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口蹄疫病毒样颗粒研究进展

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口蹄疫病毒样颗粒研究进展魏婕*,魏玉荣,易忠(新疆畜牧科学院兽医研究所,新疆乌鲁木齐830000)摘要:病毒样颗粒(VLP)具有与真实病毒粒子大小相似的结构,能引起免疫应答但不具有感染性。

口蹄疫病毒是无囊膜的RNA病毒,其结构蛋白可组装成VLP,且具有良好的免疫原性。

本文对口蹄疫病毒VLP的免疫机制、表达系统及应用、口蹄疫病毒VLP作为抗原在诊断和疫苗中的应用进行了综述。

关键词:蹄疫病毒;病毒样颗粒;疫苗中图分类号:S852.65文献标识码:A文章编号:1003-6377(2015)04-0006-05许多病毒的结构蛋白在不同的培养系统中具有组装成重复序列或者病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的能力。

这种VLPs大小一般为22~150nm,由于他们不携带遗传物质,因此不具有感染性。

VLPs能够重复并且高密度的展示抗原位点,能引起强烈的免疫反应,因此为该病毒疫苗研究提供了极具潜力的方法。

某些病毒的VLPs与病毒的亚病毒粒子(subviral particles,SVPs)相似,这些VLP能直接作为疫苗使用。

除此之外,VLP还能作为载体,插入外源的抗原位点形成嵌合型的VLP。

VLPs是目前FMDV研究的热点之一,本文将从以下几方面对VLP在口蹄疫病毒中的应用进行综述。

1VLP的免疫机制VLPs比亚单位蛋白或者重组蛋白具有更好的免疫原性,它能引起体液免疫以及免疫系统的细胞集合。

VLPs为构象抗原的展示提供了空间结构骨架,使得构象更接近于天然的病毒结构,刺激产生更多的中和抗体。

一般来说,蛋白抗原会被MHC II类分子加工并递呈给CD4+T细胞。

而VLP被APCs加工后不仅递呈给CD4+T细胞,也会递呈给MHC I分子介导途径的CD8+T细胞。

在某些情况下,VLP不需要佐剂就能够刺激潜在免疫。

这种VLPs的自我辅助的特点是固有的,存在于刺激先天免疫所必要的过程中,如在递呈给树突状细胞加工、被MHC II类分子展示以及直接引起树突状细胞成熟和迁移的过程中,VLP会被APCs识别并递呈,从而体现其免疫原性[1]。

外源的VLP也能被MHC I类分子处理和加工,刺激活化CD8+ T细胞,而CD8+T细胞是清除像病毒这类细胞内病原所必需的。

VLsP疫苗的重要优势在于能将树突状细胞作为主要靶细胞,而这一类型的细胞作为靶细胞在刺激活化先天免疫和获得性免疫应答中都是必需的。

某些VLPs与感染性病毒相似并保留了它们的受体结合区域,这样就能通过它们的正常受体识别途径进入细胞,并作为外源抗原被I类分子递呈[2]。

FMDV是一个单股正链RNA病毒,它的开放阅读框编码结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4。

VP1的141-160位的表位肽在单独存在时,不能刺激机体产生保护性中和抗体,但将此表位与其它能提供多个Th细胞位点的大分子载体相连,可刺激机体产生保护性的中和抗体和特异性的T细胞增殖[3]。

2口蹄疫病毒VLPs的表达系统基金项目:新疆维吾尔自治区自然基金青年基金项目(2012211B55)作者简介:魏婕(1983-),女,新疆人,助理研究员,研究方向:动物病毒学。

E-mail:xiaojie0717@收稿日期:2015-04-09,修回日期:2015-04-24口蹄疫病毒的VLPs的研究开始于上世纪90年代,随后研究者们利用多种表达系统对FMDV的VLPs进行研究。

表达VLPs有多种表达系统,包括:(1)多种哺乳动物细胞系;(2)昆虫杆状病毒表达系统;(3)各种酵母表达系统;(4)大肠杆菌以及其他细菌表达系统;(5)在体外利用化学方法自我组装成衣壳组件的VLPs[4]。

兔出血症病毒(RHDV)的VLPs是由衣壳蛋白VP60组装而成的二十面体样粒子,RHDV的VLP具有很高的免疫原性并能刺激兔产生保护性抗体[5]。

将模型细胞毒性T细胞的表位插入VP60的N末端,组装形成嵌合型的VLP,这种嵌合型的VLP能在小鼠体内刺激产生强烈的特异性地细胞毒性反应并对小鼠产生保护力[6]。

E.Crisci等首先将兔出血症病毒的VLP做为展示FMDV3A表位的载体,并通过不同免疫途径并加入佐剂免疫猪。

结果表明,加入佐剂的嵌合型VLPs通过肌肉注射,两周后在猪体内会引起特异性地免疫应答,分别能检测到抗3A表位和RHDV-VLPs的细胞因子。

这也是首次关于利用RHDV-VLPs作为FMDV抗原位点展示载体的免疫学研究[7]。

MS2是一种雄性特异性大肠杆菌噬菌体,当DNA寡核苷酸插入到MS2衣壳蛋白的单一位点时,便可进行组装并能将蛋白展示于表面的VLPs。

Dong等将O/OZK株FMDV的141-160位VP1表位肽插入到MS2的衣壳蛋白中,在大肠杆菌中表达形成VLPs并将VP1表位肽展示在VLPs的表面[8]。

纯化后的VLP在电镜下观察约26nm,经过Western鉴定,表达的VLPs具有很高的FMDV的免疫原性。

将纯化的VLPs与弗氏佐剂乳化后注入小鼠、豚鼠和猪,测定显示,利用VLPs展示的表位肽能刺激小鼠、豚鼠和猪产生FMDV特异性保护抗体。

该研究还发现,该嵌合型VLP在猪体内能引发强烈的免疫反应并提供部分保护。

与传统的灭活疫苗相比,虽然表位肽疫苗具有安全,易操作的优点,但不具有理想的保护力[9]。

传染性法氏囊病毒(IBDV)是一个非囊膜病毒,其二十面体衣壳是由衣壳蛋白VP2形成三聚体后组装而成的,其衣壳蛋白具有自我组装的功能[10]。

Michelle利用IBDV VP2能自我组装成一个十二面体的亚病毒粒子的特性,将FMDV VP1loop环的12个氨基酸插入亚病毒粒子中,用于制备FMDV竞争ELISA 的诊断抗原[11]。

Cao等人将Asia I型和O型FMDV的P1-2A-3C序列分别重组到昆虫杆状病毒,利用High Five细胞表达P1-2A-3C蛋白。

研究发现,通过密码子优化和启动子的选择能够使P1-2A-3C蛋白大量表达并自我组装形成与真实病毒粒子大小相同的VLP[12],用此VLPs刺激豚鼠表现出一定的免疫原性和抗原性。

但由于VLPs的纯度和含量不够,动物不能产生高水平的中和抗体[13]。

大肠杆菌表达系统表达的外源蛋白质虽然具有易操作、低成本和高表达等诸多优点,但所表达的蛋白质未经修饰且大多以包涵体形式存在,利用该系统表达VLPs不能形成正确的空间构象。

因此,为了能使VLPs不仅大量表达并形成正确的空间构象,而且具有良好的免疫原性,研究者们进行了许多有关大肠杆菌可溶性表达的研究。

其中,在小泛素蛋白相关修饰(SUMO)融合蛋白系统的研究中取得了较大进展。

Lee等将FMDV的VP1、VP0和VP3分别加上His标签和SUMO基团,将三个蛋白同时在大肠杆菌中表达。

由于SUMO能增加病毒蛋白的水溶性并防止蛋白在组装成衣壳前聚集成团,因此,FMDV的这三个改造后的结构蛋白在共同表达时形成稳定的异源三聚体复合物。

去除SUMO基团后,这三个结构蛋白能形成与FMDV大小一致的VLPs,表达量能达到约5mg/L[14]。

Zhang等将不同的FMDV抗原位点插入HBc的不同位点,对比这些嵌合型蛋白是否能形成稳定的VLPs以及插入的抗原位点是否会抑制其原有的免疫原性。

结果显示,只有将FMDV的VP1(141–160)–VP4(21–40)–VP1(141–160)片段插入HBc的75–82aa位点时,在大肠杆菌表达系统中表达才可形成可溶性的蛋白,并组装成具有完整形态的VLPs[15]。

有研究者将FMDVVP1的抗原优势表位插入到植物病毒中,利用植物表达系统表达能展示此抗原表位的VLPs。

Huang等将FMDV VP21的抗原表位插入HBc中,构建植物表达载体,利用致瘤农杆菌LBA4404株转染至烟草植物,在烟叶中检测到含有HBc和VP21的VLPs。

粗提烟叶中的可溶性的VLPs 蛋白,免疫小鼠后能产生特异性抗体并具有针对FMD的保护力[16]。

Zhang等用烟草坏死病毒A(TNV-A)展示FMDV VP1的抗原优势表位肽,利用植物表达后能获得结构稳定的VLPs,经纯化的VLP能引起小2015年7月第4期(总第173期)草食家畜(双月刊)鼠的体液免疫[17]。

任晓冰、窦小龙等分别利用猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白以及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能组装成VLPs的特性,使FMDV中和表位展示于VLPs表面,构建了能分泌表达VLPs的芽孢杆菌表达质粒,并利用枯草芽孢杆菌进行表达,获得了具有反应原性的VLPs[18,19]。

真核表达系统具有翻译后修饰的优点,使VLPs能够正确的组装。

但是若将能形成VLPs的重组蛋白在真核表达系统中同时表达,这些重组蛋白能同时进入同一个细胞的概率很低,在组装VLPs时可能会缺少某一种蛋白从而影响VLPs的组装效率,使表达量较低,因此不适用于VLPs的大量制备。

原核表达系统虽然缺少翻译后的蛋白修饰系统,但由于该表达系统的具有低成本、高效率等诸多优点,仍是目前研究的热点。

为克服原核表达系统中缺乏翻译后蛋白修饰的缺点,该表达系统还需要进一步的修饰和优化来提高VLPs的组装效率来。

此外,影响VLPs表达效率的外界因素仍在进一步研究探索中[20]。

3口蹄疫病毒颗粒样疫苗疫苗免疫是控制和预防FMD流行有效的技术方法。

目前,大多疫苗的制备都是利用灭活的病毒做为疫苗的抗原。

传统的口蹄疫疫苗存在以下缺点:(1)保护期短;(2)制备过程中有散毒的危险;(3)在制备疫苗过程中,非结构蛋白去除不彻底,会造成区分自然感染及免疫动物的困难。

为了克服传统疫苗的缺点,利用重组DNA技术的FMD VLPs疫苗应运而生。

VLPs是由病毒的结构蛋白通过自我组装,形成与病毒形态相似的构象,并且不具有感染性和复制能力。

VLPs能展示与天然病毒极其相似的构象表位,因此能有效地刺激产生体液免疫和细胞免疫应答。

FMDV O/IND/R2/75株在亚洲和欧州国家均被用做疫苗候选株,该株毒与南亚、中东、欧亚以及东南亚地区流行的O型口蹄疫的泛亚谱系,Ind2001和Mya-98谱系具有广泛的抗原覆盖率。

Bhat,S.A等将多角体蛋白启动子与O型FMDV(O/IND/R2/75株)的P1-2A和突变后的3C基因克隆到杆状病毒中,在昆虫细胞中表达出了聚合蛋白P1-2A-3C。

突变后的3C蛋白降低了野生毒株的蛋白酶活性,提高了结构蛋白的表达量,并将P1-2A剪切成了空衣壳的组成部分VP0、VP3和VP1,最终组装成VLPs。

将表达的VLPs免疫豚鼠后产生的中和抗体与传统单价疫苗免疫豚鼠后产生的中和抗体相比,VLPs抗体水平组明显高于传统疫苗组,证明VLPs在豚鼠体内能产生了针对FMD的保护抗体。

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口蹄疫的诊治进展

口蹄疫的诊治进展


ｊ 交戴祷
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教 授 ，硕 士 生导 师 。现 任
１ 病原学 Ｆ Ｖ属小 核糖核酸病毒科 （ ｉ ｍａ ｉｄ ｅ ， 口疮病 ＭＤ ｐｃ ｖ ｉａ ） ｏ ｒ
哈 尔滨 医科 大学第一 临床 医学 院感 染科 三 病 房 主
毒属 （ｐ ｔｏｉ ） 。外 形呈球形 ，直径 约 ３ ｍ，无囊 ａ ｈｈｖ ｍｓ ０ｎ 膜 ，分子质量为 ６９Ｘ１。 。完整 的病毒 颗粒包括 衣壳 和 ． Ｕ ０
发表论 文 ４ ０余 篇 ，编 写 专业 论著 及 教材 １ 部 ，承 担 ０余
省 、市 、厅 级课 题 １ ０余 项 并 获 奖 ， 目前 承 担 丙肝 研 究 项
目国际合作课题 １项。
型等 ，以 Ｏ型 为 常见 。各 型 之 间的抗 原 性 明显 不 同 ，各 型 内又分 出许 多亚 型 ， 目前 已知有 ６ ５个 亚 型 ，各 型 间无
Ｆ Ｖ对和土壤 中可保持 传染性数周至数 月。在 畜 毛上 能生存 ２～ ４周 ，在被 污染 的土壤 和饲 料 中可存 活
４个月 ，在冻 肉中可长期保 存。高温 和 阳光对病 毒有 杀灭
作用 ，在 ６ ℃ ３ ｉ，８ ℃ ５ｍ ｎ即被灭 活。酸 、碱对病 ５ ０ｍｎ ０ ｉ
交叉免疫 。欧洲 及南 美洲 流 行 Ｏ、Ａ、Ｃ ３个 型 ，亚洲 主
口蹄疫 （ ＭＤ）俗称 “ Ｆ 口疮 ” “ 黄 ” 等。它是 由 、 蹄 口蹄疫 病毒 （ ＭＤ Ｆ Ｖ）感 染引起 的偶 蹄动 物 的一种 急性 、 发热性 、高度接 触性传 染 的疾 病 ，也是 一种 人畜共 患病 。 易感染 Ｆ ＭＤ的偶 蹄动 物约 有 ７ ０多种 ，最 常 见的 动物 有 牛 、羊 及猪等。 由于发病 动物在 口腔和蹄部 的病 变和症状 最明显 ，所 以称 为 Ｆ ＭＤ。Ｆ ＭＤ感 染率 高 、传 播 速 度快 、 危害大 ，因此被世界动物卫生组织 （ Ｉ ）列 为 Ａ类动物 ＯＥ 传染病 之首 Ｊ ＭＤ可 引起幼 畜 死 亡 、产奶 量 下 降 、肉 。Ｆ 食减少 、肉品质 下降 ，动物的生产性能 降低 。此外 ，由于 贸易的限制和禁 止 动物 及其 产 品的 出 口而 引致 的损失 更 大 。Ｆ ＭＤ的暴发 已经影 响到 国 际关 系 、国家 声誉 和 经济 发展 ，在国际上素有 “ 治经济病 ”之称 。 政 近几年 ，Ｆ ＭＤ在亚洲 国家及 英 国 、法 国等 欧洲 国家 ， 包括一些原来宣 布无 口蹄疫 国家相继发 生 ，给发病 国家和 地 区带来 巨大 的 经济 损 失。 自去 年 开始 ，我 国 山东 、江 苏 、新 疆 、甘肃 、宁夏 、湖北及青海等地相继发现 了亚洲 Ｉ Ｆ 型 ＭＤ疫情 。因此 ，Ｆ ＭＤ也 引起 了我 国相 关部 门的高
MS2介导的口蹄疫类病毒颗粒疫苗的研究

MS2介导的口蹄疫类病毒颗粒疫苗的研究


２ ０ １ ３年 ３月
ＭＳ ２介 导 的 口蹄 疫 类病 毒 颗 粒 疫 苗 的研 究
董 艳 美 ， 张 国广 ， 汪 卫 ， 范 红 军。 ， 陈 亮
（ １ ． 厦 门 大学 生命 科 学 学 院 ， 福建 厦 门 ３ ６ １ １ ０ ２ ； ２ ． 漳 州 师 范 学 院生 命 科 学 与 技 术 系 ， 福建 漳州 ３ ６ ３ ０ ０ ０ ； ３ ． 河南师 范大学生命科学学院 ， 河南 新 乡 ４ ５ ３ ０ ０ ０ ）
为其 一旦 爆 发 则 传 播 速 度 快 ， 流 行 范 围广 ， 补 救 措 施 少， 可造 成上 百亿 美元 的直接 经济 损失 ， 故被 世 界动物
卫生 组织 （ ＯＩ Ｅ ） 列 为 必 须 报 告 的动 物 传 染 病 ， 我 国规
定其 为一 类 动物 疾病 ｌ ＿ ｌ ］ ． Ｆ ＭＤＶ 为单股 正链 ＲＮＡ病
Ｄ Ｖ 的阳性血清 ， ３ ０ ｇ的 Ｃ Ｐ — ＶＰ １的 ＶＬ Ｐ ｓ 蛋 白免 疫 小 鼠后 可 以诱 导 其 产 生 高 效 价 的特 异 抗 体 ． 故 该 口蹄疫 病 毒 抗 原 决 定 簇 展 示 在 噬 菌 体 ＭＳ ２上 表 面 的 ＶＬ Ｐ ｓ 蛋 白具 有 开 发 成 口蹄 疫 疫 苗 的前 景 ．
关键词： Ｖ Ｉ 蹄疫 ； ＭＳ ２噬菌体 ； 抗原决 定簇 ； 类病毒颗粒
中 图分 类 号 ： Ｑ ７ ８
文献标 志 码 ： Ａ
文章 编号 ： ０ ４ ３ ８ ０ ４ ７ ９ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ２ ０ ２ ３ ７ — ０ ７
口蹄疫 （ Ｆ ｏ ｏ ｔ — ａ ｎ ｄ — ｍｏ ｕ ｔ ｈ ｄ ｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ ， Ｆ Ｍ Ｄ） 是 由 口蹄
口蹄疫实验室检验样品采集注意事项

口蹄疫实验室检验样品采集注意事项

口蹄疫实验室检验样品采集注意事项作者：王宇翔来源：《当代畜禽养殖业》 2019年第4期王宇翔(抚顺市现代农业及扶贫开发促进中心，辽宁抚顺 113006)摘要：口蹄疫对畜牧业危害严重，需要及时确诊，科学防控。

实验室诊断是否顺利与采集样品质量密切相关。

本文详细阐述了口蹄疫样品种类及各种样品采样的注意事项，以期为采样技术人员提供参考。

关键词：口蹄疫；样品采集；注意事项中图分类号：S851.34+7文献标识码：B文章顺序编号：1005-5959（2019）04-052-02口蹄疫是由口蹄疫病毒感染引起的以偶蹄动物为主的急性、热性、高度传染性疫病。

该病对畜牧业危害严重，需要及时诊断，科学防控。

而实验室诊断是否顺利与采集的样品质量密切相关，所以采样人员必须全面掌握采样技术及注意事项，确保所采样品质量符合实验室检验要求。

1 样品种类口蹄疫实验室检验所采集的样品包括水泡皮或水泡液、O~P液（食道~咽部分泌物）、血液、组织、脏器、分泌物、排泄物、肉制品、奶制品和皮革制品等。

检验目标为病毒、病毒抗体和病毒核酸等。

2 各种样品采集注意事项2.1 水泡样品水泡样品是指病畜的水泡液和水泡皮，该类样品病毒含量高，易于诊断。

2.1.1 水泡液采集。

用消毒过的注射器从未破溃水泡中吸出水泡液，水泡液应清亮透明，装入灭菌瓶中（可加入适量的抗生素），加盖后用胶带封口，贴上标签，冷藏保存。

2.1.2 水泡皮采集。

选采新鲜、成熟、未破裂或刚刚破裂不久的水泡皮，不采取陈旧、结痂或腐败变质的残破水泡皮。

牛样品应采取舌表面的水泡皮，在水泡尚未破溃或刚破溃时，牛的口中有少量流涎，这是采样的最佳时机。

在采不到舌面水泡皮的情况下，可采取蹄叉及蹄冠部的水泡皮。

猪样品应采集蹄叉部、蹄冠部或鼻镜部的水泡皮，不要采取蹄踵部角质化表皮。

羊的水泡样品较难采集，水泡通常小而分散，需要仔细寻找。

采取水泡皮时应尽量保持无菌，用消毒剪子剪下水泡皮后置入无菌小瓶中，加入由等量甘油和0.04 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2~7.6)配制成的保存液中，可加入适量抗生素。

如何正确评价口蹄疫疫苗效力

如何正确评价口蹄疫疫苗效力

一、口蹄疫疫苗口蹄疫疫苗是由强毒接种悬浮培养BHK-21细胞，收获细胞毒液，经二乙烯亚胺(BEI)灭活，与油佐剂混合乳化制成的灭活疫苗，同时灭活疫苗是目前我国用于预防口蹄疫的主要产品。

二、疫苗制苗毒株口蹄疫病毒抗原性多变，各血清型间无交叉免疫性。

同一型内又存在多种不同毒株，它们之间也有明显的抗原差异，有的能够提供部分交叉保护，有的完全不能。

目前，国际上普遍采用细胞中和试验或ELISA方法计算r值，以此反映毒株间的抗原关系。

r值愈接近1，毒株间抗原关系愈靠近；反之，抗原关系疏远，毒株差异较大。

r值是反映了一个毒株的抗血清对另一个毒株抗原的交叉反应程度。

通过我国口蹄疫流行变化来看，病毒往往发生变异之后，原有的疫苗株对新的流行毒株没有保护或保护力下降。

因此，所选疫苗毒株必须与流行毒株在抗原特性上相互匹配，免疫才能有较好的效果。

三、口蹄疫疫苗146S口蹄疫疫苗146S，即完整的病毒颗粒，口蹄疫完整病毒颗粒和组装体在蔗糖密度梯度中的沉降系数有所不同。

完整病毒粒子的沉降系数为146S，无核酸的空衣壳沉降系数为75S，由VP0、VP1和VP3各5 个分子组成的五聚体沉降系数为12S，由VP0、VP1和VP3各一分子组成的单体沉降系数为5S。

完整的病毒颗粒以及降解产物空衣壳（75S）可引起较好的免疫保护效力，对于体液免疫，尽管12S和5S结构蛋白免疫原性较弱，但两者仍具有细胞免疫和免疫增强的作用，可提高免疫应答水平[1]。

根据146S的生化特性，现阶段可采用蔗糖密度梯度离心法、单克隆抗体夹心ELISA定量法、分子排阻色谱法、蛋白层析法等方法测定口蹄疫病毒抗原含量，但目前还没有能够检测刺激机体产生抗体的75S含量的方法，同时国家对口蹄疫疫苗146S的含量以及检测方法均没有相关标准和要求，不同企业、不同检测机构使用的检测方法不同，检测结果也会有差异，虽口蹄疫灭活疫苗以体液免疫为主，但细胞免疫水平也是衡量疫苗免疫效力的重要指标，所以检测146S含量不能完全体现疫苗的免疫效力。