中华绒螯蟹丝氨酸蛋白酶及其同源物的比较分析

中华绒螯蟹CYP2和CPR基因的表达及其对胆固醇含量的影响中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)在长江、辽河、黄河等我国淡水江河流域分布较为广泛,其风味独特、营养物质含量丰富、味道又特别鲜美,深受广大消费者喜爱。

近年来,随着人们生活水平的不断提高,追求更高的生活品质和健康饮食理念的深入人心,人们对吃什么更美味、更有营养、更健康非常重视。

在我国中华绒螯蟹养殖中“生长慢、规格小、胆固醇含量高和因蜕皮不完整导致的残肢断臂等问题”直接对中华绒螯蟹品质和效益带来影响,给其生产和加工也带来了巨大的挑战。

中华绒螯蟹的蜕皮贯穿整个生命周期,与其生长、发育及繁殖息息相关。

因此对中华绒螯蟹蜕皮相关基因以及在蜕皮过程中胆固醇含量的变化的研究,有助于我们解决蟹类“生长慢、规格小、胆固醇含量高和残肢断臂等”的问题,从而更好的指导中华绒螯蟹的养殖及其深加工。

本文从已构建的甲壳动物cDNA文库中获得了2个ESTs序列,并设计相关的特异性引物,结合RACE技术克隆得到了这2个蜕皮相关基因的完整cDNA序列,并对获得的全长序列进行了结构分析和功能预测,然后进一步分析了两个基因在螃蟹蜕皮各个时期的表达量及螃蟹蜕皮各个时间段胆固醇含量的相关性。

本论文针对这2个蜕皮相关基因及胆固醇含量的相关性所做的主要研究内容如下:1.CYP2基因克隆、序列分析及表达特性研究CYP2家族是目前已知的CYP450同工酶中最大、物种之间保守性最低的家族。

本文通过使用分子克隆技术得到了中华绒螯蟹CYP2 cDNA基因的全序列(GenBank登录号为KT159166),并且利用Real-Time PCR方法分析了CYP2基因在中华绒螯蟹各个组织中的表达以及蜕皮不同周期在各组织中的相对表达量。

实验结果显示,中华绒螯蟹CYP2的cDNA全长1772 bp,编码491个氨基酸序列,包括一个84 bp的5’端非编码区,一个212 bp的3’端非编码区、一个1475 bp的开放阅读框。

中华绒螯蟹的基因表达谱及生殖相关基因的克隆、表达模式研究【摘要】：中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)是中国淡水渔业的重要组成部分,它已经成为中国的一道传统美食。

由于它肉质细嫩,味道鲜美,营养丰富,在全球市场供不应求且价格不菲。

它是我国重要的经济水产养殖品种,该蟹的养殖已成为我国水产养殖的支柱产业。

在过去的几十年中,随着密集化养殖的发展,由细菌、病毒和类立克次氏体属微生物所引发的各种疾病,以及性早熟、个体小型化以、种质退化等现象在中华绒螯蟹种群中频频发生,并且对螃蟹的质量造成灾难性损失,已经成为限制该蟹养殖业发展的重要瓶颈。

因此认为了解其免疫防御机制、免疫因子特征,以及生殖生物学尤其是生殖的分子机理的研究,对螃蟹养殖的疾病控制和健康管理很有帮助,并为该蟹养殖过程中的人工生殖调控提供理论保障。

本论文试图从分子角度来研究中华绒螯蟹的免疫防御机制以及雄性生殖机理,以期能有效突破中华绒螯蟹人工养殖的瓶颈,进一步促进该蟹养殖业的持续发展。

本研究借助分子生物学和生物信息学手段,首次完成对中华绒螯蟹肝胰腺cDNA文库的构建和表达序列标签(EST)的分析,并利用先进的Solexa测序技术,对中华绒螯蟹副性腺组织进行转录组及microRNA的大规模测序并分析其基因表达情况。

不仅丰富了中华绒螯蟹的基因组数据库,同时筛选出许多免疫相关及生殖相关的的基因序列。

通过对所测高通量数据分析的注释结果,结合已有物种生殖相关基因的研究现状,分析、筛选与该蟹生殖发育相关的部分重要基因；利用RACE和WORKING等技术,获得这些基因的cDNA全长以及基因的结构；利用realtimePCR 研究不同基因在不同组织中以及同一组织不同发育阶段的表达情况,探讨这些基因在整个生殖发育过程中的调控作用。

这些研究为了解中华绒螯蟹生殖机制提供了基础资料,同时也为深入探讨该蟹雄性生殖机理提供了重要的参考。

主要研究结果如下：1采用常规cDNA文库构建技术,成功构建了一个中华绒螯蟹肝胰腺的EST文库并且获得了3,279高质量序列,代表着1177个一致性序列。

doi: 10.7541/2017.19四种植物蛋白对中华绒螯蟹幼蟹生长性能、氨基酸沉积率和抗氧化酶活性的影响崔燕燕张南南马倩倩陈晴沈振华杜震宇陈立侨(华东师范大学生命科学学院, 上海 200241)摘要: 为了筛选适宜于养殖中华绒螯蟹幼蟹的饲料植物蛋白源, 探究不同植物蛋白源饲料对幼蟹生长性能、氨基酸沉积率和抗氧化性能等方面的影响, 以50%的鱼粉配制基础饲料(记为FM), 分别采用30.5%发酵豆粕、32.5%豆粕、28%棉粕和39%菜粕替代基础饲料中鱼粉总量的50%,配制成4种等氮等能的饲料(分别记为FSBM、SBM、CSM和RSM), 投喂初始体重为(0.249±0.003) g的中华绒螯蟹幼蟹8周。

结果表明: (1)与FM组相比, FSBM、SBM和CSM组的增重率、特定生长率、饲料系数、蛋白质效率和蛋白质沉积率均没有显著性差异; RSM组的增重率与FM组相比差异不显著(P>0.05), 但显著低于SBM组(P<0.05), 而其饲料系数则显著高于FM、FSBM及SBM组(P<0.05), 蛋白质效率显著低于其他各组(P<0.05), 蛋白质沉积率显著低于SBM和CSM组(P<0.05)。

(2)不同植物蛋白组的总必需氨基酸沉积率和FM组相比差异不显著(P>0.05), 而RSM组总必需氨基酸沉积率显著低于FSBM和CSM组(P<0.05)。

(3)与FM组相比, 不同植物蛋白组蟹的血清和肝胰腺中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性和肝胰腺丙二醛(MDA)含量并没有显著的影响, 而RSM组血清丙二醛(MDA)含量显著的高于其他各组(P<0.05)。

结果表明, 在幼蟹饲料中, 豆粕、发酵豆粕和棉粕替代基础配方中鱼粉的50%后并未对幼蟹的生长性能、氨基酸沉积率及抗氧化能力造成负面的影响, 发酵豆粕、豆粕和棉粕可以作为替代鱼粉的适宜蛋白源, 且添加水平约在30%左右。

论文摘要作为模式识别受体，C型凝集素家族（CTLs）在识别和清除病原物的过程中扮演重要角色。

在本研究中，在中华绒螯蟹中发现一种新的CTL。

根据从肝胰腺cDNA文库里分离得到的ESTs克隆得到该基因的全长。

该基因全长为685bp 含开放阅读框（ORF）468bp，可编码155个氨基酸。

氮端含有信号肽和糖类识别结构功能域（CRD）。

通过实时定量PCR技术，检测该基因mRNA大量存在于肝胰腺中，在其他组织中很少甚至没有。

经过脂多糖（LPS）的免疫刺激，该基因mRNA水平明显上调。

该重组蛋白（rEsLecD）可以结合多种微生物，包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌。

同时，钙离子的存在可以增强该重组蛋白对细菌的结合能力，但钙离子在结合实验中不是必须的。

该重组蛋白与细菌的结合继而诱导病原微生物的凝集。

另外我们检测到这种重组蛋白能够抑制细菌的生长，并且有一定的杀菌作用。

更有趣的是，该重组蛋白可以引发血细胞体外包裹。

总之本研究结果预示着，该凝集素蛋白作为抗菌模式识别受体分子，在无脊椎动物的非特异性免疫系统中，扮演重要角色。

Lectins 作为一种模式识别受体（PRR），以细胞表面受体或者游离的可溶蛋白存在。

在识别异己和清除病原菌方面扮演重要角色。

他们识别并非特异性结合到细菌表面的糖残基，从而引发细菌的凝集。

Lectin因为不同的糖类识别结构域类型可以分为很多种。

其中C型凝集素是用来描述一种依赖钙离子的糖类结合蛋白。

C型凝集素通过典型的糖类识别结构域（CRD）与细菌表面糖残基结合并诱发一系列免疫应答。

关键词：中华绒螯蟹，先天免疫，C型凝集素ABSTRACTC-type lectins as one of pattern recognition receptors play great roles in recognizing and eliminating pathogens in innate immunity.In this study, a novel C-type lectin (EsLecD) was identified from Eriocheir sinensis. The cloning of full-length EsLeD cDNA were based on the initial expressed sequence tags (EST) isolated from a hepatopancreatic cDNA library .The full-length cDNA of EsLecD was 686bp with an open reading frame of 468 bp encoding a putative protein of 155 amino acids with a N-terminal signal peptide and a single carbohydrate-recognition domain (CRD). The mRNA transcripts of EsLecD was mainly detected in hepatopancreas but not in other tissues by Reverse transcription-PCR analysis and post LPS immune challenge, the mRNA expression level in hemocytes significantly up-regulated. The recombinant EsLecD(rEsLecD) protein can bind to some Gram-positive, Gram-negative bacteria and Yeast and Calcium (Ca2+) can increase the binding activity, but not essential. rEslecD may bind to pathogen with a wide range. The recombinant protein can inhibit the grouth of the microorganism we tested at absent of Ca2+. Our results showed rEsLecD agglutinated some microorganism in a Ca2+-dependent manner. Except for the binding activities, rEsLecD could induce the aggregation but does not happen in the absence of Ca2+. It has been shown that the rEsLecD could also stimulate hemocyte encapsulation. In conclusion, our study suggested that rEsLecD as a significant PRR have a part in recognizing invading pathogens in crabs and play a great role in innate immunity.Keywords:Eriocheir sinensis, innate immunity, C-type lectin目录论文摘要 (V)ABSTRACT ................................................................................................................. V I 第一章综述 (1)第一节甲壳动物动物免疫系统 (1)第二节C型凝集素简介 (5)第三节本研究的意义及技术路线 (12)第二章EsLecD基因的序列以及表达模式分析 (14)第一节EsLecD基因全长的克隆 (14)第二节EsLecD基因的序列分析 (20)第三节EsLecD表达模式分析 (24)第三章EsLecD的抗菌机制探讨 (28)第一节重组载体构建以及重组蛋白的表达和纯化 (28)第二节rEsLecD与细菌的结合以及钙离子依赖性分析 (35)第三节rEsLecD抑菌和杀菌活性的分析 (44)第四节rEsLecD凝集细菌活性分析 (46)第五节rEsLecD参与血细胞包裹作用的分析 (48)第四章总结及展望 (51)参考文献 (53)附录 (61)致谢 (62)第一章综述第一节无脊椎动物免疫系统免疫系统一般分为天然免疫（natural immunity）和获得性免疫（acquried immunity）,或者被称为先天免疫（innate immunity）和适应性免疫（adaptive immunity）。

长江水系中华绒螯蟹种质资源研究进展摘要: 本文综述了近年来长江水系中华绒螯蟹种质资源研究现状及其进展，以中华绒螯蟹种质鉴定、系统发生、遗传多样性以及生物入侵等研究内容为重点，阐述了当前长江水系中华绒螯蟹种质资源的最新研究成果，并探讨了当前研究中所存在的一些问题。

关键词：中华绒螯蟹种质Advances in Germplasm Research of the Chinese Mitten Crab, Erocheir sinensis Originated from theYangtze RiverAbstract: Germplasm resources research achievements of Erocheir sinensis originated from the Yangtze River were summarized in the present article. Focusing on the directions of germplasm identification, phylogeny, genetic diversity and biological invasions, we elaborated the latest progress of the research work of Erocheir sinensis. Then we discussed the problems that existed in the current research.Keywords：Erocheir sinensis，germplasm中华绒螯蟹( Eriocheir sinensis)属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲(Crustacca) 、十足目(Decapoda) 、方蟹科(Grapsidae) 、绒螯蟹属( Eriocheir) ，俗称河蟹。

中华绒螯蟹分布区域广泛，在我国北起辽宁、南至福建的沿海各省份通海河流中几乎均有它的踪迹，但群体自然分布以长江中下游为主[1-6]。

doi ：10.16446/j . cnki . 1001 -1994.2018.04.004中华绒螯蟹营养生理学研究进展孙金秋1徐莞媛1高焕1，2’3’4阎斌伦u ’3’4[1江苏省海洋生物技术重点实验室/海洋生命与水产学院，淮海工学院，江苏连云港222005;2江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏连云港222001;3江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏南京210014；4江苏省海洋资源开发研究院（连云港），江苏连云港222005]摘要:高效优质的饲料是中华绒螯蟹养殖业发展重要的物质基础，而优化饲料中各营养元素的配比具有 十分重要的意义。

文章综述了近年来诸多学者对中华绒螯蟹在蛋白质、脂类、糖类、微量元素和其它影响 因素方面的营养生理学研究进展。

这些研究在营养生理学基础上揭示了中华绒螯蟹生长过程中对各营养 元素的需求情况，可为配制既能促进蟹生长又不降低其营养价值和口感的优质饲料提供科学依据。

关键词：中华绒螯蟹;氨基酸;脂肪酸;微量元素中华绒螯蟹（£^i 〇c/ieir s ir e C T w is )隶属于节肢动 物门、甲壳纲、十足目、绒螯蟹属，俗称河蟹、大闸 蟹。

中华绒螯蟹是一种经济蟹类，在我国广泛分 布于南北沿海各地的湖泊，其中以长江流域产量 较大。

其肉质鲜美、营养丰富、富含维生素A ，在 我国美食界久负盛名。

20世纪70年代，中华绒 螯蟹的产量主要来自于湖泊天然捕捞。

80年代 后期，河蟹自然资源由于过度捕捞和环境破坏而 急剧下降，随后我国开始大力推广河蟹养殖，河蟹 产量激增，并在我国淡水养殖业中占据了一定的 地位[1_2]。

在早期河蟹人工养殖过程中，主要投喂冰鲜 小杂鱼、螺蛳肉等，饲料种类较单一，导致河蟹营 养不均衡，且容易因饵料中携带有致病菌而引发 病害。

这种传统的养殖模式已无法满足大规模、集约化生产，极大地限制了河蟹养殖业的发展。

因此，近年来众多研究者在河蟹的营养生理学需收稿日期：017-07-14作者简介:孙金秋(1993—）女，硕士研究生，研究方向为海洋科学。

櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄 ｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，２００３，１００（１６）：９１２８－９１３３．［６２］曹小莉．马铃薯抗晚疫病ＬＲＲ与氨基酸转运ＡＡＴ基因的分析与鉴定［Ｄ］．杨凌：西北农林科技大学，２０１７：９－３５．［６３］王冰林．马铃薯晚疫病水平抗性相关基因诱导表达谱及水平抗性机制初探［Ｄ］．武汉：华中农业大学，２００５：５８－６４．［６４］尹军良．西北地区马铃薯主栽品种的抗晚疫病性评价及致病疫霉菌候选核心ＲＸＬＲ效应基因的鉴定［Ｄ］．杨凌：西北农林科技大学，２０１７：６０－６３．［６５］ＰｏｔａｔｏＧｅｎｏｍｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，ＸｕＸ，ＰａｎＳ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｔｕｂｅｒｃｒｏｐｐｏｔａｔｏ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４７５（７３５５）：１８９－１９５．［６６］ＳａｌｖｉＳ，ＴｕｂｅｒｏｓａＲ．ＴｏｃｌｏｎｅｏｒｎｏｔｔｏｃｌｏｎｅｐｌａｎｔＱＴＬｓ：ｐｒｅｓｅｎｔａｎｄｆｕｔｕｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００５，１０（６）：２９７－３０４．［６７］ＫｕｍｐＫＬ，ＢｒａｄｂｕｒｙＰＪ，ＷｉｓｓｅｒＲＪ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓｔｕｄｙｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｓｏｕｔｈｅｒｎｌｅａｆｂｌｉｇｈｔｉｎｔｈｅｍａｉｚｅｎｅｓｔｅｄａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｍａｐｐｉｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，２０１１，４３（２）：１６３－１６８．［６８］ＰｏｌａｎｄＪＡ，ＢｒａｄｂｕｒｙＰＪ，ＢｕｃｋｌｅｒＥＳ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅｎｅｓｔｅｄａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｍａｐｐｉｎｇｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｎｏｒｔｈｅｒｎｌｅａｆｂｌｉｇｈｔｉｎｍａｉｚｅ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，２０１１，１０８（１７）：６８９３－６８９８．［６９］ＡｒａｎｚａｎａＭＪ，ＫｉｍＳ，ＺｈａｏＫ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｍａｐｐｉｎｇｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｋｎｏｗｎｆｌｏｗｅｒｉｎｇｔｉｍｅａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．ＰＬｏＳＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，１（５）：５３１－５３７．　［７０］王　舰．马铃薯种质资源遗传多样性研究及块茎性状的全基因组关联分析［Ｄ］．北京：中国农业大学，２０１７：６０－８０．吕孙建，焦锦彪，袁雪梅，等．中华绒螯蟹免疫增强剂的研究进展［Ｊ］．江苏农业科学，２０２１，４９（１０）：１９－２３．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２１．１０．００４中华绒螯蟹免疫增强剂的研究进展吕孙建１，焦锦彪２，袁雪梅１，于　?１，张海琪１，杭小英１，施伟达１，吴颖蕾１（１．农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室／浙江省鱼类健康与营养重点实验室／浙江省淡水水产研究所，浙江湖州３１３００１；２．西南大学动物科技学院，重庆北碚４００７１５） 摘要：近年来，水产养殖病害频发，抗生素和化学消毒剂滥用现象日益严重，对养殖水环境和人类安全都存在巨大威胁。

基于中华绒螯蟹EST序列的深度发掘—免疫和营养相关基因的克隆与表达研究【摘要】：中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)是我国重要的水产经济养殖品种,目前以形成了庞大的产业,创造了可观的经济利润和社会效益。

但随着中华绒螯蟹养殖业的发展,各种疾病频发,严重制约了产业的可持续发展。

由于中华绒螯蟹在内的甲壳动物不具备适应性免疫而仅具有先天免疫,所以探明先天免疫相关基因的作用机制对于阐明甲壳动物的先天免疫应答步骤和机理,解决生产中碰到的疾病问题有深远的意义。

除了病害,饲料也是制约中华绒螯蟹产业发展的重要因素。

由于目前国际鱼粉价格的居高不下,饲料成本逐渐增加,提高中华绒螯蟹对饲料营养物质的利用效率可为缓解当前饲料成本居高的想象提供有效手段,而随着饲料营养物质利用效率的提高,养殖业对水体环境的污染也降低,这又在另一方面促进了产业的可持续发展。

鉴于以上原因,本论文克隆得到了中华绒螯蟹组织蛋白酶L(catL),组织蛋白酶C(catC),组织蛋白酶A(catA),巨噬细胞游走抑制因子(MIF)和脂肪酸结合蛋白(FABP)基因,分析了其在中华绒螯蟹不同组织中的表达情况,并研究了病原微生物感染后免疫相关基因的表达模式,精巢快速发育期营养相关基因的的表达模式和微量元素锌对其影响。

1.组织蛋白酶L 的基因克隆及其表达分析组织蛋白酶家族是广泛存在与机体各组织中的一类基因,他们在机体的免疫能力、对营养物质的消化利用等方面都发挥了重要作用。

中华绒螯蟹catL的cDNA全长1274bp,其中包括编码325个氨基酸残基的长为978bp的开放阅读框。

与其他物种catL的氨基酸比对分析发现中华绒螯蟹具有该家族基因所共有的基序。

基因的时空表达分析表明,catL基因在各组织中广泛表达,其中在肝胰腺、鳃、胃和血细胞中的表达量最高。

当中华绒螯蟹经鳗弧菌感染后发现,catL基因的mRNA表达量与酶活都在攻毒后8小时达到最高。

上述研究证实catL参与了中华绒螯蟹的先天免疫应答。

中华绒螯蟹常见病原的分离鉴定、致病及免疫机制研究对患弧菌病的中华绒螯蟹进行了细菌性病原的分离和鉴定，从病蟹体内分离到三株病原菌，其生理生化特性、菌株形态及菌落形态均一致，经鉴定为副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）。

人工注射感染健康蟹，2d内均发生死亡，死亡率100％，并且症状同自然发病症状相似，证实副溶血弧菌为中华绒螯蟹弧菌病的病原菌。

药物敏感试验结果表明，此病原菌对链霉素、利福平、卡那霉素、复方新诺明、环丙沙星、氟哌酸、四环素、氟嗪酸、复达欣、菌必治、萘啶酸等药物高度敏感。

分离菌株培养物经离心、（NH₄）₂SO₄沉淀、透析、浓缩及过滤除菌获得的ECP蛋白具有明胶酶、几丁质酶、淀粉酶、酪蛋白酶、脂酶、磷脂酶等多种酶活性及溶血活性，但不具有脲酶活性，对中华绒螯蟹具有明显的致病作用。

利用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE-Cellulose离子交换柱层析等方法，从其胞外产物中分离纯化出了2种胞外蛋白酶，用SDS-PAGE电泳测得两种蛋白酶的分子量分别为39.6kD和20kD。

39.6kD蛋白酶活性在50℃～60℃范围内热稳定性最好，最适pH为9，而20kD蛋白酶的最适温度为50℃，最适pH为8。

EDTA可抑制39.6kD蛋白酶的酶活性，金属离子Cu²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺对39.6kD蛋白酶有一定的抑制作用，而Ca²⁺对酶有一定程度的激活作用，因此39.6kD蛋白酶是一种金属蛋白酶；PMSF可抑制20kD蛋白酶的酶活性，说明该酶属于丝氨酸蛋白酶类。

中华绒螯蟹表达序列标签（EST）分析及免疫相关基因的克隆、表达模式研究【摘要】：中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)是我国的重要增养殖对象之一。

近年来,随着其养殖规模的不断扩大和集约化程度的提高,由细菌、病毒和类立克次体生物等引起的各种病害日趋严重,给中华绒螯蟹养殖业造成了巨大的损失。

至今,病害仍然是困扰其养殖业的一个重要因素。

除改善环境因素外,提高机体自身免疫力和抗病力是解决这一难题的一个重要方法。

本论文试图从分子角度来研究中华绒螯蟹的免疫防御机制,以其为这一重要方法提供坚实的理论基础。

本研究借助分子生物学和生物信息学手段,首次完成对中华绒螯蟹血细胞cDNA 文库的构建和表达序列标签(EST)的分析,不仅丰富了中华绒螯蟹的基因数据,同时筛选出许多与免疫相关的基因序列。

在此基础上,通过cDNA末端快速扩增(RACE)和实时定量PCR技术进一步对主要的免疫相关基因进行了克隆和表达模式分析,这些研究为了解中华绒螯蟹免疫机制提供了基础资料,同时也为蟹病的防治提供了新思路。

主要研究结果如下:1采用常规cDNA文库构建技术,成功构建了滴度为4.50×10~6CFU/mL,库容为3.3×10~6CFU/mL,重组率为73%的中华绒螯蟹血细胞cDNA文库;从文库中随机挑取了3,118个克隆进行5’-端单向测序,经去除低质量和污染序列后,共得到3,041条高质量EST序列,这些序列的平均长度为561bp。

经拼接后获得了1,049条unique序列,包括292条重叠群(Contig)和757条单一序列(Singleton)。

通过比对发现有488条Unique序列被注释成已知的功能基因,551条Unique序列未被注释任何功能;通过GeneOntology功能分类发现了26个中华绒螯蟹先天性免疫反应,如参与酚氧化酶系统的丝氨酸蛋白酶、Kazal-型蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、α-巨球蛋白、酚氧化酶原激活因子以及酚氧化酶酶原,参与凝集反应的谷胱酰胺转移酶,与抗氧化系统相关的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转移酶以及谷胱甘肽过氧化物酶,抗菌肽类的抗脂多糖因子、甲壳素、以及Osmotin,模式识别分子类的C-型凝集素、甘露糖结合蛋白、脂多糖和β-1,3葡聚糖结合蛋白、Toll受体蛋白。

养殖与饲料2015年第11期果显示，呕吐毒素、黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮3种霉菌毒素在猪配合饲料和鸡鸭配合饲料产品中共同污染率分别达到35.1%和42.9%，说明霉菌毒素共同污染问题客观存在，而且是一种比较常见的现象。

多种霉菌毒素共存时如何控制饲料产品安全及制定科学的卫生标准，是一个值得深入研究的课题。

参考文献[1]孙桂菊，王少康，王加生.伏马菌素与黄曲霉毒素对SD 大鼠联合毒性的研究[J].中华预防医学杂志，2006，40（5）：319-323.[2]KUBENA L F ，HARVEY R B ，BUCKLEY S A ，et al.Rotting-haus.Individual and combined effects of moniliformin present inculture material and aflatoxin in BroilerChicks[J].Poultry Science ，1997（76）：265-270.摘要中华绒鳌蟹又名河蟹，是我国特有的水产珍品，随着我国水产品养殖业的飞速发展，各类养殖区域都开始养殖中华绒鳌鳖，养殖的产量也是逐年提高，随着河蟹各种养殖模式的产生，河蟹的营养源也从纯人工模式转换到以人工添加饲料为主的营养源。

河蟹以其高营养价值吸引了大量的从业人员进行养殖，本文依据快速发展的河蟹养殖业对中华绒鳌蟹的营养需求进行了详细的探讨和研究。

关键词中华绒鳌蟹；营养需求；养殖中华绒鳌蟹养殖营养需求分析李旭骁龚月生*西北农林科技大学，陕西杨凌712100收稿日期：2015-09-24*通讯作者李旭骁，男，1986年生，助理农艺师。

在中国，早在20世纪80年代初就开展了各种形式的蟹养殖技术，例如蟹苗从大型湖泊迁移到中小型湖泊养殖、水库、池塘以及围栏养殖等。

随着养殖技术的不断突破，我国的中华绒鳌蟹的产量也在不断地增长，2007年的产量已经是20年代末期的50倍左右，产能和产值均得到空前的突破。

CC/TT/AA/TG基因型受到负选择作用（P＜0.05）。

本研究结果表明，CC/TT/AA/TT和CC/TT/AA/TG基因型组合可以作为中华绒螯蟹的分子标记进行辅助育种，具有一定的育种潜力。

3.中华绒螯蟹Es-MSTN基因同义突变对基因转录和翻译的影响研究同义突变可以在基因的转录、翻译、转录后等多个基因功能进程中产生影响。

本章节应用定点突变、体外转录和过表达对中华绒螯蟹Es-MSTN基因的五个SNP位点T/C（C712T）、T/C（C714T）、T/C（C717T）、A/G（A729G）、T/G（T753G））对应的14种基因型组合（GC、AT、1T、2T、3T、4A、5T、1C、2C、3C、4G、5G、GG、TT）进行转录和翻译水平的研究。

结果发现：14种基因型在体外转录中存在转录效率差异，1C基因型的转录水平最高，而GC和AT基因型的转录水平最低，差异显著（P＜0.05），且AT基因型比GC基因型表现出更高的转录水平（P＜0.05）；表型关联的GG基因型的转录强度略高于TT，但两者之间差异不显著（P＞0.05）。

对上述基因型在293T细胞中进行过表达研究发现：不同突变基因型在转染后的不同时间（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h）的表达强度存在显著差异（P＜0.05），且AT突变基因型的表达强度显著高于GC突变基因型（P＜0.05）；而表型关联突变型（GG、TT）的表达强度之间并未检测到显著差异（P＞0.05）。

综合研究表明：5个同义突变位点对中华绒螯蟹Es-MSTN基因的转录和翻译具有重要影响，同义突变也可能具有较为重要的生物学意义，然而互为单位点等位型的表型关联突变（GG和TT）型在基因编码区的分子功能上并未检测到显著差异（P＞0.05），说明其对表型的影响可能通过其它和该位点连锁的调控区域或基因产生效应。

4.中华绒螯蟹Es-MSTN基因的分子功能研究为了解Es-MSTN基因在中华绒螯蟹生长发育过程中的分子功能，本章节使用RNAi手段对幼蟹养殖阶段的中华绒螯蟹MSTN基因进行了为期49天的连续敲降，并评估了实验周期中实验个体的蜕壳和生长特性，检测了脂肪代谢和免疫相关基因的表达差异，分析了实验样本的肌肉和肝胰腺组织的氨基酸和脂肪酸成分差异。

长江口中华绒螯蟹与其它几种同科蟹的同工酶比较
许加武;李思发
【期刊名称】《水产科技情报》
【年(卷),期】1996(023)004
【摘要】对长江口中华绒螯蟹、天津厚蟹、无齿相手蟹、红螯相手蟹和字纹弓蟹等五种蟹的肌肉、肝进行了６种同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

结果表明，五种蟹的同工酶酶谱存在明显的物种特异性和组织特异性，种间同工酶差异与它们的分类地位一致。

【总页数】4页(P159-162)
【作者】许加武;李思发
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】S966.16
【相关文献】
1.中华绒螯蟹和同科几种大眼幼体的形态区别 [J], 朱小明
2.基于线粒体COⅠ序列比较长江口中华绒螯蟹放流与野生群体的遗传多样性 [J], 彭欣悦;赵峰;张涛;耿智;朱美贵;庄平
3.长江口中华绒螯蟹雌性亲蟹放流群体与自然群体能量代谢比较 [J], 冯广朋;张航利;庄平
4.长江口中华绒螯蟹雌性亲蟹自然群体与放流群体血淋巴生化指标的比较 [J], 张
航利;冯广朋;庄平;王瑞芳;章龙珍;王海华
5.长江,瓦江中华绒螯蟹几种同工酶的分析比较 [J], 乔新美;曹维孝
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中华绒螯蟹蜕皮过程中鳃组织主要成分及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性变化田志环;焦传珍;康现江【摘要】为探讨中华绒螯蟹蜕皮过程中的生理生化变化,采用生物化学和原子吸收方法,测定了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)蜕皮过程中鳃组织糖原、蛋白质、无机离子含量及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性,结果显示:鳃组织糖原含量从蜕皮间期C期至蜕皮前Do期基本稳定,从蜕皮前D1期开始逐渐减低,直至蜕皮后A-B期降至最低.蛋白质含量从蜕皮间期C期至蜕皮前D1期保持稳定,在蜕皮前后(蜕皮前晚期D3-4期和蜕皮后A-B期)含量较高.鳃组织Ca2含量由蜕皮间期至蜕皮前D3-4期含量降低,而于蜕皮后A-B期恢复到蜕皮间期水平.Mg2含量在蜕皮过程中无显著变化,而Cu2和Zn2含量在蜕皮后A-B期显著高于其他时期.鳃组织N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性在蜕皮前Do和D3-4期显著高于其他时期.结果表明:中华绒螯蟹蜕皮过程鳃组织主要成分和N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性变化和蜕皮周期密切相关.【期刊名称】《淡水渔业》【年(卷),期】2013(043)005【总页数】4页(P81-84)【关键词】中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis);鳃;糖原;蛋白质;无机离子;N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶【作者】田志环;焦传珍;康现江【作者单位】韶关学院英东生命科学学院,广东韶关512005;河北大学生命科学学院,河北保定071002;韶关学院英东生命科学学院,广东韶关512005;河北大学生命科学学院,河北保定071002【正文语种】中文【中图分类】S917.4由于被覆坚硬的外骨骼，甲壳动物在生长过程中存在着周期性蜕皮的现象。

在蜕皮过程中，动物发生一系列形态、行为、结构及生理变化[1-2]。

甲壳动物蜕皮生理国外已有十几年的研究历史[3-4]，但国内这一领域起步较晚，尤其对于中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)这一我国重要的经济物种，关于其蜕皮过程中重要的生理生化变化的研究还很少[5-7]。