酶的提取

酶的分离提纯实验原理酶的分离提纯是指从复杂的混合物中获得纯净的酶样品的过程。

此过程旨在去除其他杂质，并提高酶的比活性和纯度。

酶的分离提纯实验原理可以分为以下几个方面：1. 根据酶的生理特性进行分离：酶的分离可依据酶对pH值、温度、离子浓度、底物特异性等因素的敏感性进行。

常用分离方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、电泳等。

2. 分离的物理性质利用：酶可根据其分子大小、电荷、溶解度等物理性质进行分离。

例如，凝胶过滤层析通过选用合适的孔径筛选凝胶，使大分子酶无法进入凝胶孔隙，进而实现分离。

3. 分离的化学性质利用：酶可通过与其他物质的特异性相互作用来实现分离。

亲和层析是一种常用的方法，利用酶与某些配体（如某种金属离子、亲合剂等）的特异性结合来分离酶。

在实验中，通常采用以下步骤进行酶的分离提纯：1. 细胞破碎：从生物体中获得酶源，如细胞、组织、分泌物等。

通常使用超声波破碎、搅拌破碎、离心等方法破碎细胞，并保持样品低温以防止酶的失活。

2. 酶提取：将破碎的细胞溶液用适当的缓冲液进行提取，并添加必要的辅助物质（如阻聚剂、金属离子等）以保持酶的稳定和活性。

3. 初步分离：通常先进行粗提，包括沉淀、超滤、离心、酒精沉淀等方法，目的是将酶与其他细胞组分分离开来。

4. 层析：根据酶的物理性质或化学性质选择适当的层析方法。

离子交换层析是常用的方法之一，根据酶与离子交换基质之间的相互作用进行分离。

5. 亲和层析：利用酶与特定配体之间的结合进行分离。

例如，选择性地将酶与亲和基质（如亲和剂或金属离子）结合，然后利用特定条件（如改变pH值或添加竞争性配体）来解离酶。

6. 离心和浓缩：通过离心和浓缩等操作，将目标酶进一步分离和提纯。

7. 再结晶：通过结晶或沉淀等方法进行酶的最终纯化。

8. 活性测定和纯度检验：测定酶的比活性，评估酶的纯度和活性。

总之，酶的分离提纯实验原理基于酶对物理、化学条件的敏感性，通过适当的分离方法和步骤，去除杂质，提高酶的纯度和比活性。

一、实验目的1. 了解酶提取的基本原理和方法。

2. 掌握酶提取过程中的操作技巧。

3. 学习酶活性检测的方法。

二、实验原理酶是一种生物催化剂，具有高度的专一性和活性。

酶提取实验的目的是从生物材料中提取酶，并对其进行纯化和活性检测。

酶提取的基本原理是利用生物材料中的酶具有特异性的结合位点，通过合适的溶剂、温度、pH等条件，使酶从生物材料中释放出来。

三、实验材料1. 生物材料：新鲜菠菜、酵母粉、淀粉酶等。

2. 试剂：Tris-HCl缓冲液、SDS、DTT、EDTA、蛋白酶抑制剂等。

3. 仪器：高速冷冻离心机、低温冰箱、水浴锅、电子天平等。

四、实验步骤1. 酶提取（1）取适量新鲜菠菜，用剪刀剪碎，加入适量Tris-HCl缓冲液（pH 7.0），搅拌均匀。

（2）将混合物放入高速冷冻离心机，以4℃、12,000 rpm离心10分钟，取上清液。

（3）加入适量SDS、DTT、EDTA和蛋白酶抑制剂，混匀。

（4）将混合物置于低温冰箱中保存。

2. 酶活性检测（1）取适量酶提取液，加入适量底物，混匀。

（2）将混合物置于水浴锅中，在特定温度下反应一定时间。

（3）终止反应，加入适量显色剂，混匀。

（4）在特定波长下测定吸光度值，计算酶活性。

五、实验结果与分析1. 酶提取结果通过离心分离，成功提取了菠菜中的酶。

酶提取液在低温冰箱中保存，待后续实验使用。

2. 酶活性检测结果通过酶活性检测，得到了酶提取液的活性值。

根据实验数据，计算出酶的活性单位。

六、实验讨论1. 酶提取过程中，选择合适的溶剂、温度、pH等条件对酶的提取效果至关重要。

在本实验中，我们选择了Tris-HCl缓冲液作为溶剂，pH 7.0为酶提取的最佳pH 值。

2. 酶提取过程中，添加SDS、DTT、EDTA和蛋白酶抑制剂等试剂，可以保护酶的活性，防止酶在提取过程中被破坏。

3. 酶活性检测是评价酶提取效果的重要指标。

在本实验中，我们通过测定酶活性单位，对酶提取效果进行了评价。

酶的提取方法
酶的提取方法有多种，以下是一些常用的方法：
1. 机械法：如绞碎、刨碎、匀浆、研磨、挤压或超声波等。

研磨时还可加入细砂、石英粉、氧化铝等以利细胞破碎。

2. 化学法：用盐、碱、表面活性剂、EDTA、丙酮和正丁醇等可使细胞破碎、颗粒体结构解体，从而把酶释放出来。

例如常将胰脏用数倍量丙酮处理2～
3次，制成丙酮粉供多种酶的提取用；用胆酸盐处理膜结构上的脂蛋白和“结酶”，使两者形成复合物，并带上静电荷，由于电荷之间的排斥作用，使膜破裂，达到溶解。

3. 酶解法：用组织自溶或用溶菌酶、脱氧核糖核酸酶、磷脂酶等降解细胞膜结构，然后再进行提取。

但应知道组织自溶法对某些酶的提取是不利的，如胰蛋白是以酶原形式纯化后再激活成胰蛋白酶的，若用自溶法提取，酶原已转成酶，纯化就很困难。

4. 冻融法：采用反复冷冻与融化时由于细胞中形成了冰晶及剩余液体中盐浓度的增高可以使细胞破裂。

5. 过滤：可加硅藻土、纸浆等为助滤剂。

6. 搅拌：加速提取，但转速不宜太快，否则会产生泡沫而难以过滤或使酶变性。

7. 提取溶剂：可以用水、一定浓度的乙醇、乙二醇、丁醇和稀盐溶液、缓冲溶液等；也可以用稀碱或稀酸溶液，如用稀硫酸提取胰蛋白酶，用稀盐酸提取胃蛋白酶。

请注意，这些方法可能对不同的酶类效果不同，因此在实际操作中应根据实际情况选择合适的方法。

酶的主要提取方法及其优缺点生物工程09-1班杨桠楠0901*******1、有机溶剂沉淀是利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的。

优点：1）分辨率比盐析法高2）沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。

2）对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。

沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。

2、等电点沉淀是利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的优点：1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化缺点：1）酸化时，容易引起蛋白质失活3、有机聚合物沉淀法(复合沉淀法)是在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的。

优点：1）操作条件温和，不易引起生物大分子变性。

2）沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。

3）沉淀后有机聚合物容易去除。

4、盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离常用的盐析剂: 硫酸铵优点：1）盐析能力强。

2）在水中溶解度最大（25℃时为4.1mol/L）。

而温度系数最小（对温度不敏感）。

3）价格便宜。

浓度高时也不会引起蛋白质和酶生物活性的丧失，抽提效果好。

缺点：1）缓冲能力差2）NH4＋的存在干扰蛋白质的测定3）得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。

5、双水相萃取技术是用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。

由于形成的两相均有很高的含水量（达70%〜90%），故称“双水相”系统。

四、酶的提取技术1、酶提取的方法（1）盐析法盐析常用的中性盐有Mgso4、（NH4)2SO4和NaH2SO4和NaH2SO4,其盐析蛋白酶的能力因蛋白酶种类而不同，一般以含有阴离子的中性盐盐析效果较好。

但是由于（NH4)2SO4的溶解度在低温也相当高，故在生产上普遍应用（NH4)2SO4。

一般使各种酶盐析的剂量通过实验来确定。

以中性盐盐析蛋白酶时，酶蛋白溶液的PH值对盐析的影响不大。

在高盐溶液中，温度高时酶蛋白的溶解度低，故盐析时除非酶不耐热，一般不需要降低温度。

如酶蛋白不耐热，一般需冷却至30℃盐析。

同一中性盐溶液对不同的酶或蛋白质的溶解能力是不同的，利用这一性质，在酶液中先后添加不同浓度的中性盐，就可以将其中所含的不同的酶或蛋白质分别盐析出来，这就是分步盐析法。

分步盐析是一种简单而有效的酶纯化技术，采用此法分离不同的酶或蛋白质，必须先通过实验求出液体中各种酶或蛋白质的浓度与盐析剂浓度有的关系。

盐析法的优点：不会使酶失活；沉淀中夹带的蛋白质种类杂质少；沉淀物在室温长时间放置不易失活，缺点是沉淀物中含有大量盐析剂。

盐析法常作为从液体中提取酶的初始分离手段。

用盐析法沉淀的沉淀颗粒相对密度较小，而母液的相对密度较大，故用离心分离法分离时分离速度慢。

（2）有机溶剂沉淀发有机溶剂蛋白质的机理目前还不十分清楚。

各种有机溶剂沉淀蛋白质的能力因蛋白质种类而异。

乙醇沉淀蛋白质的能力虽不是最强，但因挥发损失相对较少，价格也较便宜，所有工业上常以作为沉淀剂。

有机溶剂沉淀蛋白质的能力受溶解盐类、温度和PH值等因素的影响。

分部有机溶剂沉淀法也可以用来分离酶和蛋白质，但其效果不如分部盐析法好。

按照食品工业用酶的国际法规，食品用酶制剂中允许存在蛋白质类与多糖类杂质及其他酶，但不允许混入多量水溶性无机盐类（食盐等例外），所以有机溶剂沉淀法的好处是不会引入水溶性无机盐等杂质，而引入的有机溶剂最后在酶制剂干燥过程中会挥发掉。

由于具有此种特点，此法在食品级酶制剂提取中占有极重要的地位。