薄层色谱与柱层析共48页
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实验六：薄层层析与柱层析
实验六薄层层析与柱层析实验目的1. 了解偶氮苯的光学异构反应，加深对光化学反应的理解。
2. 掌握薄层层析的基本操作，薄层层析分离顺、反式偶氮苯。
3. 了解柱层析分离有机化合物的原理，初步掌握层析柱装填和洗脱的操作方法4. 采用柱层析分离反式偶氮苯与靛红的混合物实验原理偶氮苯是最简单的芳香偶氮化合物，众多偶氮染料的母体结构。
含有两个苯基分别与偶氮基-N=N~两端相连的结构。
偶氮苯有毒，易燃。
偶氮苯有顺（Z） -反（巳-异构体。
反式为橙红色棱形晶体，蒸气为深红色，溶于乙醇、乙醚、醋酸和水。
反式的热力学性质稳定。
当溶于乙醇的偶氮苯用一定强度的紫外光照射时，顺式的比例逐渐增大，直至达到平衡，形成顺反异构体的混合物。
偶氮苯的光致异构是很多偶氮类功能材料光响应的基础。
顺式为橙红色片状晶体，不稳定，在加热或可见光照射下能够变成反式。
色谱方法是通过在固定相和流动相间分配的不同而将物质分离开。
待分离混合物各组分在固定相上的吸附强度不同，与流动相一起移动的速度也不同，因此被分离开。
剂在毛细管作用下能够沿着色谱板向上移动。
由于混合物中各组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，当展开剂（流动相）流经吸附剂时发生无数次吸附解附过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前移动，吸附力强的组分滞留在后，由于薄层色谱属于固-液吸附色谱。
薄层色谱板中的固定相中的微孔结构使得溶各组分具有不同的移动速度，最终在固定相薄层析上分离。
TLC除了用于分离外，还可以通过与已知结构的的化合物比对，鉴定少量有机混合物的组成，它也是柱色谱寻求最佳展开剂的手段。
上图中红色化合物的R f等于竖直红线的长度除以竖直蓝线的长度。
柱层析也属于固-液吸附色谱。
在一根玻璃“分离柱”中进行。
管中装上适当的粉末作为国定相。
待分离或纯化物质的溶液（流动相）在重力作用下流经吸附剂时，不同物质对溶剂和吸附剂的亲和力不同，因而被吸附的程度不同，从而以不同速度流动，使化合物得以分离。
薄层色谱和柱色谱（可编辑）
薄层色谱和柱色谱薄层色谱和柱色谱色谱法是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法,有着极其广泛的用途。
色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能即分配的不同,或其它亲和作用性能的差异,使混合物的溶液流经该物质时进行反复的吸附或分配等作用,从而将各组分分开。
流动的混合物溶液称为流动相;固定的物质称为固定相可以是固体或液体。
根据组分在固定相中的作用原理不同,可分为吸附色谱、分配色谱等。
吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相;分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂,以吸收较大量的液体作固定相,而支持剂本身不起分离作用。
根据操作条件不同,可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。
一、薄层色谱薄层色谱Thin Layer Chromatography, TLC属于固-液吸附色谱,是一种微量的分离分析方法,具有设备简单、速度快、分离效果好、灵敏度高以及能使用腐蚀性显色剂等优点。
适用于小量样品几到几十微克,甚至0.01μg的分离。
同时薄层色谱是一种非常有用的跟踪反应的手段,在进行化学反应时,常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。
也常用作柱色谱的先导,可用于柱色谱分离中展开剂的选择,也可监视柱色谱分离状况和效果。
最常用的薄层色谱属于液-固吸附色谱,把吸附剂如氧化铝、硅胶和粘合剂如煅石膏CaSO4?H2O、羧甲基纤维素钠等均匀地铺在一块玻璃板上形成薄层,将分离样品滴加在薄层的一端,当利用毛细作用使流动相沿着吸附剂薄层固定相移动时,吸附剂借各种分子间力包括范德华力和氢键作用于混合物中各组分,各组分以不同的作用强度被吸附。
被分离组分在固定相与流动相之间进行分配或吸附,经过反复无数次的分配平衡或吸附平衡,不同组分的极性化合物就会在薄层板上移动不同的距离。
极性强的化合物会“粘”在极性的吸附剂上,在薄板上移动的距离比较短。
而非极性的物质在薄层板上移动较大的距离。
化合物移动的距离大小用Rf值表达,是介于01之间的数值,它的定义为:如图1所示,d为点样点到溶剂前沿的距离,d1为点样点到斑点1的距离,d2为点样点到斑点2的距离。
薄层层析与柱层析
薄层层析
薄层层析的步骤：
点板 TLC的展开 选择展开溶剂 显示
Rf =B/A
薄层层析在有机化学中的应用
•证实两个化合物相等 •测定混合物中组分的数目 •决定适用于柱层析分离用的溶剂 •监控柱层析分离 •检查通过柱层析、结晶或萃取所达到的分 离效果 •监控一个反应的进程
各类化合物的极性
饱和烃
烯烃ห้องสมุดไป่ตู้
芳烃，卤代
物
极
硫化物
性 加
醚类
大
硝基化合物
醛、酮、酯
醇、胺
亚砜
酰胺
石油醚 环己烷 四氯化碳 苯 CH2Cl2 CHCl3 Ether Eactheytal te 吡啶 丙酮 乙醇 甲醇 水 乙酸
常用洗脱溶剂
极 性 加 大
显示法
碘 （除了饱和烃和卤代烃外） 紫外灯 硝酸银稀溶液（卤代烃） 硫酸 2，4-二硝基苯肼（醛和酮） 三氧化铬、重铬酸钾和高锰酸钾（易氧化） 对二甲氨基苯甲醛（胺类） 茚三酮（氨基酸）
薄层层析的步骤：
点板 TLC的展开 选择展开溶剂 显示
Rf =B/A
薄层层析在有机化学中的应用
•证实两个化合物相等 •测定混合物中组分的数目 •决定适用于柱层析分离用的溶剂 •监控柱层析分离 •检查通过柱层析、结晶或萃取所达到的分 离效果 •监控一个反应的进程
各类化合物的极性
饱和烃
烯烃ห้องสมุดไป่ตู้
芳烃，卤代
物
极
硫化物
性 加
醚类
大
硝基化合物
醛、酮、酯
醇、胺
亚砜
酰胺
石油醚 环己烷 四氯化碳 苯 CH2Cl2 CHCl3 Ether Eactheytal te 吡啶 丙酮 乙醇 甲醇 水 乙酸
常用洗脱溶剂
极 性 加 大
显示法
碘 （除了饱和烃和卤代烃外） 紫外灯 硝酸银稀溶液（卤代烃） 硫酸 2，4-二硝基苯肼（醛和酮） 三氧化铬、重铬酸钾和高锰酸钾（易氧化） 对二甲氨基苯甲醛（胺类） 茚三酮（氨基酸）
实验二十五、柱层析、薄层色谱
实验二十五、柱层析、薄层色谱一、实验目的1、了解色谱法分离提纯有机化合物的基本原理和应用。
2、掌握柱层析、薄层层析的操作技术。
二、实验原理色谱法（Chromatography ）亦称色层法、层析法等。
色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。
色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。
色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几方面:1、分离混合物 一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学方法分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。
2、精制提纯化合物 有机化合物中含有少量结构类似的杂质，不易除去，可利用色谱法分离以除去杂质，得到纯品。
3、鉴定化合物 在条件完全一致的情况，纯碎的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移 动距离，称比移值（Rf 值），所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。
但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。
所以，要获得重现的比移值就比较困难。
为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。
距离溶剂前沿至原点中心的点中心的距离溶质最高浓度中心至原=f R4、观察一些化学反应是否完成，可以利用薄层色谱或纸色谱观察原料色点的逐步消失，以证明反应完成与否。
吸附色谱主要是以氧化铝、硅胶等为吸附剂，将一些物质自溶液中吸附到它的表面上，而后用溶剂洗脱或展开，利用不同化合物受到吸附剂的不同吸附作用，和它们在溶剂中不同的溶解度，也就是利用不同化合物在吸附剂上和溶液之间分布情况的不同而得到分离。
吸附色谱分离可采用柱色谱和薄层色谱两种方式。
柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两种。
吸附色谱常用氧化铝和硅胶为吸附剂。
分配色谱以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收较大量的液体作为固定相。
柱 层 析、薄 层 层 析
柱色谱、薄层色谱一、实验目的1、了解色谱法分离提纯有机化合物的基本原理和应用。
2、掌握柱层析、薄层层析的操作技术。
二、实验原理色谱法（Chromatography）亦称色层法、层析法等。
色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。
色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同，或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使各组分分离。
色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几方面:1、分离混合物一些结构类似、理化性质也相似的化合物组成的混合物，一般应用化学方法分离很困难，但应用色谱法分离，有时可得到满意的结果。
2、精制提纯化合物有机化合物中含有少量结构类似的杂质，不易除去，可利用色谱法分离以除去杂质，得到纯品。
3、鉴定化合物在条件完全一致的情况，纯粹的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定的移动距离，称比移值（Rf值），所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一物质。
但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。
所以，要获得重现的比移值就比较困难。
为此，在测定某一试样时，最好用已知样品进行对照。
4、观察一些化学反应是否完成，可以利用薄层色谱或纸色谱观察原料色点的逐步消失，以证明反应完成与否。
吸附色谱主要是以氧化铝、硅胶等为吸附剂，将一些物质自溶液中吸附到它的表面上，而后用溶剂洗脱或展开，利用不同化合物受到吸附剂的不同吸附作用，和它们在溶剂中不同的溶解度，也就是利用不同化合物在吸附剂上和溶液之间分布情况的不同而得到分离。
吸附色谱分离可采用柱色谱和薄层色谱两种方式。
柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两种。
吸附色谱常用氧化铝和硅胶为吸附剂。
分配色谱以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收较大量的液体作为固定相。
柱色谱常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。
薄层层析、柱层析
⑵ 流动相选择 色谱分离使用的流动相又称展开剂 。 展开剂对于选定了固定相的色谱分离有重 要的影响。
在色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂 和展开剂之间发生吸附-溶解分配，强极性展 开剂对极性大的有机物溶解的多，弱极性或 非极性展开剂对极性小的有机物溶解的多， 随展开剂的流过不同极性的有机物以不同的 次序形成分离带。 在氧化铝柱中，选择适当极性的展开剂能使 各种有机物按先弱后强的极性顺序形成分离 带，流出色谱柱。
柱色谱装置图
【柱色谱操作步骤】
1、装柱 用镊子取少许脱脂棉放于干净的色谱柱底部， 轻轻塞紧，关闭活塞，通过一干燥的玻璃漏 斗向柱中慢慢加入色谱柱用中性氧化铝10g， 并用橡皮塞轻轻敲打色谱柱下部，使填装紧 密，在上面加一片小圆滤纸或脱脂棉使表面 水平。用滴管沿管壁加入酒精，使酒精顺柱 体向下展开，打开活塞，控制流出速度为1滴 /秒。
以上划分无严格界限有些名称相互交叉如亲和层析应属于一种特殊的吸附层析纸层析是一种分配层析柱层析可做各种层吸附色谱主要是以氧化铝硅胶等为吸附剂将一些物质自溶液中吸附到它的表面上而后用溶剂洗脱或展开利用不同化合物受到吸附剂的不同吸附作用和它们在溶剂中不同的溶解度也就是利用不同化合物在吸附剂上和溶液之间分布情况的不同而得到分离
⑶相对移动值 从点样原点开始到展开后的溶剂 前沿，是溶剂的移动距离，记为l0，混合物中各 组分的移动距离分别记为l1，l2，l3 …（移动值 示意图）。
在不同的展开条件下，各 化合物的移动距离不会相 同，而在同一条件下，相 对于展开剂的移动距离， 各化合物有可比较的展开 数据，称为相对移动值， 或比移值： Rf=l1/l0 在相同条件下测得的比移 值可以作为化合物的薄层 色谱特征值进行比较对照。
3.薄层色谱应用
薄层色谱和柱层析
12:25:49
2-薄层色谱中，组分的移动情况常用比移值Rf来表示：
Rf = 原点至组分点中心的距离/原点至流动相前沿的距离
也有用“高比移值”表示： hRf = Rf × 100 和“相对比移值”表示，即相对于某一物质X的Rf值，用 Rx表示： Rx= Rf/Rx （原点至组分点中心距离与原点至物质X点中心的距离的比值） Rf总小于1； Rx可小于1，也可大于1；hRf可在1～100之间
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（g）烧结板：由玻璃粉（作粘合剂）与硅胶或氧化铝等吸附 剂按一定比例混匀后，经高温烧结而成，该板可一此制备多 次使用。 吸附剂 粘合剂 配 比 烧结条件 硅胶 玻璃粉 1：2～5 470～770 ℃，7～10min 氧化铝 玻璃粉 1：1～4 470～870 ℃，7～10min 硅藻土 玻璃粉 1：1～6 470～770 ℃，7～10min （h）旋转薄层板：旋转薄层色谱由称离心薄层色谱，用于快 速分离、提纯、制备。
（ Ⅵ ）具有可逆的吸附性，既能吸附样品组分，又易于解析 （ Ⅶ ）为便于观察分离结果，吸附剂最好为白色。
常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺、硅酸镁、而 CaO 、 MgO、Ca(OH)2、Mg(OH)2、CaSO4、Ca3(PO4)2、Mg3(PO4)2、 淀粉、蔗糖等，或因碱性太大，或吸附性太弱，用途有限，活 性炭因吸附性太强和黑色，使应用受到限制。
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（3）薄层板类型
除上述正常的硅胶、氧化铝板外，还有一些板适用于化 合物的分离和检出：
（ a）荧光薄层板：吸附剂中加入荧光物质即得荧光板，可检 出一些本身无色、在紫外光下也不显荧光的化合物，荧光板 在紫外光照射下显荧光，而化合物斑点呈现暗点。
无机荧光物质有：在254nm紫外光下激发荧光，如锰激活 的硅酸锌（Zn2SiO4:Mn），在365nm紫外光激发荧光，如银 激活的硫化锌.硫化镉（ZnS2.CdS:Ag） 有机物有荧光素钠、桑色素 加入量为0.5～1.5%（吸附剂中）
2-薄层色谱中，组分的移动情况常用比移值Rf来表示：
Rf = 原点至组分点中心的距离/原点至流动相前沿的距离
也有用“高比移值”表示： hRf = Rf × 100 和“相对比移值”表示，即相对于某一物质X的Rf值，用 Rx表示： Rx= Rf/Rx （原点至组分点中心距离与原点至物质X点中心的距离的比值） Rf总小于1； Rx可小于1，也可大于1；hRf可在1～100之间
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（g）烧结板：由玻璃粉（作粘合剂）与硅胶或氧化铝等吸附 剂按一定比例混匀后，经高温烧结而成，该板可一此制备多 次使用。 吸附剂 粘合剂 配 比 烧结条件 硅胶 玻璃粉 1：2～5 470～770 ℃，7～10min 氧化铝 玻璃粉 1：1～4 470～870 ℃，7～10min 硅藻土 玻璃粉 1：1～6 470～770 ℃，7～10min （h）旋转薄层板：旋转薄层色谱由称离心薄层色谱，用于快 速分离、提纯、制备。
（ Ⅵ ）具有可逆的吸附性，既能吸附样品组分，又易于解析 （ Ⅶ ）为便于观察分离结果，吸附剂最好为白色。
常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺、硅酸镁、而 CaO 、 MgO、Ca(OH)2、Mg(OH)2、CaSO4、Ca3(PO4)2、Mg3(PO4)2、 淀粉、蔗糖等，或因碱性太大，或吸附性太弱，用途有限，活 性炭因吸附性太强和黑色，使应用受到限制。
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（3）薄层板类型
除上述正常的硅胶、氧化铝板外，还有一些板适用于化 合物的分离和检出：
（ a）荧光薄层板：吸附剂中加入荧光物质即得荧光板，可检 出一些本身无色、在紫外光下也不显荧光的化合物，荧光板 在紫外光照射下显荧光，而化合物斑点呈现暗点。
无机荧光物质有：在254nm紫外光下激发荧光，如锰激活 的硅酸锌（Zn2SiO4:Mn），在365nm紫外光激发荧光，如银 激活的硫化锌.硫化镉（ZnS2.CdS:Ag） 有机物有荧光素钠、桑色素 加入量为0.5～1.5%（吸附剂中）
柱层析法和薄层层析法简介
柱层析法和薄层层析法简介柱层析法1. 原理流动相流过时各组分会以不同的速率向下移动，吸附弱的组分以较快的速率向下移动。
随着流动相的移动，在新接触的固定相表面上又依这种吸附-溶解过程进行新的分配，新鲜流动相流过已趋平衡的固定相表面时也重复这一过程，结果是吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，吸附特别强的组分甚至会不随流动相移动，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现混合物的分离。
2. 柱色谱分离条件⑴固定相选择柱色谱使用的固定相材料又称吸附剂吸附剂对有机物的吸附作用有多种形式。
以氧化铝作为固定相时，非极性或弱极性有机物只有范德华力与固定相作用，吸附较弱；极性有机物同固定相之间可能有偶极力或氢键作用，有时还有成盐作用。
这些作用的强度依次为：成盐作用> 配位作用> 氢键作用> 偶极作用> 范德华力作用。
有机物的极性越强，在氧化铝上的吸附越强。
常用吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭等色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。
酸性氧化铝pH约为4-4.5，用于分离羧酸、氨基酸等酸性物质；中性氧化铝pH值为7.5，用于分离中性物质，应用最广；碱性氧化铝pH为9-10，用于分离生物碱、胺和其它碱性化合物等。
吸附剂的活性与其含水量有关。
含水量越低，活性越高。
脱水的中性氧化铝称为活性氧化铝。
硅胶是中性的吸附剂，可用于分离各种有机物，是应用最为广泛的固定相材料之一。
活性炭常用于分离极性较弱或非极性有机物。
吸附剂的粒度越小，比表面越大，分离效果越明显，但流动相流过越慢，有时会产生分离带的再重叠，适得其反。
⑵流动相选择色谱分离使用的流动相又称展开剂。
展开剂对于选定了固定相的色谱分离有重要的影响。
在色谱分离过程中混合物中各组分在吸附剂和展开剂之间发生吸附-溶解分配，强极性展开剂对极性大的有机物溶解的多，弱极性或非极性展开剂对极性小的有机物溶解的多，随展开剂的流过不同极性的有机物以不同的次序形成分离带。
薄层色谱与柱层析
叶绿素 叶绿素
叶黄素'， " 叶黄素
第三页，共50页。
色谱法的分类(fēn lèi)
1)根据流动相分类: 气相色谱—以气体作流动相 液相色谱—以液体作流动相 超临界色谱—流动相是在接近它的临界温度
和压力下工作(gōngzuò)的液体 2)根据固定相的附着方式分类 —固定相装在圆柱管中—柱色谱 —固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄层色谱 —液体固定相涂在纸上—纸色谱
反相分配色谱：以亲脂性有机溶剂作固定(gùdìng)（液 ）相，以水或亲水性溶剂作移动相的分配色谱称为 反相分配色谱。当分离脂溶性或极性较小的成分， 如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等物质时，常用反 相分配色谱。实践中有70%以上的分配色谱都采用 反相色谱。
第二十九页，共50页。
分配柱色谱的应用 分配柱色谱往往适用于分离水溶性或极性较大的组分，如生物
。
第九页，共50页。
Rf值测量(cèliáng)示意图
Rf与组分性质 (xìngzhì)、流动相 及溶解度有关 极性组分→易保留 ，Rf 小 非极性组分→易流 出, Rf大
第十页，共50页。
薄层固定相
按照固定相的种类，薄层板可分为正相薄层板（如 硅胶薄层板、聚酰胺薄层板）、反相薄层板（如 C18键合相薄层板）等。
） Rf值＋斑点颜色特征（原位化学反应） 多种展开剂体系展开进行验证 与其他技术联用
第二十三页，共50页。
展 开 (z hǎ n kā i) 后 的 薄 层 板
第二十四页，共50页。
（二）定 量
目视比较法
将不同量的标准品作为系列，同样样品分 别点在同一薄层上展开，显色后，目测比较斑点颜色的 深浅和面积大小，求出未知物含量的近似值，作为半定 量法，精密度为±10%。
薄层层析和低压柱色谱技术
作用：主要用于快速检测目标样品的分 离效果；其次用于样品分离，一方面适 用于少量样品（几到几微克）的分离； 另一方面在制作薄层板时，把吸附层加 厚加大将样品点成一条线，则可分离多 达500mg的样品。
2、制板
1）准备干净的玻璃板：无油和水 2）按硅胶(g)：0.5%-0.7%CMC-Na溶液 （mL）=1：3比例混合，同方向搅拌 至无气泡 3）涂板 4）晾干两天左右备用
4、TLC展开剂选择
选择适当的展开剂是首要任务.一般常用 溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概 为：石油醚<己烷<苯<乙醚<二氯甲烷< 氯仿<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇<水
使用单一溶剂一般不能达到很好的分离效 果，往往使用混合溶剂，通常使用一个高 极性和低级性溶剂搭配，高极性的溶剂还 有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有： 石油醚/乙酸乙酯，石油醚/丙酮，石油醚/ 乙醚，石油醚/二氯甲烷，氯仿/乙酸乙酯， 氯仿/甲醇，乙酸乙酯/甲醇
1.3、洗脱剂比例的选择
1、梯度洗脱，一般从小极性溶剂开始， 冲10个柱体积或冲至洗脱下才物质种类 和浓度不在改变时，换下一个梯度。 2 、 分 离 纯 化 样 品 时 ， 样 品 TLC 的 Rf=0.05-0.1时的展开剂比例可以用做柱 层析。
2、凝胶柱层析
原理 凝胶过滤--依赖于分子的大小和形状 吸附层析--依赖于被分离化合物与凝胶之 间的氢键数量和质量 分配层析--依赖于被分离化合物在流动相 （溶剂）和固定相（凝胶）之间的分配， 这主要由样品的极性和溶剂的极性决定 的。
1）洗板
2）搅拌
3）涂板
4）晾干
3、薄层板的使用
1）用于检测：将样品溶液用管口平整的 毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的 起点线上，间隔0.5-1cm，凉干或吹干后 置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸 入深度为0.5cm。待展开剂前沿离顶端约 1cm附近时，将色谱板取出，干燥后喷 以显色剂，或在紫外灯下观察。
薄层色谱和柱层析
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缺点
柱层析法的缺点包括样品损失、洗脱峰易受干扰、操作参数难以控制等。此外， 对于某些特定组分的分离，柱层析法可能需要较长的分离时间和较多的样品量。
03
薄层色谱与柱层析的比 较
分离原理的比较
薄层色谱（TLC）
基于吸附剂对不同成分的吸附能力差异进行分离。
柱层析
基于固定相和流动相之间的分配平衡进行分离。
新型固定相
固定相是薄层色谱和柱层析中的重要组成部 分，用于吸附样品中的组分。研究者正在开 发新型固定相，以提高分离效率和特异性。 例如，一些新型固定相可以通过改变表面化 学性质、孔径和形貌等方式来提高分离性能
。
新技术的开发
微流控芯片技术
微流控芯片技术是一种新型的分离分析技术，具有高通量、高分辨率和高灵敏度等优点。 该技术可以将薄层色谱和柱层析集成在一个芯片上，实现快速、高效的分离分析。目前，
结果分析
分析实验结果，比较不同实验条件下的分离效果， 总结实验规律和改进措施。
05
薄层色谱和柱层析的发 展趋势
新材料的应用
硅胶替代品
硅胶是常用的薄层色谱和柱层析材料，但存 在一些限制，如硅胶粒径分布广、吸附能力 不稳定等。因此，研究者正在寻找硅胶的替 代品，如氧化铝、活性炭、聚合物等。这些 新材料具有更好的粒径控制、更稳定的吸附 性能和更高的分离效率。
实验操作步骤
洗脱
结果观察
选择合适的洗脱液进行洗脱，控制洗 脱速度和体积。
观察并记录样品在色谱柱上的分离情 况。
收集
根据需要将洗脱液收集到不同的容器 中。
实验结果分析
数据记录
详细记录实验数据，包括标准品和样品的分离情 况、洗脱液的体积和成分等。
柱色谱和薄层色谱分离技术
样品的收集
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸 附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可 以采用氧化铝作固定相。另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果 用大试管，可能一根就收到了三个样品， 如果都用小试管那工作量又太大。
减压柱层析在进行溶剂洗脱时是将溶剂在真空下全部抽出,使固定相“干”后才加入新的 洗脱剂作下一组分的收集.其原理相当于薄层层析的多次展开,它的分离效果可与薄层层析 媲美。
加压实例就不一一详举了，下面几个是最好。柱子长了，相应的塔板数就高。 柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较 薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样 品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶 剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易 得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂 了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保 的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。现在见到的柱 子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具 体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所 需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用 小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不 到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的， 也可以减小淋洗剂的极性等等。
薄层色谱（TCL） 柱色谱
TLC的作用 •跟踪反应进程 •为柱层析选择适当的淋洗剂
a/l或b/l
=0.2~0.3
选择适当的展开剂是首要任务.。一般常用溶剂按照极性 从小到大的顺序排列大概石油迷<己烷<苯<乙醚 <THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用单一溶剂，往 往不能达到很好的分离效果，往往使用混合溶剂通常使 用一个高极性和低级性溶剂组成的混合溶剂，高极性的 溶剂还有增加区分度的作用，常用的溶剂组合有： Petroleum ether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Ac etone, Petroleum ether/Ether, Petroleum ether/CH 2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ ethyl acetate
薄层层析、柱层析
1.原理：
吸附剂被涂布在玻璃板上，形成薄薄 的平面涂层。干燥后在涂层的一端点样， 放入一个盛有少量展开剂的的有盖容器中。 展开剂接触到吸附剂涂层，借毛细作用向 上移动。经过在吸附剂和展开剂之间的多 次吸附-溶解作用，将混合物中各组分分 离成孤立的样点，实现混合物的分离。
2.色谱条件
⑴固定相选择 柱色谱中提到的吸附剂都可以用作为薄 层色谱的固定相，分离性能及使用选择同柱 色谱的选择原则相同（各种吸附剂见柱色谱 表1）。 一般用于薄层色谱时，要求吸附剂的粒度 更小。商品吸附剂区分为色谱级（用于柱色 谱）和薄层色谱级（用于薄层色谱）。
2、进样 待酒精全部浸润氧化铝，液面刚好流至 滤纸面时，立即用滴管从层析柱管中心加入 待分离样品溶液，当此溶液流至接近滤纸面 时，立即用少量溶剂洗下管壁的有色物质， 如此连续2—3次，直至洗净为止。 3、洗脱 依次用酒精和NaOH洗脱，控制流出速度。 整个过程都应有洗脱剂覆盖吸附剂。（每一 种试剂加入前，前一种都要刚刚浸过滤纸片）
吸附色谱主要是以氧化铝、硅胶等为吸附剂， 将一些物质自溶液中吸附到它的表面上，而 后用溶剂洗脱或展开，利用不同化合物受到 吸附剂的不同吸附作用，和它们在溶剂中不 同的溶解度，也就是利用不同化合物在吸附 剂上和溶液之间分布情况的不同而得到分离。 吸附色谱分离可采用柱色谱和薄层色谱两种 方式。
1.原理
色谱法
（层析法）
一、实验目的
1、了解色谱法分离、提纯有机化合物的基本 原理和应用。 2、掌握柱层析、薄层层析的操作技术。
二、实验原理
色谱法（Chromatography）亦称色层法、 层析法等。 色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重 要方法之一。 色谱法的基本原理是利用混合物各组分在某 一物质中的吸附或溶解性能（分配）的不同， 或其亲和性的差异，使混合物的溶液流经该 种物质进行反复的吸附或分配作用，从而使 各组分分离。
薄层色谱和柱层析综述
聚酰胺
硅酸镁 多孔玻璃珠
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纤维素硅藻土
离子交换剂 反相键合硅胶（硅烷化处理）
5-薄层板的制备
将吸附剂均匀地涂铺在规定尺寸的玻璃板或其它平面板上， 这一过程称铺板或铺层，即制成薄层板。 板的好坏是分离成功与否的关键，好的板要求吸附剂涂铺 均匀，表面光滑，厚度一致。现有预制板出售。 制板方法主要有干法和湿法两种： （1）干法制板 氧化铝和硅胶可用干法铺板，干法铺层比较简便，制得的 板展开速度快，但展开后不能保存，薄层不牢固，喷显色剂时 易吹散。 方法：将吸附剂均匀地撒在薄层板上，两手用两端圈套的 玻璃棒滚动，厚度0.25～3mm，滚动不宜太快，不能停。 0.25mm左右主要是分析和分离用，3mm的厚板主要是制备色 谱用。
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将溶剂抽提中的一个相固定在硅胶上，装在柱内，并按色 谱法操作，使另一液相流过柱子，分离获得成功。从此出现了 基于分配原理的分配色谱法，因此获得了诺贝尔奖。以后的发 展采用了纤维素、继而采用滤纸作分配色谱载体，发展了纸色 谱法。薄层色谱法的研究和发展也出现在二十世纪的三、四十 年代，现在已和气、液色谱一起成为最常用的色谱分离、分析 方法。为与柱色谱相区别，并突出纸色谱和薄层色谱的特点， 这两种方法也叫平床色谱法（Flat bed chromatography）或平 面色谱法（Planar chromatography）。 色谱法经过多年的发展已有多种操作形式，其分类方法 也有多种。按固定相和流动相的物态可分为以气体为流动相的 气相色谱（包括气固色谱、气液色谱）和以液体为流动相的液 相色谱（包括液固色谱、液-液色谱）；如以固定相的操作方 式以及形状分类则有柱色谱、 纸色谱、薄层色谱；
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薄层色谱中，Rf值与组分的分配系数K值有关：
实验六：薄层层析与柱层析
实验六薄层层析与柱层析实验目的1.了解偶氮苯的光学异构反应，加深对光化学反应的理解。
2.掌握薄层层析的基本操作,薄层层析分离顺、反式偶氮苯。
3.了解柱层析分离有机化合物的原理，初步掌握层析柱装填和洗脱的操作方法4.采用柱层析分离反式偶氮苯与靛红的混合物实验原理偶氮苯是最简单的芳香偶氮化合物，众多偶氮染料的母体结构。
含有两个苯基分别与偶氮基–N=N–两端相连的结构。
偶氮苯有毒，易燃。
偶氮苯有顺（Z）-反（E）-异构体。
反式为橙红色棱形晶体，蒸气为深红色，溶于乙醇、乙醚、醋酸和水。
反式的热力学性质稳定。
当溶于乙醇的偶氮苯用一定强度的紫外光照射时，顺式的比例逐渐增大，直至达到平衡，形成顺反异构体的混合物。
偶氮苯的光致异构是很多偶氮类功能材料光响应的基础。
顺式为橙红色片状晶体，不稳定，在加热或可见光照射下能够变成反式。
色谱方法是通过在固定相和流动相间分配的不同而将物质分离开。
待分离混合物各组分在固定相上的吸附强度不同，与流动相一起移动的速度也不同，因此被分离开。
薄层色谱属于固-液吸附色谱。
薄层色谱板中的固定相中的微孔结构使得溶剂在毛细管作用下能够沿着色谱板向上移动。
由于混合物中各组分对吸附剂（固定相）的吸附能力不同，当展开剂（流动相）流经吸附剂时发生无数次吸附解附过程，吸附力弱的组分随流动相迅速向前移动，吸附力强的组分滞留在后，由于各组分具有不同的移动速度，最终在固定相薄层析上分离。
TLC除了用于分离外，还可以通过与已知结构的的化合物比对，鉴定少量有机混合物的组成，它也是柱色谱寻求最佳展开剂的手段。
上图中红色化合物的R f等于竖直红线的长度除以竖直蓝线的长度。
柱层析也属于固-液吸附色谱。
在一根玻璃“分离柱”中进行。
管中装上适当的粉末作为国定相。
待分离或纯化物质的溶液（流动相）在重力作用下流经吸附剂时，不同物质对溶剂和吸附剂的亲和力不同，因而被吸附的程度不同，从而以不同速度流动，使化合物得以分离。
靛红与偶氮苯在极性上具有较大差异，从而可以使用极性适中的展开剂，通过柱层析将二者分离。