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发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养

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02菌种扩大培养

02菌种扩大培养

（一）孢子的制备 1、细菌孢子的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富。 培养温度一般为37℃。细菌菌体培养时间1~2d，产芽孢的 细菌培养5~10d。 2、霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等 天然农产品为培养基。培养的温度一般为25~28℃。培养时 间一般为4~14d。 3、放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含 有适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和无 机盐等。培养温度一般为28℃。培养时间5~14d。
例如:
生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或MYPG培养基 （培养基配制：3g麦芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨，10g 葡萄糖和20g琼脂于1L水中）的斜面上，于4℃冰箱内保藏。每 年移种3-4次。 将保存的酵母菌种接入含10ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中， 再于25℃培养2-3d。 再扩大至含有250-500ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再 于25℃培养2d. 移种至含有5-10L麦芽汁的卡氏培养罐中，于15-20℃培养35d即可作100L麦芽汁的发酵罐种子。从三角瓶到卡氏培养罐培 养期间，均需定时摇动或通气，使酵母菌液与空气接触，以有 利与酵母菌的增殖。
第二章 发酵的流程及菌种扩 大培养
2009.10
第一节 发酵的特点及流程
一、发酵的特点 发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进行的化 学反应。其主要特点如下： 1、发酵过程一般来说都是在常温常压下进行的生物化学 反应，反应安全，要求条件也比较简单。 2、发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为 主，只要加入少量的有机和无机氮源就可进行反应。微生物因 不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于这—特 性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进行生物资源的改 造和更新。

发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养

发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
淀粉酶活力极强，多作糖 化酶使用；具有较强的蛋白质 分解能力，可用于制造腐乳。
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛

发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术讲解

发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术讲解
的水生环境中生长
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。

发酵工程第二章

发酵工程第二章
卡那霉素产生菌经诱变后，由产生卡那 霉素A变成产卡那霉素B。
发酵工程
理想的产生菌应符合以下要求 (1)遗传性状稳定； (2)生长速度快，不易污染； (3) 物质转化率高； (4)目标产物分泌到胞外； (5) 产物类似物少； (6)对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不
敏感； (7)对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。
发酵工程
二、诱变方法
1、诱变方法： 物理诱变 化学诱变
发酵工程
1）物理诱变剂： 射线如紫外线 X—射线 γ—射线 快中子
发酵工程
2）化学诱变剂： 化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化
剂等。 化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。
发酵工程
三、诱变育种步骤
操作步骤： •出发菌株的选择 •处理菌悬液的制备 •诱变处理 •中间培养 •筛选
发酵工程
第一节 工业微生物的育种
工业微生物的育种： 运用遗传学原理和技术对某个用于特定
生物技术目的的菌株进行的多方位的改 造。通过改造，可使现存的优良性状强 化，或去除不良性质或增加新的性状。
发酵工程
一、工业育种简介
1.工业菌种育种的方法 自然育种 诱变育种 杂交育种 基因工程育种
发酵工程
第二节 自然选育
自然选育指在生产过程中，不经 过人工处理，利用菌种的自然突变 而进行菌种筛选的过程。
发酵工程
自然选育的作用：
自然选育在工业生产中可以达到纯化菌 种，防止菌种衰退，稳定生产，提高产 量的目的。
发酵工程
自然选育最为成功的例子是目前被 广泛使用的卡介苗(BCG vaccine)。法国 的卡尔密脱(Calmette)和介林(Guerin)把 牛型的结核分枝杆菌接种在牛胆汁、甘 油、马铃薯培养基上，连续传代培养230 代，前后经历13年时间，终于在1923年 获得显著减毒的结核杆菌----卡介苗。

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种

李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽 土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的 土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果 生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐 败物品，某些水域等。
新种分离与筛选的步骤
（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为 生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种， 更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆 壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒 性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的 毒性试验。
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂
李 先 磊
Fermentation Engineering
生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培 养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一 点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离 法。
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
李 先 磊
（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。

发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养

发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
孢子丝盘卷成球形孢囊，内形成孢酵母菌
单细胞真核，主 分布于含糖质较多的 偏酸性环境中，如水 果、蔬菜、花蜜和植 物叶子上，以及果园 土壤中。
1、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
又称啤酒酵母。细胞多为圆形、 卵形，能产生子囊孢子。能发酵 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖 等多种糖类，但不发酵乳糖和蜜 二糖。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
➢ 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲 料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很 用价值。
6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ) 头孢霉素、先锋霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 一般不形成气生菌丝，孢子球形，有时端生1-40 根鞭毛，能运动。 ➢ 济南游动放线菌生产创新霉素(creatmycin; 1964).
4、诺卡氏菌属 (Norcadia)
➢ 菌落较小，边缘多呈树根 毛状。 ➢ 生产利福霉素、蚊霉素等
5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium)
4、青霉 ( Penicillum )
产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum ) 生产青霉素，也可用来生产葡萄
糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏 血酸。
娄地青霉 ( Penicillum roqueforti ) 属不对称青霉组，具有分解油
脂和蛋白质的能力，用于制造干酪； 该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基 酮。
第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源 第三节 菌种选育 第四节 种子扩大培养 第五节 菌种保藏

《发酵工程》第2章

《发酵工程》第2章
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（二）微生物样品的富集培养 1. 控制培养基营养成分 2. 控制培养条件 3. 抑制不需要的菌类
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生态学参数及培养基的组成原则
1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理 学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验 中所要分离的细菌的数量和种类。
2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有1050%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，部分培 养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果 胶。
粉、碳酸钙等。 变色圈法：直接用显色剂或指示剂。 生长圈法：利用某些具有特殊营养要求的微生物作为工 具菌，要分离的微生物能在一般培养条件下生长而合成 该营养物而使工具菌能生长，形成生长圈。 抑制圈法：琼脂块培养法。
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用刚果红染色法鉴定筛选 降解纤维素的菌株
抗生素筛选
羧甲基纤维素钠作培养物
检定菌培养， 加上发酵液
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中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
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问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的 细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域 中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。
样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样 采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋 和塑料瓶等。
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采样的注意事项

《发酵工程》02 工业发酵菌种选育

《发酵工程》02 工业发酵菌种选育

（2）增殖培养
➢目的： 富集目的微生物，让目的微生物在种群中 占优势，使筛选变得可能。
富集方法 1、养分 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、 液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。
（３）纯种分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
• 细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、 醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
短杆菌：GA、Gln、lys…… 枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等 地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) αAmylase 苏云金芽孢杆菌短：杆B菌T生物农药…棒…状杆菌 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁y酸ea等sts的发酵
啤棒酒状酵杆母菌
• 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主 要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的 有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
啤酒酵母：酿酒、辅酶类物质的发酵
酒香酵母：酿酒
汉逊酵母：酿酒，用于乙酸乙酯的发酵
假丝酵母：单细胞蛋白生产，石油发酵
霉菌
• 霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种 酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、糖化酶 黄曲霉：酱油生产，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，南方红曲酒（女儿红）；红色；豆腐 乳 赤霉菌：赤霉素的生产

发酵工程 (第2章)

发酵工程 (第2章)

（b）营养缺陷型的意义 在营养缺陷型突变菌株中，生物合成途径中的 某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，末端产 物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。 只要在培养基中限量加入所要求的末端产物，克服 生长障碍，就能使中间产物积累。 营养缺陷型突变株具有明显的遗传标记，在杂 交育种中作为出发菌株，有利于杂交重组的分析。 营养缺陷型突变株具有明显的遗传标记，可以 作为基因工程中的受体菌，检出克隆基因的表达。
（二）微生物菌种的选育
1、自然选育 不经过人工处理，利用微生物自然突变进行 菌种选育的过程称为自然选育。 自然选育简单易行，可以达到纯化菌种，防 止菌种退化，稳定生产，提高产量的目的。 自然选育的一般程序是将菌种制成菌悬液， 用稀释法在固体平板上分离单菌落，再分别测 定单菌落的生产能力，从中选出高水平菌种。
（2）抗肿瘤药物产生菌的分离。 原理一（p21）： 临床上抗肿瘤药物大部分是直接作用于核酸或 抑制核酸生物合成的物质，由于微生物和人的核 酸结构与生物合成方式有许多共同之处，所以大 部分抗肿瘤药物也具有抗菌活性，据此发展出利 用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的方法。 <1> 生化诱导分析法（BIA） <2> SOS显色法
c 、不形成孢子只通过芽殖的“假酵母”属半知菌。
工业上常用的有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等
4、霉菌（mould）
霉菌非系统演化分类的单元。凡生长在营养 基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统 称霉菌。 工业上常用的霉菌有： 藻状菌纲：根霉，毛霉，犁头霉 子囊菌纲：红曲霉 半知菌类：曲霉，青霉。
所有菌都长
完全培养基上 长成单孢菌落 基本培养基 完全培养基 轻压在绒布上 无菌丝绒布 橡皮箍 接上所有菌落的绒布 转印在新鲜 的培养基上

生产工艺第二章 种子制备 第三节种子的扩大培养

生产工艺第二章 种子制备 第三节种子的扩大培养

第三节 种子的扩大培养
此菌丝即可移到发酵罐作为种子，这称为二级种子罐 扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发 酵。又如生长更慢的菌种，链霉素生产菌种灰色链丝菌， 一般采用三级种子罐扩大培养。在小型发酵罐（5～30L） 中进行试验时，也有采用直接孢子或菌丝体接入罐中发酵 的，这称一级发酵。
第三节 种子的扩大培养
（2）霉菌孢子的制备 霉菌的孢子培养，一般以大米、 小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。这是由 于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖，而且 这类培养基的表面积较大，可获得大量的孢子。霉菌的培 养一般为25～28℃，培养时间为4～14天。
（3）细菌培养物的制备 细菌的斜面培养基多采用碳 源限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮 源。细菌培养温度大多数为37℃，少数为28℃，细菌菌体 培养时间一般1～2天，产芽孢的细菌则需培养5～10天。
第三节 种子的扩大培养
3．种子质量的判断 由于菌种在种子罐中的培养时间较短，可供分析的参数 较少，使种子的内在质量难以控制，为了保证各级种子移种 前的质量，除了保证规定的培养条件外，在过程中还要定期 取样测定一些参数以观察基质的代谢变化及菌丝形态是否正 常。在生产通常测定的参数为：①pH；②培养基灭菌后磷、 糖、氨基氮的含量；③菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 （色素、颗粒等）；④其他参数，如接前抗生素含量、某种 酶活力等。 用酶活力来判断种子的质量是一种新的尝试，如土霉素 发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关系。从表 2-4可以看出如种子液化淀粉能力强即淀粉酶活力高的，则 接入发酵罐后土霉素发酵单位也高，反之则低。因此，在选 用种子时，用测定种子液中淀粉酶的活力来判断种子质量的 方法是可取的。
种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可 减少由于多次移种而带来染菌的机会。但也必须考虑尽量 延长菌丝体（培养物）在发酵罐中生物合成产物的时间， 缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发 酵罐的生产率[产物/(ml·h)]。

发酵工程 第2章 微生物工业的菌种

发酵工程 第2章 微生物工业的菌种

（一）材料的选择
土壤 水域(海洋、湖泊、河流) 生物体内 极端环境和特殊的生态环境
（二）材料的预处理
热处理法 膜过滤法 化学药品处理
用0.01N的NaOH处理样品，可分离 得到小单孢菌。
用4ml/L的氨水处理后，再用2mg/L 的氯处理样品，分离得到了游动放线菌。
（三）分离、筛选方案的设计
筛选模型 加选择性压力 富集培养、诱饵法 反应特性 随机分离
(四)原生质体融合技术
也称细胞融合技术，指将一个细胞与另一个细 胞融合为一体，使一个细胞的遗传物质(包括核DNA 和核外基因)进入另一个细胞。
它的目的是：进入一个细胞的另一个细胞的遗 传物质为这个细胞所接受，引起这个细胞遗传特性 的改变，并且这种遗传特性的变异能够稳定遗传下 去。
原 生简 质要 体说 融明 合
筛选模型
在抗生素的筛选过程中，为避免致 病菌的感染与扩散，一般不采用致病菌 为试验的指示菌，尽可能选择非致病菌 而又能代表致病菌的其它微生物作为试 验的指示菌，这些试验指示菌就称为筛 选模型。
加选择性压力
加入不同的抗生素或试剂来增加选 择性，如分离真菌时，可加入抗细菌抗 生素，分离放线菌和细菌时，可加入抗 真菌抗生素。
选择、调取单菌落，转管保存
初筛 （以出发菌种为对照）
选出高产突变株，并留种保存
复筛 （以出发菌种为对照）
选出高产突变株，并留种保存
根据情况进行第二、第三……复筛 选出高产突变株，并留种保存
高产菌株的稳定性试验 菌种特性考察
高产菌种培养条件的优化试验 小发酵罐试验
放大试验、中试考查
大罐试验 生产
诱变育种应注意的几个问题
(1)出发菌株的选择 (2)复合诱变剂的使用 (3)诱变剂的剂量 (4)突变株的筛选 (5)高产突变株培养条件的优化

《发酵工程》第2章 菌种与种子扩大培养

《发酵工程》第2章 菌种与种子扩大培养

基酸生产中应用较多。控制菌体在不同生 长期的条件。（营养生长与代谢产物积累
时条件不同）
eg: 酶制剂两步法液体深层培养
特点：将菌体生长条件（营养期）与产酶条件（自我繁 殖期）区分开来。 操作：菌种先在营养丰富的培养基上大量繁殖→收 集菌体浓缩物→洗涤→添加诱导物的产酶培养基中 培养
eg: 氨基酸生产的两步法液体深层培养：
二、工业上常用的微生物
微生物在工业上的用途很广，包括化工、
医药、食品、水产、国防、纺织、石油 勘探及石油化工等方面。 微生物的代谢产物多，已超过1300多种， 而用于大规模工业生产的不足100多种； 微生物酶有近千种，而工业上用的不过 40－50种。微生物具有巨大的潜力可挖 掘。 工业上常用菌种举例：
A、固体培养 （曲法培养）
浅盘固体培养 深层固体培养
B、液体培养
浅盘液体培养 液体深层培养：
目前几乎所有的好
气发酵均采用液体深
层发酵法；
C、载体培养：用天然（或人工）多孔材料
（如脲脘泡沫塑料）代替麦麸之类固态基质作 微生物生长的载体，营养成分可严格控制。
D、两步法液体深层培养：在酶制剂和氨
保藏时首先要挑选优良纯种，最好是它们的休眠体 （孢子、芽孢等），其次是要创造一个最有利于休眠的 环境，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，以达到 降低其代谢活动，延长保存期的目的。
3、菌种保藏的方法：
斜面保藏法、矿物油保藏法、砂土保管保藏法、真空 冷冻干燥法、冷冻法、液态真空干燥法、琼脂穿刺封 口保藏法、曲法保藏、麦粒保藏法、无水硅胶保藏法。
四、防止菌种退化的措施
1、菌种退化：菌种的发酵能力降低、繁
殖能力降低、发酵产品的得率降低
区别于杂菌污染：

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
施加选择性压力分离法 随机分离法 这两种方法都是针对菌种从样品中分离所采用的
方法，实际发酵工业上菌种分离的步骤要有很多 步骤。
新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。
采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为的通过控制养分或培养条件，使所需
菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包
工业上常用的微生物菌种
③ 霉菌： 工业上常用的霉菌有根霉、毛霉、红曲 霉、青霉等，主要生产酶制剂、抗生素、有机酸 和甾体激素等。
④ 放线菌： 工业上常用的有链霉菌属、小单胞菌 属和诺卡菌属，主要用于生产多种抗生素。
⑤ 担子菌： 即常说的蕈菌，主要用于生产多糖、 药物开发。
⑥ 藻类： 工业上常用的藻类有螺旋藻、单烈藻等， 主要用于生产食品，替代能源等。
新种分离与筛选的步骤
（三）培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物
的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在 这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一 步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分 离的方法有划线分离法、稀释分离法。
施加选择性压力分离法
施加选择性压力分离法：利用不同种类微生物生 长繁殖对环境和营养要求不同，人为控制这些条 件，使之利于某类或者某种微生物生长，不利于 其他微生物生存，以达到使目的菌占优势，从而 快速分离纯化的目的。
括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适值、提取工艺等。
新种分离与筛选的步骤
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的 步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样 中所包含的所有微生物总数和种类。

工程科技第二章菌种与种子扩大培养

工程科技第二章菌种与种子扩大培养
工程科技第二章菌种与种子扩大培养
取离地面5~15cm处的土壤几十克，盛入预先 消毒好的牛皮纸袋中，扎好，记录采样时间、 地点、环境情况等
如：森林土有相当多的枯枝落叶和腐烂的木 头等，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源 的纤维素酶生产菌的生长。
又如：在肉类加工厂附近和饭店排水沟的污 水、污泥中，由于有大量腐肉、豆类、脂肪 类存在，因而，在此处采样能分离到蛋白酶 和脂肪酶的生产菌。
圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。
工程科技第二章菌种与种子扩大培养
筛选半纤维素酶 划线产透明圈的细菌 点种细菌双层水解圈
工程科技第二章菌种与种子扩大培养
②变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平 板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴 别出来。
如：筛选果胶酶生产菌时，用含有0.2%果胶为唯一碳 源的培养基平板，待菌落长成后，加入0.2%刚果红染 色液4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红 色水解圈。
球拟酵母属——产生甘油、甘露醇、烃类等。 红酵母属——具有产脂肪的能力
工程科技第二章菌种与种子扩大培养
酵母
由于酵母细胞内含有丰富的蛋白质、维生素和 各种酸，所以，酵母细胞本身又是医药、化工 和食品工业的重要原料。 如单细胞蛋白(一种饲料蛋白)、酵母片、核糖 核酸、核苷酸、辅酶A及酶制剂等。
工程科技第二章菌种与种子扩大培养
用途 山梨糖、5-酮葡萄糖、酒石酸
乳杆菌属（Lactobacillus） 乳酸、乳酸钙、葡萄糖、麦芽糖
芽孢杆菌属（Bacillus）
大肠杆菌（Escherichia coli） 产氨短杆菌(Brevibacterium
ambroniagenes）
淀粉酶、5‘-核苷酸酶、肌苷、鸟苷等 核苷

发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选

发酵工程与设备第二章、第二讲发酵工业菌种的分离筛选

透明圈法
在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培 养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。 分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉 酶、脂肪酶、核酸酶等；
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌
土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在 pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面； 碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生 一透明圈。
若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等， 便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈
6、随机分离方法
有些微生物的产物对产生菌的筛选没有任何选择性好处， 因此常随机地分离所需菌种，为此发展了一些快速筛选方法 并归纳出高产培养基成分的选择准则如下：
1）制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为 生长限制因素。
第三次平板分离
第三次原种斜面
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
种子培养
1株3-5瓶 较优菌株
保藏及进一步做生产性能试 验或作为育种的出发菌株
某些必要试验和毒性试验
2、分离与筛选的设计要求
在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：
1、菌的营养特征 2、菌的生长温度
但作为初筛的手段是有意义的
变色圈法
对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底 物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落 周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；
如 筛选果胶酶产生菌
用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微 生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果 红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会 出现绛红色水解圈。
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5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
淀粉酶活力极强，多作糖 化酶使用；具有较强的蛋白质 分解能力，可用于制造腐乳。
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
孢子丝盘卷成球形孢囊，内形成孢囊孢子，孢囊 孢子无鞭毛，产多霉素、创新霉素。
（三）酵母菌
单细胞真核，主 分布于含糖质较多的 偏酸性环境中，如水 果、蔬菜、花蜜和植 物叶子上，以及果园 土壤中。
1、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
又称啤酒酵母。细胞多为圆形、 卵形，能产生子囊孢子。能发酵 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖 等多种糖类，但不发酵乳糖和蜜 二糖。
3、乳酸杆菌 (Lactobacillus sp.)
➢ 革兰氏阳性，无芽孢，厌氧或兼性厌氧; ➢ 可生产乳酸、干酪、乳脂的酸化和腌菜、泡菜等.
Hale Waihona Puke 4、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutyleum)
➢ 芽孢卵形，中生或次端 生，使芽孢囊膨大成梭状 或鼓槌形; ➢ 专性厌氧; ➢ 发酵生产丙酮丁醇.
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 一般不形成气生菌丝，孢子球形，有时端生1-40 根鞭毛，能运动。 ➢ 济南游动放线菌生产创新霉素(creatmycin; 1964).
4、诺卡氏菌属 (Norcadia)
➢ 菌落较小，边缘多呈树根 毛状。 ➢ 生产利福霉素、蚊霉素等
5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium)
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
➢ 细胞直杆状，G－，无芽孢，极生鞭毛; ➢ 野油菜黄单胞菌可以淀粉生产黄原胶.
10、假单胞菌 (Pseudomonas)
能发酵生产维生素B12、丙氨酸、谷氨酸、葡萄 糖酸、色素、果胶酶；也能进行类固醇（甾体）转 化；有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。
（一） 细菌
1、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)
➢ 分布广，常存在于枯草、土壤等，
一般为腐生菌；
➢ 能产生大量淀粉酶和蛋白酶.
2、大肠杆菌 (Escherichia coli)
➢ 可生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等; ➢ 大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶可用来进行谷氨酸的定量 分析; ➢ 基因工程的材料.
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
4、青霉 ( Penicillum )
产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum ) 生产青霉素，也可用来生产葡萄
糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏 血酸。
娄地青霉 ( Penicillum roqueforti ) 属不对称青霉组，具有分解油
脂和蛋白质的能力，用于制造干酪； 该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基 酮。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源 第三节 菌种选育 第四节 种子扩大培养 第五节 菌种保藏
第一节 工业微生物菌种
一、发酵工业对微生物菌种的要求
1、具有高产目的代谢产物的能力，产量高。 2、生长繁殖能力强,有较高的生长速率,发酵周期短。 3、能够利用价格便宜,来源广泛的农副产品原材料,具 备较低的工业发酵原料成本。 4、培养要求不高,培养条件易于控制。
➢又名棉病囊霉，能危害许多重要的经济作物，如棉花、 柑橘、番茄等。 ➢该菌具有大量合成核黄素的能力，是核黄素生产的重 要菌种。
8、毕赤氏酵母 ( Pichia )
➢能利用石油或农副产品及工业废料产生菌体蛋白， 有些菌株能生产麦角固醇、苹果酸、磷酸甘露聚糖.
（四）霉菌1、根霉
(Rhizopus)
米根霉 ( Rhizopus oryzae )
（二） 放线菌
大多腐生，少数寄生。 产生多种抗生素。
1、链霉菌属 ( Streptomyces )
有良好的分枝菌丝,菌丝无 横隔,分化为营养菌丝,气生菌 丝,孢子丝,孢子丝再形成分生 孢子。
产生多种抗生素。
2、小单胞菌属 (Micromonospora)
➢ 菌落致密，表面凸起，多崎岖， 疣状；菌落常为橙黄色、红色、 深褐色、黑色和兰色。 ➢ 多种可产抗生素。
5、肠膜状明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)
➢可生产葡聚糖; ➢使糖汁变粘而无法加工，为糖厂有害菌。
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
蛋白酶，常用来制作腐乳。
总状毛霉 ( Mucor racemosus ) 是毛霉中分布最广的一种，酒曲中常见 ；
可制作豆豉。
3、曲霉 ( Aspergillus )
米曲霉 ( Aspergillus oryzae ) 有较强的蛋白分解能力及糖化能力；
酿酒中的糖化菌；蛋白酶和淀粉酶的生 产菌。
黑曲霉 ( Aspergillus niger ) ◇具有多种酶系，如淀粉酶等； ◇能产生多种有机酸； ◇是生产柠檬酸和葡萄糖酸的重要菌种。