酶的提取

酶的分离提纯实验原理酶的分离提纯是指从复杂的混合物中获得纯净的酶样品的过程。

此过程旨在去除其他杂质，并提高酶的比活性和纯度。

酶的分离提纯实验原理可以分为以下几个方面：1. 根据酶的生理特性进行分离：酶的分离可依据酶对pH值、温度、离子浓度、底物特异性等因素的敏感性进行。

常用分离方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、电泳等。

2. 分离的物理性质利用：酶可根据其分子大小、电荷、溶解度等物理性质进行分离。

例如，凝胶过滤层析通过选用合适的孔径筛选凝胶，使大分子酶无法进入凝胶孔隙，进而实现分离。

3. 分离的化学性质利用：酶可通过与其他物质的特异性相互作用来实现分离。

亲和层析是一种常用的方法，利用酶与某些配体（如某种金属离子、亲合剂等）的特异性结合来分离酶。

在实验中，通常采用以下步骤进行酶的分离提纯：1. 细胞破碎：从生物体中获得酶源，如细胞、组织、分泌物等。

通常使用超声波破碎、搅拌破碎、离心等方法破碎细胞，并保持样品低温以防止酶的失活。

2. 酶提取：将破碎的细胞溶液用适当的缓冲液进行提取，并添加必要的辅助物质（如阻聚剂、金属离子等）以保持酶的稳定和活性。

3. 初步分离：通常先进行粗提，包括沉淀、超滤、离心、酒精沉淀等方法，目的是将酶与其他细胞组分分离开来。

4. 层析：根据酶的物理性质或化学性质选择适当的层析方法。

离子交换层析是常用的方法之一，根据酶与离子交换基质之间的相互作用进行分离。

5. 亲和层析：利用酶与特定配体之间的结合进行分离。

例如，选择性地将酶与亲和基质（如亲和剂或金属离子）结合，然后利用特定条件（如改变pH值或添加竞争性配体）来解离酶。

6. 离心和浓缩：通过离心和浓缩等操作，将目标酶进一步分离和提纯。

7. 再结晶：通过结晶或沉淀等方法进行酶的最终纯化。

8. 活性测定和纯度检验：测定酶的比活性，评估酶的纯度和活性。

总之，酶的分离提纯实验原理基于酶对物理、化学条件的敏感性，通过适当的分离方法和步骤，去除杂质，提高酶的纯度和比活性。

一、实验目的1. 了解酶提取的基本原理和方法。

2. 掌握酶提取过程中的操作技巧。

3. 学习酶活性检测的方法。

二、实验原理酶是一种生物催化剂，具有高度的专一性和活性。

酶提取实验的目的是从生物材料中提取酶，并对其进行纯化和活性检测。

酶提取的基本原理是利用生物材料中的酶具有特异性的结合位点，通过合适的溶剂、温度、pH等条件，使酶从生物材料中释放出来。

三、实验材料1. 生物材料：新鲜菠菜、酵母粉、淀粉酶等。

2. 试剂：Tris-HCl缓冲液、SDS、DTT、EDTA、蛋白酶抑制剂等。

3. 仪器：高速冷冻离心机、低温冰箱、水浴锅、电子天平等。

四、实验步骤1. 酶提取（1）取适量新鲜菠菜，用剪刀剪碎，加入适量Tris-HCl缓冲液（pH 7.0），搅拌均匀。

（2）将混合物放入高速冷冻离心机，以4℃、12,000 rpm离心10分钟，取上清液。

（3）加入适量SDS、DTT、EDTA和蛋白酶抑制剂，混匀。

（4）将混合物置于低温冰箱中保存。

2. 酶活性检测（1）取适量酶提取液，加入适量底物，混匀。

（2）将混合物置于水浴锅中，在特定温度下反应一定时间。

（3）终止反应，加入适量显色剂，混匀。

（4）在特定波长下测定吸光度值，计算酶活性。

五、实验结果与分析1. 酶提取结果通过离心分离，成功提取了菠菜中的酶。

酶提取液在低温冰箱中保存，待后续实验使用。

2. 酶活性检测结果通过酶活性检测，得到了酶提取液的活性值。

根据实验数据，计算出酶的活性单位。

六、实验讨论1. 酶提取过程中，选择合适的溶剂、温度、pH等条件对酶的提取效果至关重要。

在本实验中，我们选择了Tris-HCl缓冲液作为溶剂，pH 7.0为酶提取的最佳pH 值。

2. 酶提取过程中，添加SDS、DTT、EDTA和蛋白酶抑制剂等试剂，可以保护酶的活性，防止酶在提取过程中被破坏。

3. 酶活性检测是评价酶提取效果的重要指标。

在本实验中，我们通过测定酶活性单位，对酶提取效果进行了评价。

酶的提取方法
酶的提取方法有多种，以下是一些常用的方法：
1. 机械法：如绞碎、刨碎、匀浆、研磨、挤压或超声波等。

研磨时还可加入细砂、石英粉、氧化铝等以利细胞破碎。

2. 化学法：用盐、碱、表面活性剂、EDTA、丙酮和正丁醇等可使细胞破碎、颗粒体结构解体，从而把酶释放出来。

例如常将胰脏用数倍量丙酮处理2～
3次，制成丙酮粉供多种酶的提取用；用胆酸盐处理膜结构上的脂蛋白和“结酶”，使两者形成复合物，并带上静电荷，由于电荷之间的排斥作用，使膜破裂，达到溶解。

3. 酶解法：用组织自溶或用溶菌酶、脱氧核糖核酸酶、磷脂酶等降解细胞膜结构，然后再进行提取。

但应知道组织自溶法对某些酶的提取是不利的，如胰蛋白是以酶原形式纯化后再激活成胰蛋白酶的，若用自溶法提取，酶原已转成酶，纯化就很困难。

4. 冻融法：采用反复冷冻与融化时由于细胞中形成了冰晶及剩余液体中盐浓度的增高可以使细胞破裂。

5. 过滤：可加硅藻土、纸浆等为助滤剂。

6. 搅拌：加速提取，但转速不宜太快，否则会产生泡沫而难以过滤或使酶变性。

7. 提取溶剂：可以用水、一定浓度的乙醇、乙二醇、丁醇和稀盐溶液、缓冲溶液等；也可以用稀碱或稀酸溶液，如用稀硫酸提取胰蛋白酶，用稀盐酸提取胃蛋白酶。

请注意，这些方法可能对不同的酶类效果不同，因此在实际操作中应根据实际情况选择合适的方法。

酶的主要提取方法及其优缺点生物工程09-1班杨桠楠0901*******1、有机溶剂沉淀是利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的。

优点：1）分辨率比盐析法高2）沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。

2）对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。

沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。

2、等电点沉淀是利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的优点：1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化缺点：1）酸化时，容易引起蛋白质失活3、有机聚合物沉淀法(复合沉淀法)是在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的。

优点：1）操作条件温和，不易引起生物大分子变性。

2）沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。

3）沉淀后有机聚合物容易去除。

4、盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离常用的盐析剂: 硫酸铵优点：1）盐析能力强。

2）在水中溶解度最大（25℃时为4.1mol/L）。

而温度系数最小（对温度不敏感）。

3）价格便宜。

浓度高时也不会引起蛋白质和酶生物活性的丧失，抽提效果好。

缺点：1）缓冲能力差2）NH4＋的存在干扰蛋白质的测定3）得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。

5、双水相萃取技术是用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。

由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。

四、酶的提取技术1、酶提取的方法（1）盐析法盐析常用的中性盐有Mgso4、（NH4)2SO4和NaH2SO4和NaH2SO4,其盐析蛋白酶的能力因蛋白酶种类而不同，一般以含有阴离子的中性盐盐析效果较好。

但是由于（NH4)2SO4的溶解度在低温也相当高，故在生产上普遍应用（NH4)2SO4。

一般使各种酶盐析的剂量通过实验来确定。

以中性盐盐析蛋白酶时，酶蛋白溶液的PH值对盐析的影响不大。

在高盐溶液中，温度高时酶蛋白的溶解度低，故盐析时除非酶不耐热，一般不需要降低温度。

如酶蛋白不耐热，一般需冷却至30℃盐析。

同一中性盐溶液对不同的酶或蛋白质的溶解能力是不同的，利用这一性质，在酶液中先后添加不同浓度的中性盐，就可以将其中所含的不同的酶或蛋白质分别盐析出来，这就是分步盐析法。

分步盐析是一种简单而有效的酶纯化技术，采用此法分离不同的酶或蛋白质，必须先通过实验求出液体中各种酶或蛋白质的浓度与盐析剂浓度有的关系。

盐析法的优点：不会使酶失活；沉淀中夹带的蛋白质种类杂质少；沉淀物在室温长时间放置不易失活，缺点是沉淀物中含有大量盐析剂。

盐析法常作为从液体中提取酶的初始分离手段。

用盐析法沉淀的沉淀颗粒相对密度较小，而母液的相对密度较大，故用离心分离法分离时分离速度慢。

（2）有机溶剂沉淀发有机溶剂蛋白质的机理目前还不十分清楚。

各种有机溶剂沉淀蛋白质的能力因蛋白质种类而异。

乙醇沉淀蛋白质的能力虽不是最强，但因挥发损失相对较少，价格也较便宜，所有工业上常以作为沉淀剂。

有机溶剂沉淀蛋白质的能力受溶解盐类、温度和PH值等因素的影响。

分部有机溶剂沉淀法也可以用来分离酶和蛋白质，但其效果不如分部盐析法好。

按照食品工业用酶的国际法规，食品用酶制剂中允许存在蛋白质类与多糖类杂质及其他酶，但不允许混入多量水溶性无机盐类（食盐等例外），所以有机溶剂沉淀法的好处是不会引入水溶性无机盐等杂质，而引入的有机溶剂最后在酶制剂干燥过程中会挥发掉。

由于具有此种特点，此法在食品级酶制剂提取中占有极重要的地位。

酶的提取、分离、纯化及其活力测定一、实验目的酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。

为要研究酶首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。

在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。

二、实验原理（一）酶的提取1.酶的存在位置？存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。

2.如何将酶从细胞中分离？从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。

此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。

如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。

其次，细胞中存在抑制物质，如酚，酸，离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。

酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如—SH，—NH2，通过1，4—加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。

因此如果没有特殊需要，一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。

第三章酶的提取与分离纯化第三章酶的提取与分离纯化第三章酶的提取与分离纯化◆酶的提取与分离纯化是指将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所要求的酶制品的过程。

◆主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，浓缩，干燥、结晶等。

1.细胞破碎细胞破碎方法可以分为机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法和酶促破碎法等,如表3-1所示。

表1细胞破碎方法及其原理1.1 机械破碎法通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。

常用的破碎机械有组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。

机械破碎法分为3种:捣碎法，研磨法和匀浆法。

1.2物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。

物理破碎法多用于微生物细胞的破碎。

常用的物理破碎法方法有温度差破碎法、压力差破碎法、超声波破碎法等，现简介如下：(1)温度差破碎法：利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。

(2)压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。

常用的有高压冲击法、突然降压法、及渗透压变化法等。

(3)超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的声波或超声波的作用，使细胞膜产生空穴作用（ cavitation）而使细胞破碎的方法称为超声波破碎法。

1.3化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法称为化学破碎法。

常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂，和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等表面活性剂。

有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。

表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。

1.4酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎的方法称为酶促破碎法，或称为酶学破碎法。

酶提取的主要方法和注意事项
酶提取的主要方法：
1. 食物酶提取：将食物酶从植物或动物中提取出来，常用的方法有超声波处理、磨碎、离心、过滤和吸附等。

2. 微生物酶提取：将微生物酶从土壤中提取出来，常用的方法有振荡培养、深桶培养、喷雾培养等。

3. 动物酶提取：将动物酶从动物组织中提取出来，常用的方法有超声波处理、磨碎、离心、过滤和吸附等。

酶提取的注意事项：
1. 样品准备：在提取酶之前，应准备好样品，并将它们放在干燥处储存。

2. 酶稳定性：应确保酶的稳定性，以避免提取过程中的损失。

3. 防止污染：在提取酶的过程中，应防止其它酶的污染。

4. 避免高温：在提取酶的过程中，应避免高温，以避免酶的失活。

5. 储存酶：提取出来的酶应放在干燥处储存，并尽量避免接触空气，以避免酶的失活。

6. 确定活性：在提取酶之前，应先确定酶的活性，以便选择合适的提取方法。

简述酶提取的过程及其原理酶提取是一种将酶分离、纯化和富集的方法。

它是一项关键的生物技术，广泛应用于医学、食品工业、生物工程和农业生产等领域。

酶提取的过程涉及样品的处理、细胞破碎、分离纯化和稳定等步骤，并且其原理基于酶在化学环境中的特性和提取技术。

酶提取的过程主要包括以下几个步骤：1. 样品的处理：在进行酶提取之前，需要对样品进行必要的处理。

这可能包括去除杂质、脂肪、蛋白质以及其他可能影响酶纯化的成分。

此外，在酶提取之前，还需要对样品进行预处理，如搅拌、离心、过滤等，以达到更好的分离和纯化效果。

2. 细胞破碎：将细胞破碎是酶提取的关键步骤之一。

细胞破碎的目的是释放酶并将其分离出来。

常见的破碎方法有物理破碎、化学破碎和酶解破碎等。

物理破碎主要依靠高压机械力、超声波或高压抗冻聚能技术等。

化学破碎可以使用酸、碱或酶等化学物质来破坏细胞膜结构。

酶解破碎则利用酶的特性来破坏细胞膜。

3. 分离纯化：分离纯化是酶提取的重要步骤之一，目的是从复杂的混合物中高效地分离目标酶。

常见的分离技术有沉淀、过滤、离心、柱层析等。

其中，柱层析是一种常用且有效的方法，根据酶的特性和物理化学性质，通过选择性吸附和洗脱的方法实现酶的纯化。

柱层析常用的分离材料有凝胶过滤、离子交换、亲和层析和凝胶过滤等。

4. 稳定性评估：提取酶之后，需要对酶的稳定性进行评估。

酶在提取过程中常常会受到温度、pH、离子浓度和蛋白质浓度等环境因素的影响，从而导致酶的活性损失或失活。

稳定性评估试验可以通过测定酶的活性来评估其在不同条件下的稳定性，并找出最适宜的储存和使用条件。

酶提取过程的原理主要基于酶分子的特性和物理化学性质，如分子量、电荷、亲和性等。

不同的酶在提取过程中会因其特性的不同而选择不同的提取方法。

下面是几个常见的酶提取原理：1. 溶液条件：酶在某一特定条件下，如适宜的pH、离子浓度、温度等，具有较高的活性和稳定性。

通过调整溶液条件，可以提高酶的活性和稳定性，从而更好地提取酶。