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肿瘤细胞培养方法及步骤
一、机械刮除法
1．标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位。
2．刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间。
3．用Hanks液冲清洗一两次，洗除被刮掉的细胞。
4．注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。
二、反复帖壁法
1．待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液。
2．取编号为A、B、C三个培养瓶。
首先把悬液接种入A培养瓶中，置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后，向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养。
3．培养B瓶中细胞5～20分钟后，按处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中，再向B瓶补加完全培养基。
三、消化排除法
1．先是用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养基细胞一次，然后再换成新的混合继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化。
2．把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养，向原瓶内也补加新的培养液继续培养。
用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落，经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。
四、胶原酶消化法
1．可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化。
2．用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。
如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
第6章肿瘤细胞得培养肿瘤细胞培养就是研究癌变机理、抗癌药得敏感性、肿瘤细胞与癌分子生物学特性得重要手段。
癌细胞就是比较容易培养得细胞，当前所建立得细胞系中癌细胞就是最多得。
应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1)可免受机体内环境因素得影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化与生物因素对肿瘤细胞生命活动得影响。
(2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞得结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变得发生机理；(3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性与遗传行为得改变。
(4)可用于快速筛选抗癌药物与研究耐药机理。
(5)研究周期短，比较经济。
但就是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变;体外实验所得得结果不能完全代表体内得情况，应与体内试验结合研究更为合理等。
一、肿瘤细胞培养得生物学特性1、形态与性状形态不规则,细胞界限淸晰，伸展较差,核膜、核仁轮廉明显，核仁多、核浆丰富、折光性强, 电镜观察细胞表而微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不左向运动与铺着不依赖性有关、2、生物特性癌细胞在无血淸或低血淸(2%~ 5 %)时仍能生长,营养要求不奇，因能自分泌促增殖因子, 在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱与密度大，有丰富得三极有丝分裂，分裂指数髙，细胞倍增周期短。
3、永生性永生性也称不死性,在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptos i s ),体外培养得肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。
但体外培养得永生性与体内肿瘤得恶性(包括侵润性) 就是两种性状，受不同基因调控得，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若「代,说明体外培养得永生性可在体外培养后获得得。
另外，体外培养得许多细胞系，如N 1H3T3、Rat -1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。
但两者有相关性，永生性可能就是细胞恶性变得某一阶段。
肿瘤细胞培养肿瘤细胞培养是一种对肿瘤细胞进行体外增殖和研究的重要方法。
它不仅有助于我们更好地理解肿瘤的发生机制，还为肿瘤的诊断和治疗提供了有力的工具。
本文将介绍肿瘤细胞培养的基本原理、方法和应用。
一、肿瘤细胞培养的基本原理肿瘤细胞培养的基本原理是利用体外培养条件模拟体内微环境，提供细胞生长所需的营养物质、培养基和合适的温度、pH值等因素，使肿瘤细胞在培养皿中快速增殖。
培养的肿瘤细胞可以源自原发肿瘤组织、转移灶或肿瘤细胞系，通过适当的培养条件，能够在体外长期维持其生物学特性。
二、肿瘤细胞培养的方法1. 细胞来源选择肿瘤细胞培养的最初步骤是选择合适的细胞来源。
可以从患者的原发肿瘤组织或转移灶中分离细胞，也可以使用已建立的肿瘤细胞系。
选择适宜的细胞来源是确保实验结果准确性的关键。
2. 细胞分离和传代细胞分离是将肿瘤组织或培养皿中的细胞分离出来，常用的方法有胰蛋白酶消化、机械切割等。
分离的细胞可以根据需要进行一定次数的传代，以延长细胞的寿命并获得足够的细胞数量。
3. 细胞培养条件细胞培养条件是保证肿瘤细胞在体外生长和繁殖的关键。
首先是选择适宜的培养基，其中包含维持细胞生长所需的营养物质、生长因子和抗生素等。
此外，还需要控制培养温度、CO2浓度和pH值等条件，模拟体内环境。
4. 细胞检测和鉴定培养的肿瘤细胞需要进行鉴定，以确保其纯度和稳定性。
常用的方法有细胞形态观察、免疫组织化学染色、流式细胞术等。
鉴定后的细胞可以用于进一步的实验研究。
三、肿瘤细胞培养的应用1. 药物筛选和耐药性研究肿瘤细胞培养可以用于药物筛选，通过观察不同药物对细胞的影响，筛选出对某种类型的肿瘤细胞有特异性杀伤作用的药物。
此外，肿瘤细胞培养还可以用于研究耐药性的机制和逆转耐药的方法。
2. 基因功能研究通过转染技术将特定基因靶向敲除或过表达到肿瘤细胞中，可以研究基因在肿瘤发生发展中的功能，并探索潜在的靶向治疗策略。
肿瘤细胞培养为基因功能研究提供了良好的实验材料。
肿瘤细胞培养方法
肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。
在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。
1、取材：
人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。
取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。
癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。
取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜栽过24小时。
2、培养基：
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的RPMII640.DMEM s Mc-Coy等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。
肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。
肿瘤细胞对培养环境适应性较大,是因肿瘤细胞有自泌(Autocrine)性产生促生长物质之故。
但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。
按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子
的需求都存在着差异。
但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。
有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等）。
总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。
一、实训目的本次实训旨在通过实验室操作，深入了解肿瘤细胞的基本特性、培养方法及其与正常细胞的区别，从而加深对肿瘤细胞生物学行为的认识，为后续的肿瘤研究奠定基础。
二、实训内容1. 实训材料与仪器- 材料：肿瘤细胞系（如HeLa细胞）、正常细胞系（如HEK293细胞）、DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶、细胞计数板、显微镜等。
- 仪器：细胞培养箱、超净工作台、细胞培养皿、移液器、离心机等。
2. 实训步骤- 细胞复苏：将冻存的肿瘤细胞和正常细胞分别加入适量DMEM培养基，37℃水浴箱中孵育至细胞恢复活性。
- 细胞传代：将复苏后的细胞以1:3的比例进行传代培养，每隔24小时更换一次培养基。
- 细胞计数：使用细胞计数板对肿瘤细胞和正常细胞进行计数，观察细胞生长情况。
- 细胞形态观察：使用显微镜观察肿瘤细胞和正常细胞的形态差异，如细胞大小、形状、核质比等。
- 细胞培养液检测：检测细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性，评估细胞毒性。
3. 实训结果- 肿瘤细胞和正常细胞均能在DMEM培养基中正常生长，且生长速度较快。
- 肿瘤细胞和正常细胞在显微镜下形态存在明显差异，肿瘤细胞体积较大，核质比较高，细胞形态不规则。
- LDH活性检测结果显示，肿瘤细胞培养液中的LDH活性显著高于正常细胞培养液，表明肿瘤细胞具有一定的细胞毒性。
三、实训分析与讨论1. 肿瘤细胞与正常细胞的区别- 肿瘤细胞具有无限增殖能力、侵袭性和转移性等特点，与正常细胞相比，在形态、生长速度和细胞毒性等方面存在显著差异。
- 本实训中，肿瘤细胞和正常细胞在形态、生长速度和细胞毒性等方面的差异进一步证实了这一观点。
2. 肿瘤细胞培养方法- 肿瘤细胞培养是肿瘤研究的重要手段，通过体外培养肿瘤细胞，可以研究肿瘤细胞的生物学特性、基因表达和信号通路等。
- 本实训中，我们采用了DMEM培养基和胎牛血清进行肿瘤细胞培养，取得了较好的效果。
3. 细胞毒性检测- 细胞毒性检测是评估细胞培养过程中细胞损伤程度的重要方法。
正常和肿瘤组织细胞培养内容正常组织细胞培养上皮细胞的体外培养不同组织细胞和器官的结构和功能、生长特性不同，在血管内皮细胞的体外培养体外培养中所需的分离方法和生长条件也不同。
肾小管上皮细胞的培养巨噬细胞的培养淋巴细胞的培养肿瘤细胞培养上皮细胞的体外培养上皮细胞的基本特征：1.上皮组织的形态结构2.上皮细胞的极性 3 . 上皮细胞间的连接群体依赖性贴壁依赖性细胞-贴壁生长接触抑制生长基质体外培养的上皮组织细胞的生长生物学1. 形态学结构：均质性、透明性很强，结构不明显2. 体外培养上皮组织的生长与增殖特征(1) 体外培养的特殊条件：✧防范微生物污染：根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处的上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。
要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培养等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。
培养中所使用的各种液体，包括细胞保存液、分离液以及培养基等需添加抗生素，抗生素浓度比其它组织培养高。
✧生长基质的支持：皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的贴壁依赖性细胞。
在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基质成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化．使细胞极性表现更为明显。
特殊的培养基✧M199 RPMI1640 DMEM Fam F12（无血清培养基）：M199和RPMI1640培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持其生存，对上皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。
DMEM和HamFl2培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。
可促进上皮细胞的贴附；维持上皮细胞在体外培养状态的分化。
HamFl2培养基的特殊性特别适用原代上皮细胞的培养，培养基成分中添加微量元素的无机离子，更加利于细胞的生长和代谢。
在实际培养时，将DMEM 与HamFl2按一定比例混合用于上皮组织培养。
✧去成纤维细胞：上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。
取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。
由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强的特点，很容易“疯长”为培养物中的优势细胞群，从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为上皮细胞的“细胞污染源”。
因此在上皮细胞的取材、分离、种植和传代的培养过程中，要特别注意上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维细胞的生长。
(2)体外培养上皮细胞的形态学变化体外培养上皮组织细胞的观察与检测1.一般形态学观察2. 组织化学与免疫组织化学观察与检测酶类：碱性磷酸酶、琥珀酸脱氢酶特异性抗原标记物：角蛋白、上皮细胞膜抗原、VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白血管内皮细胞的体外培养人脐静脉内皮细胞的培养1.主要材料：组织来源：婴儿脐带培养用液：M199+20%FCS、D-Hanks、0.1%胶原酶溶液2.培养方法：分离细胞培养法1 ). 将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。
（注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃）2 ). 用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。
3 ). 用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。
4 ). 消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。
5 ).将收集液离心（2000转/分）3分钟，去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置CO2培养箱中培养，两至三天可见细胞长成单层。
肾小管上皮细胞的培养1.原代培养：切取1cm3外层肾皮质、剪碎成1mm3→ 80目研磨冲洗、于100目上收集肾小管节段→0.2%胰蛋白酶消化、调整细胞数→接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶进行培养→每隔3~4天，更换培养液2.传代培养：3.培养结果：3d长出细胞5~7d 进入对数生长期7~9d 融合成单细胞层4.鉴定：抗角蛋白抗体染色（+）巨噬细胞的培养获取巨噬细胞的方法（一）肺泡巨噬细胞：支气管肺泡灌洗法、支气管镜肺泡灌洗法（二）腹腔巨噬细胞：实验动物: 6周龄小鼠、培养液：10%FCS RPMI1640巨噬细胞的纯化1、原理：巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点2、方法：用帖壁法纯化巨噬细胞，用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞淋巴细胞的培养各类淋巴细胞的主要特征T淋巴细胞：表面标志：1.表面受体：TCR、SRBC R、Fc R、MR、Measles viruse R2. 表面抗原：MHC、CDB淋巴细胞：1. 表面受体：BCR、FcR、CR、丝裂原受体、EBV R2. 表面抗原：MHC抗原、CD抗原（CD19、20、21、23、45）血淋巴细胞的分离（一）单个核细胞的分离密度梯度离心法：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
（二）纯淋巴细胞的制备 1. 玻璃黏附法 2. 羰基铁粉法（三）T、B淋巴细胞的分离 1. T细胞花环沉降法 2. 尼龙毛柱分离法血淋巴细胞的体外外培养应用：①淋巴细胞转化试验②B细胞产生Ig的检查③T细胞介导的细胞毒试验④NK细胞毒性试验⑤K细胞毒性试验⑥LAK细胞的制备⑦TIL细胞的制备⑧淋巴细胞的体外长期培养1. 用IL-2建立T淋巴细胞克隆2. 用EB病毒转化B淋巴细胞3. 用B细胞生长因子建立B淋巴细胞株肿瘤细胞体外培养肿瘤细胞在体外的生长生物学特性㈠形态和性状培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。
电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。
㈡生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。
正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。
已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。
正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。
癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。
另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。
㈢肿瘤细胞永生性永生性也称不死性。
在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（四）浸润性（五）异质性（六）细胞遗传（七）肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于：①依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。
一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。
体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性；②肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力；③并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span，只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少；④离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。
肿瘤细胞的培养方法肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。
在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。
肿瘤组织细胞的原代培养取材：人肿瘤细胞来自外科手术、活检瘤组织、胸腹水穿刺、细针头穿刺、内窥镜活检等。
取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。
癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。
关键：新鲜、无菌、及时、准确技术- 分离纯化分离：剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等密度沉降分离纯化：反复贴壁去除成纤维细胞、自然淘汰去除正常细胞、利用特异抗原标志筛选法分亚型、流式细胞仪分选、克隆建株、高转移株的建立：反复接种技术-培养原代培养：去除纤维细胞及淋巴细胞，防止细菌、真菌污染。
传代培养：增殖力低的需要细胞适当密度, 基本长满后传代, 前10代不稳定，注意适当调整培养条件。
技术- 鉴定与建株鉴定：组织来源、形态特征、核型染色体分析、生长特性、对细胞因子的反应（TNF)、集落形成、致瘤实验（裸小鼠）建株：生长半年以上，病理诊断、光镜及电镜观察、生长特征、染色体分析、肿瘤标志、致瘤及转移情况注意：不是每一肿瘤组织都能建株正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。
肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（Autocrine）性产生促生长物质之故。
但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。
成纤维细胞的排除：（肿瘤细胞培养中的关键）1、机械刮除法：2、反复贴壁法：3、消化排除法：4、胶原酶消化法：5、其它方法：体外培养肿瘤细胞生物学检测一旦培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细胞系（或株）后，不论用于实验研究还是建立细胞系，都需要做一系列的细胞生物学测定，主要的目的在于求得证明：1. 所培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞，而非正常细胞或其它细胞；2. 均具有瘤种特异性；3. 阐明一般生物学性状。
测定项目数量无明确规定，根据需要而定，以下为常做的项目和要点。
形态观察：主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。
细胞生长增殖：检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。
细胞核型分析：检测核型特点，染色体数量、标记染色体的有无、带型等。
凝集试验：检测凝集力。
软琼脂培养：检测集落形成能力。
异体动物接种：向异体动物体内（皮下）接种细胞悬液，观察成瘤能力。
其它：除上述项目外，根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析，荧光显微镜观察等。
在上述肿瘤细胞生物学检测中，最主要的为：异体动物（以用裸鼠为上）接种成瘤、软琼脂培养、核型分析、细胞骨架和电镜观察等几项。
当然从分子细胞学角度考虑尚应做癌基因和抑癌基因等的检测。
肿瘤细胞培养的应用一、肿瘤细胞对组织浸润的体外研究二、人恶性肿瘤细胞的动物移植瘤研究三、肿瘤细胞的体外分化实验四、培养肿瘤细胞的凋亡诱导研究五、肿瘤细胞的体外化疗药物敏感性实验。
