细胞培养2006

一、概念组织培养（Tissue Culture）是指从体内取出组织，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。

细胞培养（Cell Culture）采用与组织培养相同的方法，培养物是单个细胞或细胞群。

器官培养（Organ Culture）是指应用和组织培养相似的条件,培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官,使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。

二、体外培养细胞的种类原代培养细胞细胞系克隆细胞株二倍体细胞遗传缺陷细胞肿瘤细胞系或株原代培养细胞是指直接从体内取出的组织细胞所进行的第一次的培养物。

细胞系（Cell Line）是指原代培养物开始第一次传代培养后的细胞。

有限细胞系（Finite Cell Line）：细胞系的生存期有限；无限细胞系（Infinite Cell Line）或连续细胞系：已获得无限繁殖能力能持续生存的细胞系。

克隆细胞株细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系，用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。

亚株（Substrain）：由细胞株进一步分离培养出与原性状不同的细胞群。

二倍体细胞是指细胞群染色体数目具有与原供体二倍体细胞染色体数相同或基本相同的细胞群。

遗传缺陷细胞从有先天遗传缺陷者取材(主要为成纤维细胞)培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞。

肿瘤细胞系或株它是现有细胞系中最多的一类, 我国已建立的细胞系主要为这类细胞。

三、细胞培养的意义可长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动。

便于使用各种不同的技术方法观察和研究细胞。

易于施用物理、化学和生物等因素进行实验研究。

可供研究的细胞种类极其广泛。

可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少,比较经济。

细胞培养的用途生物制品、单克隆抗体和基因工程制品等的生产手段。

广泛应用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学、肿瘤学和分子生物学等多学科研究。

细胞培养的缺点现人工模拟体内环境的技术已经很高,但, 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同。

当细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境中,久了，必然发生变化。

不足之处1.与体内主要不同相对孤立、相对单一缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响2.主要表现失去原有组织结构和细胞形态分化减弱或不显著细胞趋向单一化提示要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。

将体外实验结果推导至体内要慎重。

四、细胞培养与分子生物学的关系培养细胞:携带有与体内细胞同等的全套基因组；能提供无限量DNA；可完成基因表达全过程：DNA→RNA→蛋白质(包括酶) 是分子生物学和基因工程学的理想研究对象。

五、细胞培养的基本设备和器械主要包括：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、普通和低温冰箱、离心机、电子分析天平、水纯化装置、洗刷装置、滤器、微量加样器、液氮罐、培养器皿和原代培养取材用的手术器等。

第一节体外培养细胞的生存条件一、营养二、环境培养环境无毒和无菌, 即无细菌、病毒、支原体、真菌或其它微生物, 是保证培养细胞生存的首要条件。

三、温度人和哺乳动物培养细胞标准温度为36～37℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至死亡。

四、气体气体也是细胞生存的必需条件之一，所需气体主要有O2和CO2。

开放培养（碟皿或培养瓶松瓶盖培养）时,一般要把细胞置于95％空气加5％CO2混合气体环境中。

CO2既是细胞代谢产物,也是细胞所需成分。

其主要作用在于维持培养基的pH值。

五、pH 值多数细胞的适宜pH为7.2～7.4,偏离此范围对细胞可产生有害影响。

六、渗透压大多数细胞，渗透压在260～320 mOsm（毫渗）/kg范围都适宜。

七、附着底物八、废物排出体外培养细胞产生的废物,主要靠换液排出。

适时的换液对体外培养细胞极为重要。

第二节培养用液（一）水配制各种培养用液：必须使用玻璃蒸馏器制备的三次蒸馏水或用超纯水器制备的超纯水，且存放时间不宜过久，一般不要超过两周。

二次蒸馏水或外购的金属蒸馏器制的蒸馏水只能用于清洗器皿。

（二）平衡盐溶液（BSS）定义：平衡盐是主要由无机盐和葡萄糖配制而成、用来保持生理状态渗透压和pH值的溶液。

用途： 1.作为配制合成培养液的基础液；2.洗涤所要培养的组织、细胞等；3.内含少量酚红，可指示酸碱度变化。

桃红色中性，黄色变酸，紫红色变碱（二）平衡盐溶液（BSS）Hanks液和Earle液是配制各种培养液最常用的基础溶液。

Hanks液：含NaHCO3含量较低，缓冲能力较弱，利用空气平衡；Earle液：含高浓度的NaHCO3，缓冲能力较强，需用5%的CO2平衡。

（二）平衡盐溶液（BSS）钙、镁离子是细胞膜的重要组成部分，它们有促进细胞凝聚的作用。

因而配制离散细胞的消化液和洗涤细胞时，宜采用钙、镁离子含量低的Dulbecco液和无钙、镁离子的D-Hanks液，或更为简单的PBS液。

Hanks液配制注意事项配制平衡盐溶液应注意避免钙盐、镁盐及磷酸盐的沉淀。

注意应待前一种试剂完全溶解后，再溶解下一种成分。

（三）pH调整液常用的有NaHCO3液和HEPES液。

NaHCO3液常用浓度为7.4％、5.6％、3.7％三种，多单独配制，用三蒸水溶解，过滤除菌，分装小瓶，盖紧瓶塞，在使用前再加入。

HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）是一种氢离子缓冲剂，具有较强的缓冲能力，能较好维持pH的稳定。

使用最终浓度为10～50mM，可根据缓冲能力的要求而定，并可直接加入到配制的培养液内。

（四）抗生素液和抗霉素液用于原代培养接种前标本的处理和常规培养液内预防微生物污染。

最常用的为青、链双抗液，其用量为：每ml标本处理液含青霉素1万单位、链霉素50万μg；每ml培养液含青霉素100单位、链霉素100μg。

常用的抗霉素有二性霉素B和制霉菌素。

其最终浓度为1～5μg/ml处理液或培养液。

(五）消化液是传代细胞时用以使细胞脱离附着底物表面和离散成单个细胞的溶液，经常使用的有胰蛋白酶、胶原酶和EDTA（乙二胺四乙酸）。

1. 胰蛋白酶特点：适于消化细胞间质较少的软组织，对纤维性组织或较硬的癌组织则效果较差。

钙、镁离子和血清对胰蛋白酶活性有抑制作用。

用途：消化胚胎、羊膜、上皮、肝、肾等组织和传代细胞。

剂量：0.01～0.5％，常用0.25％。

2. 胶原酶来源：是一种由细菌中提取的酶。

特点：对胶原有较强的消化作用，其活性不受钙、镁离子和血清的抑制。

用途：适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。

剂量：常用终浓度为200 U / ml 或0.1μg / ml。

3. EDTA是一种化学螯合剂，属非酶性消化物，它能吸收组织生存环境中维持其完整性所必需的钙、镁离子，从而使细胞相互分离。

常用不含钙、镁离子的BSS配成0.02％的工作液。

EDTA的作用比胰蛋白酶缓和，很少用于单独消化新鲜组织，适于消化传代细胞，多与胰蛋白酶混合（1:1或2:1）使用。

（六）指示剂和染色液指示剂：常用1％的酚红，用于指示培养液pH的变化。

（桃红色中性，黄色变酸，紫红色变碱）染色液：常用1％台盼蓝和0.2％伊红。

用于判断细胞的死活。

（活细胞不着色；死细胞染成蓝色或红色）二、培养基（一）天然培养基主要有血清、血浆、鸡胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾胶原等。

血清的应用较为广泛。

血清的种类有小牛血清、胎牛血清、马血清和人血清等。

常用的是小牛血清。

小牛血清使用前应做热灭活处理（加热到56℃，维持30分钟），以破坏其中的补体成分。

依据不同培养条件，常在合成培养基中加5～20％灭活的小牛血清。

（二）合成培养基常用的有MEMEagle、RPMI 1640、McCoy5A和HamF12。

MEMEagle培养基成分简单，广泛适用于各种已建成细胞系的培养。

同时，宜于添加某些成分，也特别适于特殊细胞的研究。

DMEM组成：是在MEM基础上增加了各成分的用量（加倍），葡萄糖用量可以选择低糖（肿瘤细胞）或高糖（克隆培养）。

用途：常用于杂交瘤技术中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。

RPMI 1640是一种常用的培养基，最初是针对淋巴细胞的培养设计的，实际应用中发现能广泛适应许多种类的细胞，包括正常细胞和肿瘤细胞的培养，而且成分简单，和MEM 一样，应用十分广泛。

McCoy5A是为肉瘤细胞设计的培养液，它除适用于原代培养、组织活检的细胞和淋巴细胞生长外，还特别适用较难培养的细胞。

培养基配制的注意事项不同厂家生产的同种产品成分比例可能不全相同，其配制方法也就不同。

有的培养基成分不完全，要求自行加入，如NaHCO3和谷氨酰胺。

谷氨酰胺在溶液中很不稳定，已含有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中贮存2周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。

在配制培养液时，还可根据需要补加某些新的成分。

如在杂交瘤技术中常用的DMEM培养液，使用时还要加入2-巯基乙醇（2-Me）和丙酮酸钠。

第三节体外培养细胞生物学一、培养细胞形态分类及结构贴附生长型细胞在体内、外的粘附方式：存在差异体内：粘附是全方位外形具有复杂的立体特征体外：多数情况，细胞只有一个附着平面外形一般与体内时明显不同悬浮生长型优点：生存空间大，提供数量大传代方便(不需消化)易于收获可获得稳定状态缺点：观察不方便很多细胞不能悬浮生长（尤其正常细胞）培养细胞形态不稳定，条件改变，细胞形态可有变化。

二、培养细胞的生长和增殖过程（一）组织培养细胞生命期1.原代培养期也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代的阶段。

一般持续1～4周。

此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。

原代培养细胞与体内原组织相似性大。

2.传代期初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。

在全生命期中此期的持续时间最长。

在培养条件较好的情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。

反复传代易失去二倍体核型，故目前世界上常用细胞系均在不出10代内冻存。

3.衰退期此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。

（二）组织培养细胞一代生长过程所谓细胞“一代”，是指从细胞接种到分离再培养时的一段时间。

它与细胞倍增一代非同一含义。

在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。

细胞一代增殖生长过程，一般要经历三个阶段：潜伏期指数增生期停滞期（或称平顶期）（三）培养细胞增殖周期第四节基本培养技术一、取材在无特定要求时，取易培养的组织进行培养，成功率高。

取材之后，最好立即培养，如因故不能培养时，应把组织切成1cm3左右的小块，置于培养液中，4℃贮存，但存放时间不宜超过24h。

取材时应严格保持无菌，防止任何污染，并避免受到紫外线照射或接触任何化学试剂及有毒药物如碘、汞等。

取肿瘤和其它病理组织时容易带菌，为减少污染，可用500～1000U/ml的青链霉素BSS液，漂洗5～10min后再做培养处理。