与方法1.1 材料与试剂检验食品：熟肉制品、糕点和餐饮常见食品等。
沙门氏阳性菌标准菌株：乙型副伤寒沙门氏菌;非沙门菌阳性标准菌株：金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大肠埃希氏菌O157：H7;细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）;旋达R1致病菌生物检测系列“沙门氏菌核酸检验试剂盒”（双螺旋基因公司）。
食品中沙门氏菌LAMP快速检测方法的建立黄金海;孙跃辉;陈瑞;庄世文;刘莹;王静思【摘要】It is important to detect Salmonella in food or food materials in order to assure the food safety. A rapid sensitive loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method assay for the food-borne pathogen Salmonella detection was developed. A set of primers were designed according to the nucleotide sequence of the target invA gene in Salmonella, 7 strains of Salmonella and 4 non--Salmonella bacteria were detected by LAMP, and meanwhile the mode of artificially contaminated food was constructed to evaluate the sensitivity of LAMP assay and bacterial cell counting method. The results showed that all the 7 Salmonella bacterial strains had specific amplification, but the 4 non-Salmonella bacterial strains submitted negative reactions. Sensitivity of LAMP assay for pure cell culture of Salmonella was 336 mL-1. However, an 8.25 g-1 detection limit was obtained for Salmonella artificially contaminated food following a bacterial culture enrichment process, while there was no amplification from the negative control. In conclusion, the LAMP assay developed in the present study is a specific, sensitive, simple and convenient method for the rapid detection of Salmonella in contaminated foods.%食品及其原料中沙门氏茵的快速、现场检测对食品安全控制具有重要意义.根据沙门氏茵invA基因核苷酸序列设计一组引物,应用环介导等温扩增技术(LAMP),分别对7种不同血清型沙门氏茵和4种非沙门氏茵进行扩增,同时建立沙门氏茵人工污染的食品模型,比较了LAMP法与活茵计数检测的敏感性.结果表明,该方法仅对沙门氏菌产生特异性扩增,灵敏度高达336mL-1,食品样品经细菌富集培养后,检测灵敏度高达8.25g-1.所建立的检测沙门氏茵方法具有较高的特异性与灵敏性,操作简单、快速,可用于沙门氏茵污染食品的快速检测.【期刊名称】《天津大学学报》【年(卷),期】2012(045)005【总页数】5页(P468-472)【关键词】沙门氏菌;侵袭性因子A;环介导等温扩增技术【作者】黄金海;孙跃辉;陈瑞;庄世文;刘莹;王静思【作者单位】天津大学化工学院,天津300072;天津大学化工学院,天津300072;华南农业大学动物医学院,广州510642;天津大学化工学院,天津300072;天津大学化工学院,天津300072;天津大学化工学院,天津300072【正文语种】中文【中图分类】R155.5沙门氏菌是肠杆菌科中一大类重要的食源性致病菌，沙门氏菌引起的中毒病例位居世界各地食物中毒的首位．WHO食源性疾病监控计划显示，欧洲每年约有160,000人感染沙门氏菌，大约每 100,000人中有 35人感染[1]，每年用于沙门氏菌的防控和治疗费用高达28亿欧元[2]．在我国，70%～80%细菌性食物中毒事件是由沙门氏菌引起，引起沙门氏菌中毒的食品中，约90%是肉、蛋、奶等畜产品[3]．沙门氏菌感染畜禽后可引发一系列疾病，在动物屠宰过程中，肠道中的致病菌会污染屠宰环境或被带到内脏与体表，成为畜禽肉胴体、畜禽产品污染的重要来源[4-5]．卫生检测要求中，世界各国普遍规定食品中不得检出沙门氏菌．沙门氏菌传统的检测方法大多采用细菌分离、生化鉴定表型方法、基于抗体的免疫学方法等，在快速、敏感与特异性等方面有局限性[6]．PCR法需要昂贵的循环仪，不适于基层快速检测．环介导等温扩增技术(loop-mediate isothermal amplification，LAMP)是一种新颖的核酸扩增技术，它依赖于识别靶 DNA上6个特定区域的4条引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下高效扩增核酸，反应结果可通过肉眼观察，具有高特异性、快速灵敏、操作简单等特点．自 2000年该技术开发以来，LAMP技术在临床疾病的诊断、流行性细菌以及病毒的检测等方面应用广泛[7-9]．笔者针对沙门氏菌侵袭性因子 A基因(invA)设计一套 LAMP引物，对 7种血清型的沙门氏菌进行检测，优化反应条件，验证其特异性和灵敏度，并应用于食品的检测，建立了沙门氏菌检测方法．1 材料与方法1.1 菌株菌株名称及编号见表 1，本实验室分离、鉴定和保存．表1 实验用菌株Tab.1 Bacterial strains used in the experiment菌名中文名菌株Salmonella typhimurium 鼠伤寒沙门氏菌 JS1 Salmonella amsterdam 阿姆斯特丹沙门氏菌 JS2 Salmonella pullorum 鸡白痢沙门氏菌 JS3 Salmonella enteritidis 肠炎沙门氏菌 JS4 Salmonella newport 纽波特沙门氏菌 JS5 Salmonella paratyphi A 甲型副伤寒沙门氏菌 JS6 Salmonella choleraesuis 猪霍乱沙门氏菌 JS7 Staphylococcus aureus 金黄色葡萄球菌PYN1 Streptococcus suis 猪链球菌 SC1 Campylobacter jejuni 空肠弯曲菌CJ22 Escherichia coli 大肠杆菌 ATCC 27,1551.2 主要试剂和仪器细菌基因组 DNA抽提试剂盒(天根生化科技有限公司)，DNA-LAMP扩增试剂盒(荣岩化学株式会社，日本)，LA-320CE实时浊度仪(荣岩化学株式会社，日本)．1.3 方法1.3.1 DNA模板的制备(1) 试剂盒法：按照试剂盒说明书提取细菌基因组DNA．(2) 煮沸法：细菌纯培养物 1,mL于12,000,r/min离心 5,min，加入100,µL 无菌水，混匀后，煮沸10,min，冰浴2,min，12,000,r/min离心5,min，上清液备用．1.3.2 引物设计与合成根据GenBank公布的沙门氏菌 invA基因(登录号：EU348365)中保守序列，设计一套特异性的LAMP引物，包括外引物 F3、B3，2条内引物 FIP、BIP和2条环引物LF、BF．引物由Invitrogen公司合成，引物序列见表2．1.3.3 LAMP反应和结果判定图1 LAMP引物设计示意Fig.1 Schematic representation of LAMP primer design表2 扩增invA基因的LAMP引物序列Tab.2 DNA oligonucleotide primer Sequence of LAMP for the invA gene名称引物序列F3 5’-GAACGTGTCGCGGAAGTC-3’B3 5’-CGGCAATAGCGTCACCTT-3’LF5’-GGCCTTCAAATCGGCATCAAT-3’BF 5’-AAGGGAAAGCCAGCTTTACG-3’FIP 5’-GCGCGGCATCCGCATCAATATCTGGATGGTATGCCCGG-3’BIP 5’-GCGAACGGCGAAGCGTACTGTCGCACCGTCAAAGGAAC-3’反应体系包括反应缓冲液12.5,µL，Bst DNA 聚合酶1.0,µL，DNA 模板2.0,µL，外引物 F3、B3 各5,pmol，内引物 FIP、BIP 各 40,pmol，环引物 LF、BF各20,pmol，最后加入去离子水至总体积为25,µL．混匀后，置于LA-320CE浊度仪，于63,℃温浴60,min，80,℃灭活 2,min．反应过程中，LA-320CE浊度仪对反应体系的浊度进行实时测量，每 6,s检测一次体系在 650,nm处的吸光度，生成浊度变化曲线，当反应体系浊度超过0.25以及浊度的变化速率大于0.1时，结果判定为阳性．也可通过肉眼观察反应体系的浊度变化判定结果．1.3.4 特异性实验用建立的 LAMP方法，分别对 7种不同血清型的沙门氏实验菌株进行检测，同时以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪链球菌和空肠弯曲菌作对照，验证方法的特异性．1.3.5 灵敏度试验基因组 DNA检测灵敏度：用试剂盒提取鼠伤寒沙门氏菌(JS1)基因组 DNA并测定其浓度，10倍倍比稀释，DNA 原液至 10-1～10-7(体积分数，下同)，各取2,µL 作为模板进行LAMP反应．细菌纯培养物检测灵敏度：将培养过夜的鼠伤寒沙门氏菌(JS1)菌液 10倍倍比稀释至 10-1～10-6，取各稀释度菌液100,µL 进行平板菌落计数，每组设 3个重复．同时，取各稀释菌液 1,mL，用煮沸法提取DNA，取2,µL上清液作为模板进行 LAMP扩增，利用LA-320CE对扩增结果进行实时检测．1.3.6 食品样品检测取细菌培养、常规 PCR沙门氏菌检测阴性的猪肉 10,g，无菌操作置于匀浆机并加入 90,mL 缓冲蛋白胨水(BP)，制备1∶10稀释的均质液备用．取10,mL猪肉匀浆液，接入已知浓度的鼠伤寒沙门氏菌标准菌株(JS1)，混匀后作为食品样品原样，之后以匀浆液为稀释液10倍倍比稀释，37,℃培养12,h后，各取1,mL用煮沸法提取DNA，进行LAMP扩增．2 结果2.1 沙门氏菌LAMP检测方法的建立以设计的一套特异性引物对沙门氏菌标准菌株(JS1)基因组DNA进行LAMP扩增，检测结果见图2．由图 2(a)可知，以沙门氏菌标准菌株(JS1)基因组DNA 为模板的扩增通道，吸光度大于 0.5，判断为阳性，而以水为阴性对照的通道未出现扩增；由图2,(b)判定曲线可知，当扩增反应进行到 16,min左右时，通道1浊度的变化速率为0.104，判为阳性．结果表明该引物能够有效地扩增沙门氏菌 invA基因，检测时间约为16,min．图2 沙门氏菌标准菌株LAMP检测结果Fig.2 LAMP results of Salmonella standard strain2.2 特异性实验特异性实验结果如图3所示，仅7株沙门氏菌出现LAMP扩增，检测结果为阳性，其他4种菌均无扩增值，检测结果为阴性，表明该引物特异性强．图3 沙门氏菌LAMP特异性实验结果Fig.3 Specificity of Salmonella LAMP assay2.3 灵敏度实验2.3.1 基因组DNA检测灵敏度沙门氏菌标准菌株(JS1)基因组 DNA浓度为45,ng/µL．10倍倍比稀释DNA原液进行LAMP检测，结果显示基因组DNA检测限约为900,fg，见图4．图4 沙门氏菌基因DNA LAMP检测灵敏度Fig.4 Sensitivity of Salmonella genomic DNA LAMP assay2.3.2 细菌培养物检测灵敏度经平板计数，原始菌液浓度为3.36×106,mL-1.10倍倍比稀释菌液进行 LAMP检测，结果该法细菌纯培养物检测限约为3.36×106,mL-1，见图5．2.3.3 食品样品中沙门氏菌的检测采用无菌的猪肉匀浆构建食品样品模型，加入已知浓度的沙门氏菌培养液，构建人工感染的食品原样模型，使得食品原样模型中沙门氏菌浓度为8.25×103,mL-1，亦即模拟食品原样中沙门氏菌的浓度为8.25×104,g-1．通道 1为猪肉匀浆中加入已知浓度沙门氏菌培养液作为食品原样，通道2～通道5分别为食品原样的 10倍梯度稀释，作为食品样品，提取DNA进行 LAMP检测，通道 8为无菌的猪肉匀浆．结果见图 6，通道 1～4均出现明显的扩增，通道5和通道8无扩增，结果表明该法直接检测食品样品的检测限为8.25,g-1．图5 沙门氏菌细菌培养物LAMP检测灵敏度Fig.5 Sensitivity of Salmonella LAMP assay图6 模拟食品样品中沙门氏菌LAMP检测灵敏度Fig.6 Sensitivity of Salmonella LAMP assay in artificially contaminated food3 讨论沙门氏菌是一种人畜共患的病原菌，能引起人和动物多重共患病，而食源性沙门氏菌污染检测主要还是传统的培养法，费时费力，不利于在沙门氏菌暴发流行时准确、快速地确定传染源和传染途径，控制其流行．PCR方法敏感、准确、快速，目前已广泛用于食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌的检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层应用．LAMP依赖于能识别靶DNA上6个特定区域的4条引物和具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下高效扩增核酸，保证了扩增的高特异性和高效性，在反应过程中核酸大量合成，从dNTPs析出的焦磷酸根离子与反应体系中的镁离子结合，产生扩增反应副产物-焦磷酸镁白色沉淀，反应体系浊度发生变化，肉眼可见[10]，不需要昂贵的仪器，只需要一个恒温的水浴即可实现检测，操作简单，便于现场快速检测和基层应用．也可以通过 LA-320CE实时浊度仪进行实时反应及终产物的一步检测．引物设计对于建立 LAMP方法非常重要，是检测沙门氏菌成功与否的关键．用来设计引物的基因主要分 3类，即属特异性引物基因、血清群特异性引物基因与血清型特异性引物基因．沙门氏菌的inv基因族具有属特异性，inv基因族包括 invA、invB、invC、invD和invE等一组系列基因，它们在沙门氏菌中广泛分布，而invA基因编码的蛋白在细菌的致病过程中起着重要的作用[6,11]．对沙门氏菌invA 基因序列分析表明，沙门氏菌属的不同沙门氏菌菌株的invA基因核苷酸序列存在较高的同源性，BLAST检索与其他生物无同源关系，因此，invA基因是沙门氏菌的主要特征区域，常作为基因检测和鉴定的依据[12]．本研究选择与食品安全和公共卫生密切相关的肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌等为研究对象，选择 invA基因设计引物，对 7种不同血清型的沙门氏菌都能有效扩增，而非沙门氏菌不扩增，说明设计的引物对具有沙门氏菌属特异性，可用于沙门氏菌的检测．与沙门氏菌培养物相比，食品中沙门氏菌的检测具有更大的难度．直接用 LAMP检测食品中的沙门氏菌面临的一个问题是不能将活菌和死菌区别开来．由于检测的灵敏性高，即使是样品中存在死亡沙门氏菌的 DNA也会产生阳性结果，但死亡沙门氏菌的存在对食品安全并不构成威胁，所以建立能够区分死菌和活菌的方法对沙门氏菌检测较为重要．为此，在LAMP检测之前，需要选择性增菌，以减少来自样品中死亡沙门氏菌的 DNA的影响，从而增加了检测方法对样品生物安全评估的可信度，同时也提高了食品中沙门氏菌的检出率．应用建立的LAMP方法，液体样品中沙门氏菌检出下限为 336,mL-1，而常规PCR 的检出线一般在 103～105,mL-1活菌水平[13]．应用建立的LAMP方法，经增菌培养程序后，可检出含菌量为8.25,g-1的阳性肉品．应用LAMP方法对沙门氏菌进行检测，从检测结果来看，方法特异、敏感，可有效检测样品中的沙门氏菌；检验周期短，每一批样品从样品准备到检出只需要2,h，如果将增菌时间计算在内，也仅需要15,h；操作简单，检测成本低，不需要昂贵的检测设备，检测结果肉眼可见，可适应国境口岸方便快捷的需要，在基层检测中易于推广，具有较高的实用价值．4 结语应用所建立的 LAMP方法检测沙门氏菌 invA基因，在检出时间、灵敏度方面优于其他血清学及PCR方法，通过富集增殖后进一步提高了灵敏度和检出率，降低了复杂食品原料对检出率的影响，LAMP方法还可通过眼观进行判定，适用于基础应用．沙门氏菌 invA基因检测的 LAMP方法，可作为动物沙门氏菌感染、进出口检疫、食品及其原料中沙门氏菌污染快速检测及其安全性评价的手段．【相关文献】［1］ Anonymous. The community summary report on trends and sources of zoonoses，zoonotic agents，antimicrobial resistance and foodborne outbreaks in the European Union in 2006[J]. The EFSA Journal，2006，130：1-352.［2］ Byrne D. Zoonoses：Commissioner David Byrne welcomes new legislation to combat food-borne diseases such as Salmonella(IP/03/1306)[R]. European Commission，2003.［3］曾晓芳. 畜产品中沙门氏菌污染的检测与控制[J]. 四川畜牧兽医，2003，30(4)：28-29.Zeng Xiaofang. Inspection and control of Salmonella pollution in domestic animal products[J]. Sichuan Animal and Veterinary Sciences，2003，30(4)：28-29(in Chinese). ［4］ Nowak B，von Müffling T，Chaunchom S，et al. Salmonella contamination in pigs at slaughter and on the farm：A field study using an antibody ELISA test and a PCR technique [J]. International Journal of Food Microbiology. 2007，115(3)：259-267. ［5］ McGuinness S，McCabe Evonne，O’Regan Edel，et al.Development and validation of a rapid real-time PCR based method for the specific detection of Salmonella on fresh meat [J]. 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Detection of loop-mediate isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation[J]. Biochem Biophys Res Commun，2001，289(1)：150-154.［11］Bülte M，Jakob P. The use of a PCR-generated invA probe for the detection of Salmonella spp. in artificially and naturally contaminated foods [J]. International Journal of Food Microbiology，1995，26(3)：335-344.［12］陈金顶，索青利，廖明，等. 沙门氏菌的invA基因序列分析和分子检测[J]. 中国人畜共患病杂志，2004，20(10)：868-871.Chen Jinding，Suo Qingli，Liao Ming，et al. DNA sequence analysis and molecular detection of invA gene from Salmonella spp.[J]. Chinese Journal of Zoonoses，2004，20(10)：868-871(in Chinese).［13］ Masashi Okamura，Yousuke Ohba，Shuichi Kikuchi，et al. Loop-mediated isothermal amplification for the rapid，sensitive，and specific detection of the O9 group of Salmonella in chickens[J]. Veterinary Microbiology，2008，132(1/2)：197-204.。
沙门氏致病菌标准阳性模板的构建及实时荧光定量聚合酶链式反应检测陈晨;邵彪;陈刚;黄伟东【摘要】Objective: To construct recombinant plasmids for use as standard positive template and establish a real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) assay for determining pathogenicSalmonellaspp. in foods. Methods: Primers and Taqman probe were designed and synthesized with the specific fragment of InvA gene as the target sequence. Recombinant plasmids were constructed by inserting the target gene into PGM-T carriers. Real-time fluorescent quantitative PCR method was established and its sensitivity, specificity, repeatability and accuracy were investigated. Results: The recombinant plasmids constructed using the specific sequence of pathogenicSalmonella spp. could be used as a standard positive template for fluorescent quantitative PCR. The standard curve wasY=-3.151 lgX+42.86 (R2=0.999), and the sensitivity of the method was 80 copies per reaction. It was specific to detect Salmonellaspp. with good repeatability (the inter-batch and intra-batch coefficients of variation were both less than 5%). Conclusion: The FQ-PCR method allows qualitative and quantitative detection of pathogenicSalmonellaspp.%目的：构建重组质粒作为标准阳性模板，建立食品中沙门氏致病菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法。
沙门氏菌快速检测技术研究进展章伟帆【摘要】Salmonella is the most common pathogenic bacteria in food, which can cause bromatoxism and bring about haz-ard on human. There is a problem of time-consuming on the conventional detection approach, resulting from the various se-rotypes in salmonella. In recent years, a growing of new detection methods emerge in endlessly, particularly those on the molecular biology and immunology with the development of biological technology. This article provides the development and application on the rapid detection of salmonella in food.%沙门氏菌是食品中最常见的致病菌，是导致食物中毒的重要病原菌之一，严重危害人类的健康安全和食品安全。
由于其血清型繁多，传统方法检测起来耗时耗力。
近年来，随着生物学的发展，新的检测技术层出不穷，尤其是分子生物学检测技术和免疫学检测技术。
该文介绍了近年来检测食品中沙门氏菌技术的研究进展以及其应用前景。
【期刊名称】《台湾农业探索》【年(卷),期】2013(000)004【总页数】5页(P66-70)【关键词】致病菌;沙门氏菌;快速检测【作者】章伟帆【作者单位】泉州市产品质量检验所，福建泉州 362000【正文语种】中文【中图分类】TS207.4沙门氏菌是一类革兰氏阴性菌，其广泛分布于自然界，是常见的人畜共患型致病菌。
食品中沙门菌实时荧光PCR快速检测方法的研究徐德顺;胡霞清;纪蕾【期刊名称】《中国预防医学杂志》【年(卷),期】2008(9)10【摘要】目的利用荧光定量PCR技术,建立食品中沙门菌污染的快速敏感特异的检测方法。
方法以沙门菌的fimY基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和Mg^(2+)浓度,以沙门菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性,并初步应用于样品的检测。
结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0.8μmol/L,1.0μmol/L,Mg^(2+)浓度为3 mmol/L时,具有良好的特异性和敏感性。
在10株相关菌株的检测中,除沙门菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性。
在纯菌条件下,定量检测低限33 cfu/ml。
稳定性分析表明:同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均小于5%。
检测样品结果显示实时PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。
结论该方法特异性强,稳定性高,操作简便快捷,适应食品微生物检验发展需要,具有较大的推广及应用价值。
【总页数】4页(P870-873)【关键词】食品;沙门菌;实时荧光PCR【作者】徐德顺;胡霞清;纪蕾【作者单位】湖州市疾病预防控制中心【正文语种】中文【中图分类】R155.5;R563.1【相关文献】1.建立Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法 [J], 荣策;孙铭英;那晗;曹际娟2.动物性食品中沙门菌实时荧光定量 PCR快速检测方法的建立 [J], 李丹丹;徐义刚;王绥家;高慎阳;马广鹏3.食品用塑料包装膜中沙门氏菌实时荧光PCR检测方法的研究 [J], 王莹4.沙门菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立 [J], 田赛; 邱少富; 杜昕颖; 郭卫光; 包仁龙; 向莹; 张浩然; 杨超杰; 谢靖; 刘鸿博; 宋宏彬5.食品沙门氏菌实时荧光PCR快速检测方法建立 [J], 盘宝进;韦梅良;汪文龙;罗兆飞;刘军义;陈立标因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
沙门氏菌PCR诊断试剂盒的研制及初步应用
张嘉宁;臧富妍
【期刊名称】《中国兽医科技》
【年(卷),期】1999(029)010
【摘要】采用酚提取法和裂解法制备聚酶链反应（ＰＣＲ）模板，并制备了ＰＣ
Ｒ诊断试剂盒，用于沙门氏菌。
结果，粪便样品只能采用酚提取法制备模板，而血液样品可采用裂解法，灵敏度高达５个沙门氏菌ＤＮＡ水平，最佳反应时间为变性、退火各４０ｓ，延伸５０ｓ。
用该分水岭工发病和自然发病动物血液、粪便中的沙门氏菌，阳性纺均比２法高，且培养法阳性的样品ＰＣＲ法均为阳性，整个检测过程仅需６－８ｈ。
【总页数】3页(P7-9)
【作者】张嘉宁;臧富妍
【作者单位】解放军第一军医大学实验动物中心;华南农业大学动物医学系
【正文语种】中文
【中图分类】S852.612
【相关文献】
1.沙门氏菌内标PCR快速检测试剂盒的研制与应用 [J], 李小玲;刘斌;但现龙;王大鹏;周敏;史贤明
2.沙门氏菌通用PCR快速检测试剂盒的研制与应用 [J], 孔繁德;陈琼;徐淑菲;彭海
滨
3.副猪嗜血杆菌PCR诊断试剂盒的研制及初步应用 [J], 龚玉梅;佟瑞平;韦莉;徐慧;
孙惠玲;王宏俊;张培君
4.鸡毒支原体PCR诊断试剂盒的研制及应用(摘要) [J], 谢芝勋;邓显文;唐小飞;谢志勤;庞耀珊;廖敏;刘加波;何竞铭
5.安氏隐孢子虫PCR诊断试剂盒的初步应用 [J], 周荣琼;李国清;肖淑敏;李韦华;郭远忠
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实时荧光PCR法检测食品中亚利桑那沙门氏菌王青龙;蔡雪凤;周艳霞;曹悦;张跃川;朱晓龙;巩有博;耿健强;何湘漪【摘要】沙门氏菌(Salmonella)是食品检测过程中最常见的致病菌之一,亚利桑那沙门氏菌(Salmonella adzonae)又是沙门氏菌中比较难鉴定的亚种.该实验通过实时荧光聚合酶链式反应(PCR)方法快速准确的检测亚利桑那沙门氏菌和其他沙门氏菌.根据GenBank公布的亚利桑那沙门氏菌和其他沙门氏菌gudD基因序列,分别设计引物和Taqman探针.使用10株不同血清型的沙门氏菌标准菌株、88株沙门氏菌分离株和29株食品中常见食源性致病菌进行实时荧光PCR特异性实验.结果显示,该实验所设计的引物探针特异性非常好.实时荧光PCR灵敏性试验结果表明,检测灵敏度可达到1～10 CFU/mL的添加浓度.经模拟污染样品验证,所建立的实时荧光PCR方法与传统方法的检测结果相一致,具有检测周期短、操作简便的优势.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2018(037)006【总页数】4页(P179-182)【关键词】沙门氏菌;亚利桑那沙门氏菌;实时荧光PCR【作者】王青龙;蔡雪凤;周艳霞;曹悦;张跃川;朱晓龙;巩有博;耿健强;何湘漪【作者单位】北京市食品安全监控和风险评估中心(北京市食品检验所),北京100094;北京市食品安全监控和风险评估中心(北京市食品检验所),北京100094;北京市食品安全监控和风险评估中心(北京市食品检验所),北京100094;北京市食品安全监控和风险评估中心(北京市食品检验所),北京100094;北京市食品安全监控和风险评估中心(北京市食品检验所),北京100094;北京市食品安全监控和风险评估中心(北京市食品检验所),北京100094;北京市食品安全监控和风险评估中心(北京市食品检验所),北京100094;北京市食品安全监控和风险评估中心(北京市食品检验所),北京100094;北京市食品安全监控和风险评估中心(北京市食品检验所),北京100094【正文语种】中文【中图分类】TS201.3沙门氏菌（Salmonella）是食品检测过程中最常见的食源性致病菌之一，其在世界范围内引起的食物中毒病例也常常排在首位[1-3]。
